增强酮古龙酸菌碳代谢水平提高产2-酮基-l-古龙酸能力的方法
【专利摘要】本发明通过对酮古龙酸菌（ Ketogulonogenium vulgarum ，小菌）代谢网络分析的研究结果，公开了一种在维生素C二步发酵法的混菌发酵过程中，通过添加更利于小菌利用的碳源（包括2碳单位如乙醇、乙醛及乙酸（盐）及6碳单位如D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖），从而增强小菌糖代谢效率，提高菌体数量，大幅度降低2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）发酵周期，提高生产效率的方法。在5L发酵罐中，可降低周期14.04%，提高收率3.40%。本发明的另一方面应用，是通过降低小菌将L-山梨糖作为碳源利用，亦提高了L-山梨糖转化为2-KGA的效率。该发明生产工艺先进，原料成本低，适于大规模工业化生产，是对我国将近四十年生物发酵法制备维生素C工艺的改造和提升。而且生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。
【专利说明】增强酮古龙酸菌碳代谢水平提高产2-酮基-L-古龙酸能力 的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，涉及一种通过对微生物碳源组成的选择与优化，使 酮古龙酸菌产2-KGA(2-酮基-L-古龙酸）能力提高的方法，以及改造维生素C发酵工艺。
【背景技术】：
[0002] 维生素C(VC)是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具 有广泛的生理作用，在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其 应用范围广阔，市场规模巨大。
[0003] 目前，全球90%以上的VC生产，均利用我国发明的"二步发酵法"。其第一步发酵 是在氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的 作用下将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸（2-KGA)。最后经过 化学转化使2-KGA生成VC。
[0004] "二步发酵法"的主要特点是在第二步发酵过程中，由于芽孢杆菌Bacillus sp.(俗称大菌）的伴生作用，酮古龙酸菌Ketogulonigeniumsp.(俗称小菌）的生长和 2-KGA的产率得到很大提高，但大菌没有任何产生2-KGA的能力，其主要作用是辅助小菌生 长。故小菌作为2-KGA产生菌，对其代谢能力的增强一直是学者们的研究热点。
[0005] 本发明前期通过对混菌培养种液培养基及发酵培养基营养成份的考察发现，其主 要碳源为L-山梨糖，L-山梨糖即作为碳源被小菌自身生长代谢所需，又作为合成2-KGA的 底物，而大菌则不能利用L-山梨糖作为碳源，主要是利用玉米浆中存在的少量碳源满足自 身生长所需。故在实际发酵过程中，一方面由于小菌直接利用底物L-山梨糖作为碳源，导 致产物2-KGA转化率降低，另一方面由于培养基中碳源种类单一，限制了菌体生长的数量 与代谢能力，故亦直接影响了产2-KGA的发酵速率。
[0006] 本发明分别是建立在对大小菌全基因组的测序与功能注释的基础上，通过对大小 菌糖代谢网络的分析，发现并验证了一批可以在混菌发酵过程中，被小菌很好利用并具有 促进菌体生长，提高发酵效率的廉价碳源，包括：二碳单位如乙醇、乙醛及乙酸（盐）及六碳 单位如D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖。
[0007] 本发明公开前，未见有将上述碳源应用在维生素C二步发酵混菌发酵的报道和专 利。
【发明内容】
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[0008] 本发明的目的在于利用廉价的除L-山梨糖外的小菌可利用的碳源，添加到常规 种液或发酵液中，用以提高2-KGA收率、降低发酵周期。
