转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用，包括3对短肽，3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，第一对短肽识别SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的DNA序列，第二对短肽识别SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的DNA序列，第三对短肽识别SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的DNA序列。本发明利用这3对短肽构建获得的转录激活子样效应因子，能够分别特异识别人miRNAs：miR-133b、miR-141和miR-488基因种子序列附近的二段相邻核苷酸；利用这3对转录激活子样效应因子构建获得的转录激活子样效应因子核酸酶，能够对人miRNAs：miR-133b,miR-141和miR-488基因进行准确、高效地打靶。
【专利说明】转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体为转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与 应用，尤其为应用于人类miRNAs基因的敲除。
【背景技术】
[0002] 基因组祀向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病 方面，基因组祀向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变基因的 遗传组成，获得满足各种需要的基因工程工具。传统较常用的转基因方法为质粒稳定转染 法、反转录病毒携带法和同源重组法。但质粒转染稳定筛选的插入位点随机，且需要抗生素 维持，容易导致非正常的细胞表型；而反转录病毒携带目的基因的效率虽高，但是插入位点 不确定，影响其它内源基因的表达，限制了该方法的应用；另外，同源重组法虽然可W定点 插入，但是成功率很低(重组概率为！(T 6-I(T7)D
[0003] 目前，基因组工程学中的H大利器为；ZFN (Zinc Finger Nucleases)、TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease)和 CRISPR/Cas9。
[0004] ZFN是指锋指蛋白，是转录因子，每个模块识别3-4个碱基序列，将该些模块混合 搭配，可W祀定任何序列，然后，通过C末端的化k I核酸内切酶结构域可W切断双链DNA分 子。Sangamo生物科学公司和Sigma- Al化ich公司已经将ZFN技术商业化，推出CompoZr? ZFN平台。但是，由于锋指蛋白之间存在相互作用，锋指模块与DNA序列之间没有一个简单 的对应关系，所W W锋指蛋白为基础设计针对序列特异性DNA结合蛋白依然是个难题，并 且花费昂贵，经常要做大规模的筛选，构建过程长达几周至数月。
[0005] CRISPR/tas9系统是由短的向导RNA介导，化s9核酸酶在特定的双链DNA位点上 产生断裂。CRISPR/Cas可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑。然而，由于向导RNA序 列比ZFN或TALEN所祀定的序列短，致使脱祀效应高。但化urch最近发现，通过利用化s9 的一种突变形式(只切割单链DM)和两个紧挨着的向导RNA，有可能大大提高系统的切割 位点保真性，降低脱祀效应。
[0006] TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。TALEN是转录激活样效应因子，来源 于黄单胞杆菌。利用TALEN蛋白的核酸结合结构域的氨基酸序列与核酸序列有恒定的对 应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加非特异内切酶化k I 结构域，TALEN蛋白在理论上可W祀向切割任意基因组DNA双链。TALEN蛋白中DNA结 合域为高度保守的重复单元，每个重复单元含有34个氨基酸，除了第12和13位氨基酸 变化外，其它氨基酸都是相同的，该两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基 (r巧eatvari油Ie di-resi化es, RVD),与碱基识别相关。TALEN识别DNA的机制在于每个 重复序列的RVD可W特异识别DNA的1个碱基，皿特异识别C碱基，NI识别A碱基，順识 别G碱基，NG识别T碱基。另外，通过对天然TALEN的研究发现，TALEN蛋白框架固定识别 1个T碱基，所W TALEN的识别序列总是W T碱基开始。
[0007] 在真核细胞内，TALEN切割的双链DNA，可奶敷活两条保守的DNA修复通路。非同源 末端连接修复（non-homologous end joining，畑EJ),细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再 将其彼此拉近，将断裂的染色体重新连接，该个过程往往产生移码，或者在断裂位点引进小 片段插入或删除，影响基因功能或产生基因敲除效应。同源指导修复化omology-directed repair，皿R)是指利用相似序列的DNA供体模板，代替断裂点周围的DNA序列，从而实现特 定突变或导入外源DM序列的目的。在本发明专利中，采用携带同源模板的PMD18载体共 同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用PMD18载体提供的 同源序列，高效精确地对基因组进行编辑。
[0008] TALEN技术可W广泛的应用于基因组编辑的各个方面；细胞水平的基因敲除，定 点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景。目前TALEN技 术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%-20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过 挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。
