一种牙鲆抗冻蛋白的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及水产生物技术中的功能基因筛选与应用【技术领域】，具体地说是一种牙鲆抗冻蛋白的应用。牙鲆IV型抗冻蛋白作为制备低温保护剂的应用。本发明克隆并表达获得的牙鲆IV型抗冻蛋白，并通过体外细菌低温保护保护实验分析其低温保护作用。该蛋白容易通过细菌大量表达，在本发明的表达、纯化条件下能够自然折叠，具有天然蛋白的特性，避免了体外表达蛋白的变性复性过程。
【专利说明】一种牙鲆抗冻蛋白的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产生物技术中的功能基因筛选与应用【技术领域】，具体地说是一种牙 鲆抗冻蛋白的应用。
【背景技术】
[0002] 在极端的寒冷条件下，鱼类为了避免冰冻对机体的损伤，进化出抗冻蛋白 (Antifreeze protein，AFP)。AFP最早是由DeVries在南极Mcmurdo海峡的一种南极鱼科 鱼类Antarctic Nototheniids (Trematomus nicolai)的血液中发现。其生物学功能为特 异地与冰晶结合，吸附在其表面并抑制其生长，改变其形态，从而减缓冰晶生长速度。此外， 还具有重结晶抑制效应，使体内的冰晶主要以体积小而均匀的状态存在，从而避免温度降 低对生物体造成的伤害。AFP根据蛋白含糖与否分为抗冻糖蛋白（AFGPs)和不含糖的抗冻 蛋白或称为抗冻多肽（AFP)，不含糖的抗冻蛋白根据其氨基酸组成的差异，又分为I型、II 型、III型和IV型。
[0003] AFP-IV是 Deng 等首先从长角杜父鱼（Myoxocephalus octodecimspinosis)的 血清中分离到的一种新型抗冻蛋白。该抗冻蛋白通常含有108个氨基酸，分子量约为 12. 3KDa，并且含有高达17%的Glu，序列与膜载脂蛋白有相似性（约为22% )，因此被认为 是由膜载脂蛋白进化而来。该蛋白三维结构为4个左手α-螺旋反向平行排列折叠成的一 个螺旋束，其中疏水基团向内，亲水基团向外，亲水基的表面可与冰晶结合，阻止冰晶从皮 肤表面渗入。此外，侧纹南极鱼（Pleuragramma antarcticum)和革首南极鱼（Notothenia coriiceps)等鱼类中也发现了 AFP-IV，并分别进行了原核重组表达，发现AFP-IV热滞值在 浓度为〇. 5mg/mL时是0. 08°C，具有抗冻活性。
[0004] 牙鲆（Paralichthys olivaceus)，是我国重要的海水养殖鱼类之一，其适应性强， 可耐受2°C的低温。因此，克隆并鉴定牙鲆AFP-IV蛋白，可为该蛋白在低温保护方面的功能 研究提供基础。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种牙鲆抗冻蛋白的应用。
[0006] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0007] -种牙鲆抗冻蛋白的应用，牙鲆IV型抗冻蛋白作为制备低温保护剂的应用。
[0008] 所述牙鲆AFP IV蛋白用于制备细菌体外的低温保护剂的应用。
[0009] 所述低温保护剂是指低温下能够维持生物正常生存或者降低生物伤害、死亡的物 质。其中低温中的最低温度可达到o°c。
[0010] 所述牙鲆AFP IV由序列表SEQ ID No. 1中核苷酸序列所示。所述序列从牙鲆cDNA 中克隆得到的鱼类IV型抗冻蛋白基因同源的基因AFP IV，其CDNA全长652bp，包含375bp 开放阅读框，编码124个氨基酸。
[0011] 本发明所具有的优点：
[0012] 本发明克隆并表达获得的牙鲆IV型抗冻蛋白，并通过体外细菌低温保护保护实 验分析其低温保护作用。该蛋白容易通过细菌大量表达，在本发明的表达、纯化条件下能够 自然折叠，具有天然蛋白的特性，避免了体外表达蛋白的变性复性过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为本发明实施例提供的pET-30a(+)载体组成示意图。
[0014] 图2为本发明实施例提供的重组牙鲆IV型抗冻蛋白纯化产物示意图。
[0015] 图3为本发明实施例提供的重组牙鲆IV型抗冻蛋白对细菌的抗低温保护作用曲 线。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 :牙鲆IV型抗冻蛋白基因的获得
[0017] 1.采用Trizol提取牙鲆RNA
[0018] a)取牙鲆受精卵约100μ L，先加入200μ L Trizol并进行充分研磨，然后加入 800 μ L Trizol用枪头吹打均匀，将匀浆样品在15-30°c放置5min ;
[0019] b)静置后4°C 12000Xg离心lOmin，取上清至新的离心管中；
[0020] c)而后再在新试管中加200 μ L氯仿，剧烈振荡15s，静置2-3min ;
[0021] d)静置后在4°C，12000 X g，离心15min。离心后样品分三层，RNA主要在水相；
[0022] e)将600 μ L水相转移到新的离心管，加600 μ L异丙醇，颠倒混勻，室温静置 lOmin，沉淀 RNA ;
[0023] f)静置沉淀后在以4°C，12000 X g，离心lOmin，RNA沉淀在管底呈一胶状片层；
[0024] g)在离心后的管中加入ImL 75%乙醇（DEPC水配制），振荡后4°C，7500Xg离心 5min,然后去上清；
[0025] 11)空气干燥1?敵约5111；[11，加入20以1^0似86、1?似86；1^66水溶解沉淀，可放入58 1€ 水浴IOmin使RNA完全溶解，RNA样品液氮速冻后保存与-80°C备用。
[0026] 2. cDNA文库的构建
[0027] 由宝生物工程（大连）有限公司完成。具体为将牙鲆Total RNA，先提取 PolyA+RNA,然后反转录合成双链cDNA,经末端平滑化、连接Adaptor、酶切、去除短片段后 连接到pBluescript II SK(+)载体上得到初级cDNA文库。将连接液部分转化，涂平板得 至丨J 100万克隆扩增放大的cDNA文库。
[0028] 3.牙鲆IV型抗冻蛋白基因序列
[0029] 将百万扩增文库甘油菌保存液稀释IO5倍后涂板，挑单克隆培养，提取质粒，用 EcoR I、Xho I进行双酶切，筛选大小不同的片段，然后对应的单克隆进行测序。测序引 物：T3Primer :5, -ATTAACCCTCACTAAAGGGAA-3,，T7Primer :5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,。 将获得序列在NCBI数据库进行Blast比对，获得如SEQ ID No. 1所示的牙鲆IV型抗冻蛋 白基因序列（Genebank :AF384676)。
[0030] SEQ ID No. 1
[0031]
【权利要求】
1. 一种牙鲆抗冻蛋白的应用，其特征在于：牙鲆IV型抗冻蛋白作为制备低温保护剂的 应用。
2. 按权利要求1所述的牙鲆抗冻蛋白的应用，其特征在于：所述牙鲆AFP IV蛋白用于 制备细菌体外的低温保护剂的应用。
3. 按权利要求1或2所述的牙鲆抗冻蛋白的应用，其特征在于： 所述牙鲆AFP IV由序列表SEQ ID No. 1中核苷酸序列所示。
【文档编号】C12N1/04GK104212717SQ201410477873
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】谭训刚, 王倩, 李美洁, 焦爽, 尤锋, 邹玉霞 申请人:中国科学院海洋研究所