[0009] 实际上，本发明涉及一种通过对微生物碳源组成的选择与优化，使酮古龙酸菌产 2-KGA能力提高的方法以及工艺。
[0010] 进一步说，上述的碳源组成包括：二碳单位碳源、六碳单位碳源中的一种或几种， 具体地，所述的碳源包括乙醇、乙醛、乙酸（盐）、D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖中的一 种或几种。
[0011] 本发明还提供了用于制备种液的培养基及用于发酵的培养基，该培养基包括制备 种液及发酵液的常规培养基，其特征在于：培养基包括所述碳源中的至少一种物质，所述碳 源物质在培养基中出现的方式包括直接加入也包括以其它混合物形式加入。
[0012] 上述培养基中，所述各碳源物质加入量为0. 02%-2%。当添加量低于下限，对混 菌发酵促进作用不明显，当添加量高于上限时，或对菌体生长不利，或产2-KGA减少，或造 成原料的浪费。
[0013] 上述常规培养基一般来讲，既为目前VC二步发酵工业生产中使用的培养基，具体 由下列成份组成：
[0014] 1.常规种液培养基：1-3%L-山梨糖，0.3-1 %玉米浆，0.1-0. 5 %葡萄糖， 0· 05-0. 3%尿素，0· 1-0. 3%碳酸钙，pH6. 7-7. 0,121°C灭菌 20min。
[0015] 2.常规发酵培养基：8-12%L-山梨糖、0.3-3 %玉米浆、0.05-0. 2 %磷酸二氢 钾，0· 05-0. 5%尿素，0· 005-0. 02%硫酸镁，0· 1-0. 5%碳酸钙，ρΗ6· 7-7. 0,其中碳源（L-山 梨糖）和氮源分开灭菌，灭菌条件为12rC，20min。
[0016] 在种液培养基及发酵培养基中加入上述至少一种二碳及六碳单位是本发明的重 点。这些物质既可以在培养基配制的时候添加，也可以在发酵开始后以补料方式加入。
[0017] 本发明的技术方案见实施例。
[0018] 实验发现，在常规种液中单独或者复合添加二碳或六碳单位碳源，能明显提高种 液中大小菌的数量，并在进一步的发酵过程中降低发酵周期，但转化率提升不大。在常规发 酵液中单独或者复合添加二碳或六碳单位碳源亦可提高大小菌数量，并在降低发酵周期的 同时，明显提高2-KGA转化率。
[0019] 本发明揭示了在添加二碳单位或六碳单位碳源后，可以增强菌体对碳源的利用 率，进而明显提高菌体生长及产2-KGA效率，该发明将对工业水平上进一步提高产率，降低 生产成本起到积极的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 下面结合附图及【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明：
[0021] 图1是基于小菌全基因组测序及代谢网络分析构建的小菌主要碳代谢途径。其中 实线框里的物质代表本专利涉及到的六碳与二碳单位，双向箭头代表反应可逆，单向箭头 代表反应不可逆，箭头上的数字代表该反应酶的EC编号，虚线箭头代表省略的代谢步骤。
[0022] 如图1，基于对酮古龙酸菌的碳代谢网络分析可知，小菌体内存在完整的三羧酸 循环途径（TCA)及磷酸戊糖途径（PPP)，而酵解途径（ED)中因缺乏将6P-果糖转化为 1，6-2P-果糖的6P-果糖激酶（EC2. 7. 1. 11)，故导致小菌不能直接利用D-葡萄糖经酵解 途径转化为丙酮酸并进一步转化成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，而是通过进入PPP途径将 碳源转化为3P-甘油醛，一部分3P-甘油醛逆ED途径转化为6P-葡萄糖重新流入PPP途径， 另一部分3P-甘油醛则进入ED途径下半程，经丙酮酸转化为乙酰辅酶A进入TCA循环。
[0023] 故在小菌体内L-山梨糖的代谢途径是先经磷酸转运系统（PTS)跨膜磷酸化后再 转化为6P-山梨醇，并进一步转化为6P-果糖后参与碳代谢过程。基因组注释表明，小菌 PTS系统亦可转运D-山梨糖、D-甘露醇与D-甘露糖，并且这3种六碳单位进入体内磷酸化 后只经一步便转化为6P-果糖，故认为这3种碳源具有比L-山梨糖更好的利用程度。