[0009] miRNAs是一类进化上高度保守的非编码单链RNA，长度通常在22nt左右。自1993 年，Lee,Feinbaum和Ambros等在线虫体内发现了第一个miRNA (lin-4) W来,miRNAs的数 据与日俱增，miRNAs相关预测软件也日益成熟。miRNAs由基因组DNA编码，在RNA聚合酶 II的作用下转录成为pri-microRNAs，通过化osha和Dicer等一系列酶切之后形成成熟的 miRNAs,最终与多种蛋白共同形成miRNAs诱导的沉默复合体（miRNA-in化ced silencing complex，miRICS)主要结合于祀mRNA的3' -UTR区域，阻遏翻译甚至直接降解mRNA，抑制基 因表达。目前，已经有超过2500余种人类miRNAs被发现。miRNAs参与多种生物学功能， 如调节细胞发育、分化、增殖、调亡等。一些miRNAs在癌症发生发展中发挥作用，其中一些 miRNAs 抑制肿瘤发生，称为 tumor suppressor miRNAs (TSmiRs);另一些 miRNAs 促进肿瘤 发生，则称为oncogenic miRNAs,即oncomiRs。目前，针对miRNAs的基因操作主要分为两 种；1.化学合成的反义寡核巧酸，其序列与成熟miRNAs序列互补，通过抑制miRNAs而发挥 作用；2.与天然miRNAs序列相同的小分子，可增强miRNAs的作用，此方法的作用机制类似 于RNA干扰，不同的是，天然miRNAs因为其序列来源于细胞基因组，体内存在miRNAs表达 调控机制，故较RNAi脱祀效应小，免疫反应轻。但是，由于此两种miRNAs的基因操作均不 能在基因组水平改造miRNAs,故其起效时间持续短、疗效不稳定、效果不确定。2014年，美 国加利福尼亚州立大学的Claudia研究组针对人类miR-21基因在细胞系肥K-293中成功 实现了双敲除。现阶段，涉及人类miRNAs基因敲除的问题主要有；1. miRNAs编码序列仅 300核巧酸左右，比较难找到高效的TALEN打祀序列；2. miRNAs的拷贝数可能不止一个，同 家族成员也为多个，故有效的双敲除和多敲除是关键问题；3. miRNAs多协同发挥作用，敲 除单个miRNAs基因的治疗作用有待考察。本发明对人类miRNAs ;miR-133b, miR-141和 miR-488基因进行敲除，采用新兴的TALEN技术，针对位点为miR-133b, miR-141和miR-488 的种子序列，W达到有效去除miRNAs的作用。
【发明内容】
[0010] 针对现有技术的上述技术问题，本发明的目的是提供一种转录激活子样效应因 子核酸酶及其编码基因与应用。本发明提供了 3对短肤，利用该3对短肤构建获得的转录 激活子样效应因子，能够分别特异识别人miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因种子 序列附近的二段相邻核巧酸；利用该3对转录激活子样效应因子构建获得的转录激活子样 效应因子核酸酶，能够对人miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因进行准确、高效地 打祀。
[0011] 为达到上述目的，本发明是通过W下技术方案实现的： 一种转录激活子样效应因子核酸酶，包括3对短肤，所述的3对短肤分别为第一对短 肤、第二对短肤和第H对短肤，所述第一对短肤识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA 序列，所述第二对短肤识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第H对短肤识 别 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 的 DNA 序列。
[0012] 所述的短肤由分别识别人类miR-133b、miR-141和miR-488基因上核巧酸序列中 相应碱基的TALE化识别模块依序连接而成；识别碱基A的TALE化识别模块为NI,识别碱 基T的TALE化识别模块为NG，识别碱基C的TALE化识别模块为皿，识别碱基G的TALE化 识别模块为NK (见表2)。
[0013] 作为优选的，所述蛋白质包括第一对蛋白质、第二对蛋白质和第H对蛋白质，所述 第一对蛋白质由第一对短肤两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端 和C端组成，所述第二对蛋白质由第二对短肤两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸 序列框架的N端和C端组成，所述第H对蛋白质由第H对短肤两端分别加上转录激活子样 效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框 架的N端和C端均为天然的或经过人工改造的序列。
[0014] 所述第一对蛋白质、第二对蛋白质和第H对蛋白质可W分别特异性识别人类 miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因上的二段核巧酸序列，所述3对核巧酸序列分 别选自W下所示的核巧酸序列： (1) SEQ ID NO. 1序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 2序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序列； (2) SEQ ID NO. 3序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 4序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序列； (3) SEQ ID NO. 5序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 6序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序列。
[0015] 作为优选的，所述融合蛋白包括第一对融合蛋白、第二对融合蛋白和第H对融合 蛋白，所述第一对融合蛋白由第一对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第 二对融合蛋白由第二对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第H对融合蛋白 由第H对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成；所述的DNA切割蛋白为天然的或经 过人工改造的化k I DNA内切酶。
[0016] 一种重组载体，所述重组载体的编码包含一对短肤或蛋白质中的任意一条的载 体。
[0017] 作为优选的，将能够特异性识别SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6碱基序列的多 核巧酸连接到载体祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl (R)-pA或载体祀Fla-化S-TALEN bac化one-Fokl (L) -IRES-PURO-pA上，构建获得包含编码转录激活子样效应因子核酸酶基 因的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。