[0024] 同时亦发现，在酵解的后半程，小菌缺乏将乙酰辅酶A转化为乙酸的乙酰辅酶裂 解酶（EC6.2. 1. 13)，故不能通过乙酰辅酶A转化为乙酸，但是却存在乙酰辅酶A合成酶 (EC6. 2.I. 1)可将乙酸转化为乙酰辅酶A，同时该代谢途径中，乙酸、乙醛及乙醇亦可相互 转化，故认为小菌可以利用二碳单位乙酸、乙醛及乙醇作为碳源。
[0025] 为了更好的阐明六碳单位及二碳单位对提高产2-KGA水平的应用，下面将描述本 发明的四个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
[0026] 实施实例1:单因素条件下考察常规种液中添加二碳及六碳单位对产2-KGA能力 的影响
[0027] 分别在各个常规种子培养基中加入的上述二碳及六碳单位碳源，浓度均依次为 0· 02%，0· 2%，2%。
[0028] 常规种子培养基为：2%L-山梨糖，0.5%玉米浆，0.2%葡萄糖，0. 1%尿素0.2% 碳酸钙，PH6.7-7.0。
[0029] 常规发酵培养基为：8%L-山梨糖，1. 5%玉米浆，0. 1%磷酸二氢钾，0. 1%尿素， 0.01%硫酸镁，0.5%碳酸钙，？册.7-7.0。
[0030] 培养条件：混菌培养的斜面分别接种于添加了不同二碳或六碳单位的普通种液培 养基中，30°C220转/分，摇瓶培养20h制成种液，10%接种于普通发酵培养基中，30°C220 转/分，摇瓶培养至底物L-山梨糖小于lmg/L发酵结束。实验结果见表1.
[0031] 表1.单因素条件下种液中添加0.02^,0.2%及2%的二碳及六碳单位碳源对发 酵的影响.
[0032]
【权利要求】
1. 增强酮古龙酸菌碳代谢水平提高产2-酮基-L-古龙酸能力的方法，其特征在于，在 酮古龙酸菌(小菌）与巨大芽孢杆菌(大菌）混菌发酵过程中加入二碳单位或六碳单位碳源 中的一种或几种。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二碳单位包括乙醇、乙醛及乙酸 (盐)，所述的六碳单位包括D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的种液培养基为：1-3% L-山 梨糖，0? 3-1% 玉米浆，0? 1-0. 5% 葡萄糖，0? 05-0. 3% 尿素，0? 1-0. 3% 碳酸钙，pH 6. 7-7. 0， 121°C灭菌 20 min。
4. 根据权利要求1-3任何一项所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：8-12% L-山梨糖、0. 3-3% 玉米浆、0. 05-0. 2% 磷酸二氢钾，0. 05-0. 5% 尿素，0. 005-0. 02% 硫 酸镁，0. 1-0.5%碳酸钙，pH6. 7-7.0,其中碳源（L-山梨糖）和氮源分开灭菌，灭菌条件为 121°C，20min。
5. 根据权利要求1-4任何一项所述的方法，其特征在于，所述的二碳或六碳单位的加 入量分别为〇? 〇2%_2% (m/v)。
6. 根据权利要求1-5任何一项所述的方法，其特征在于，所述的二碳或六碳单位在培 养基配制的时候添加，或在发酵开始后以补料方式加入。
7. 根据权利要求1-6任何一项所述的方法，其特征在于，加入种液培养基中的二碳或 六碳单位为：〇. 15% D-甘露醇，0. 05% D-甘露糖，0. 15%乙醇及0. 1%乙酸钠。
8. 根据权利要求1-6任何一项所述的方法，其特征在于，加入发酵培养基中的二碳或 六碳单位为：〇. 15% D-山梨醇，0. 1% D-甘露醇，0. 1% D-甘露糖，0. 05%乙醛及0. 1%乙酸 钠。
【文档编号】C12P7/60GK104357529SQ201410545705
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】张怡轩, 付阳, 于哲, 张盛, 李野, 韩立涛, 张海宏 申请人:沈阳药科大学