[0018] 一种宿主细胞，所述宿主细胞为人离体细胞，所述的人离体细胞为人RWPE-I细 胞，且宿主细胞含有重组载体。
[0019] -种重组载体在对人miR-133b、miR-141和miR-488基因碑!向修饰中的应用。
[0020] -种人类miRNAs基因打祀的方法，将重组载体转入人离体细胞，于37C扩增培养 1-4天，得到miRNAs基因被祀向修饰的细胞。
[0021] 作为优选的，所述人离体细胞中转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒， 便于筛选。
[0022] 本发明分别针对人类miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因的3个位点设 计了H对转录激活子样效应因子核酸酶，该3对TALE化分别由可W识别miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因上3段核巧酸的DNA识别结构域与化k I DNA内切酶的两个异源 亚基融合得到。将该3对转录激活子样效应因子核酸酶成对转入宿主细胞时，其能对宿主 细胞miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因的位点打祀，并使打祀位点发生基因突 变，包括碱基缺失、碱基插入等，从而实现对人类miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基 因的祀向修饰，具有特异性强、打祀效率高、准确度高等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[002引 图1为序列表； 图2为人工设计的转录激活子样效应因子核酸酶识别的DNA序列及位点； 图 3 为载体祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl(R)-pA 示意图； 图 4 为载体祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl (L)-IRES-PURO- pA 示意图。
【具体实施方式】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述。该些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未 注明具体条件的实验方法。通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第H版，J.萨姆布 鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。涉及的化学试剂盒、生物制品， 如未特殊说明，表明它们均为商品化产品。
[00巧]TALEN试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司。用于原代细胞/普通细胞/肿 瘤细胞基因打祀的专用TALEN载体包括10个，左右臂各5个，它们均含有CMV启动子，化S， N端，C端，Fok I，嘿岭霉素抗性基因(仅在左臂)等基本结构。载体间的不同之处在于TALEN 识别序列的最后一个碱基的不同，分为A/T/C/G四种，此外，包括一个带有EGFP英光标记的 TALEN右臂。左右臂骨架的化k I序列不同，在TALEN作用时，化k I酶会形成一个异源二 聚体的结构，大大增加TALEN切割的效率。
[0026] 本发明的转录激活子样效应因子核酸酶，包括3对短肤，所述的3对短肤分别为第 一对短肤、第二对短肤和第H对短肤，所述第一对短肤识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 的DNA序列，所述第二对短肤识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第H对 短肤识别SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
[0027] 作为优选的，短肤由分别识别人类miR-133b、miR-141和miR-488基因上核巧酸 序列中相应碱基的TALE化识别模块依序连接而成；识别碱基A的TALE化识别模块为NI, 识别碱基T的TALE化识别模块为NG，识别碱基C的TALE化识别模块为皿，识别碱基G的 TALE化识别模块为NK (见表2)。
[002引作为优选的，所述蛋白质包括第一对蛋白质、第二对蛋白质和第H对蛋白质，所述 第一对蛋白质由第一对短肤两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端 和C端组成，所述第二对蛋白质由第二对短肤两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸 序列框架的N端和C端组成，所述第H对蛋白质由第H对短肤两端分别加上转录激活子样 效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框 架的N端和C端均为天然的或经过人工改造的序列。
[0029] 作为优选的，第一对蛋白质、第二对蛋白质和第H对蛋白质可W分别特异性识别 人类miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因上的二段核巧酸序列，所述3对核巧酸序 列分别选自W下所示的核巧酸序列： (1) SEQ ID NO. 1序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 2序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序列； (2) SEQ ID NO. 3序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 4序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序列； (3) SEQ ID NO. 5序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 6序列或者该序列的一个或二个核巧酸经过取代所衍生的核巧酸序列。
[0030] 作为优选的，所述融合蛋白包括第一对融合蛋白、第二对融合蛋白和第H对融合 蛋白，所述第一对融合蛋白由第一对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第 二对融合蛋白由第二对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第H对融合蛋白 由第H对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成；所述的DNA切割蛋白为天然的或经 过人工改造的化k I DNA内切酶。
[0031] 本发明的重组载体的编码包含一对短肤或蛋白质中的任意一条的载体。
[0032] 作为优选的，将能够特异性识别SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6碱基序列的多 核巧酸连接到载体祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl (R)-pA或载体祀Fla-化S-TALEN bac化one-Fokl (L) -IRES-PURO-pA上，构建获得包含编码转录激活子样效应因子核酸酶基 因的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。
[0033] 本发明的宿主细胞为人离体细胞，人离体细胞为人RW阳-1细胞，且宿主细胞含有 重组载体。
[0034] 本发明重组载体在对人miR-133b、miR-141和miR-488基因祀向修饰中的应用。
[0035] 本发明人类miRNAs基因打祀的方法，将重组载体转入人离体细胞，于37C扩增培 养1-4天，得到miRNAs基因被祀向修饰的细胞。
[0036] 作为优选的，所述人离体细胞中转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒， 便于筛选。
[0037] 实施例1 TALE化祀序列的设计 1. 从 miRBase 上下载人类 miRNAs ;miR-133b，miR-141 和 miR-488 基因 DNA 序列； 2. 设计TALE化识别序列卿序列）； 根据miRBase数据库得到的序列，并依照W下原则确定TALE化识别序列： (1) 第0位碱基为T (识别序列第一位之前的碱基为第0位） (2) 最后一位碱基可W为AGCT，优选T (3) 识别序列长度在13-19之间 (4) 二个识别序列之间的间隔序列长度控制在14-21之间（12, 13也可，但效率可能较 低） 设计得到的祀序列位置如图1所示，具体序列见表1。
[0038] 表 1
【权利要求】
1. 一种转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括3对短肽，所述的3对短肽分 别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，所述第一对短肽识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA序列，所述第二对短肽识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述 第三对短肽识别SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
2. 如权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：所述的短肽由分 别识别人类miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相应碱基的TALENs识别模 块依序连接而成；识别碱基A的TALENs识别模块为NI，识别碱基T的TALENs识别模块为 NG，识别碱基C的TALENs识别模块为HD，识别碱基G的TALENs识别模块为NK。
3. 如权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括第一对蛋白 质、第二对蛋白质和第三对蛋白质，所述第一对蛋白质由第一对短肽两端分别加上转录激 活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第二对蛋白质由第二对短肽两端 分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第三对蛋白质由 第三对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；所述 的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端均为天然的或经过人工改造的序 列。
4. 如权利要求3所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括第一对融合 蛋白、第二对融合蛋白和第三对融合蛋白，所述第一对融合蛋白由第一对蛋白质与DNA切 割蛋白的二个亚基融合而成，所述第二对融合蛋白由第二对蛋白质与DNA切割蛋白的二个 亚基融合而成，所述第三对融合蛋白由第三对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而 成；所述的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok I DNA内切酶。
5. -种如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的编码包含一对短 肽或蛋白质中的任意一条的载体。
6. 如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：将能够特异性识别SEQ ID NO. 1-SEQ IDN0.6碱基序列的多核苷酸连接到载体pEFla-NLS-TALENbackbone-Fokl(R)-pA或载 体pEFla-NLS-TALEN backbone-Fokl (L) -IRES-PURO-pA上，构建获得包含编码转录激活子 样效应因子核酸酶基因的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。
7. -种如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为人离体细胞，所述 的人离体细胞为人RWPE-1细胞，且宿主细胞含有重组载体。
8. -种如权利要求7所述的重组载体在对人miR-133b、miR-141和miR-488基因靶向 修饰中的应用。
9. 一种如权利要求8所述人类miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：将重组载体转入 人离体细胞，于37°C扩增培养1-4天，得到miRNAs基因被靶向修饰的细胞。
10. 如权利要求9所述人类miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：所述人离体细胞中 转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒，便于筛选。
【文档编号】C12N15/85GK104357422SQ201410521124
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】宋春娇, 茹国美, 张伟光, 杨万雷 申请人:绍兴市人民医院