一种珠子参达玛烯二醇合成酶基因及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种珠子参达玛烯二醇合成酶基因及其应用，本发明首次利用第二代SolexaHiSeq2000进行珠子参根茎转录组测序及 Denovo 拼接。分析找到珠子参中编码达玛烯二醇合成酶（DS）的候选基因并进行体外克隆，获得了珠子参达玛烯二醇合成酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示，将珠子参达玛烯二醇合成酶基因通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高达玛烷皂苷含量的转基因植株。
【专利说明】—种珠子参达玛烯二醇合成酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，主要涉及珠子参中达玛烯二醇合成酶(Dammarened1l-1I s ynthase, DS)基因的克隆和应用，
【背景技术】
[0002]珠子参是五加科人参属(Panax L.)植物。珠子参又名扣子七、钮子七、珠儿参，系五加科植物珠子参[Panax japonicus C.A.Mey.var.major (Buck.) C.Y Wu et Κ.M.F eng]或习习叶三七[Panax japonicus C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu et K.M.Feng]的干燥串珠状根茎。珠子参是中国药典收载品种，主要分布在我国陕西、四川、湖北、云南等省。具有补肺、养阴、活络、止血的功效，用于气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、吐血、外伤出血等。其主要活性成分为达玛烷型四环三萜类皂苷化合物，现代研究表明达玛烷型四环三萜类皂苷化合物具有较高的生理活性，因此本专利通过研究珠子参中活性成分达玛烷型四环三萜类皂苷化合物生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对达玛烷型四环三萜类皂苷化合物生物合成进行人工调控，为进一步实现珠子参中达玛烷型四环三萜类皂苷化合物的生产提供研究基础。
[0003]珠子参的达玛烷型四环三萜类皂苷化合物来自于异戊二烯途径。2，3-氧化角鲨烯的环化是三萜皂苷合成下游途径中的关键步骤，这一步由达玛烯二醇合成酶(DS)催化产生达玛烯二醇，达玛烯二醇在细胞色素P450单加氧酶的催化下形成达玛烷型皂苷三萜皂苷元——原人参二醇，原人参二醇继续在细胞色素篇P450单加氧酶的催化下转变为原人参三醇苷元，最终形成不同类型的达玛烷四环三萜皂苷。
[0004]迄今为止，关于珠子参活性成分代谢途径的生物合成研究尚属空白，珠子参中达玛烯二醇合成酶(DS)基因的克隆研究也未见相关报道。本专利首次利用第二代SolexaHiSeq2000进行珠子参根茎转录组测序及De novo拼接。分析找到珠子参中编码达玛烯二醇合成酶(DS)的候选基因并进行体外克隆、表达验证，为进一步了解该酶在珠子参植物体内基因表达、功能与作用机制奠定了研究基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因，其序列为SEQ IDN0.1所示。该基因编码的达玛烯二醇合酶在达玛烷型皂苷化合物合成途径中起关键性作用。
[0006]本发明第二个目的是提供一种珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.2所示。
[0007]本发明的最后一个目的在于提供一种珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因在提高珠子参达玛烷型皂苷化合物含量中的应用。
[0008]为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:
[0009]一种珠子参达玛烯二醇合酶基因(Dammarened1l synthase,以下简称DS基因)，其制备方法如下:
[0010]以珠子参CDNA 为模板，利用正向引物 Pl:5’-ATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’ 反向引物 P2:5’ -TTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT-3’ 进行 PCR 反应。
[0011]反应条件:30个PCR反应循环，94°C变性lmin，42°C退火2min，75°C延伸3min。最后 75°C延伸 1min0
[0012]最终获得了 DS基因，其序列为SEQ ID N0.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示。
[0013]一种珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因在提高珠子参达玛烷型皂苷化合物含量中的应用，其应用过程如下:
[0014]将珠子参达玛烯二醇合成酶蛋白质(SEQ ID N0.2所示)对应的DS基因(优选SEQID N0.1所示)通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高达玛烷皂苷含量的的转基因植株。
[0015]本发明的所要保护的内容还包括:
[0016]编码SEQ ID N0.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0017]含有本发明的珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列的重组载体，包括但不限于原核类载体pT7-Blue，真核类表达载体pYES2、pBI 121。
[0018]含有本发明的珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列的宿主细胞，包括但不限于含有上述的重组载体的宿主细胞酵母宿主菌GIL77、大肠杆菌、珠子参。
[0019]本发明的珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体，包括但不限于烟草、酵母、拟南芥、珠子参发根。
[0020]本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
[0021]利用本发明的珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0022]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0023]本发明所提供的珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因是首次从珠子参植物中克隆制备所得，利用本发明的技术可以对珠子参等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改造，通过转基因来提高植物体内的达玛烷皂苷化合物的含量。珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因可参与珠子参化合物的生物合成，因此本申请为珠子参达玛烷型皂苷化合物生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
[0024]进一步添加其产业上积极的效果本发明利用转基因技术得到了达玛烷型皂苷化合物含量增加的高产株，为三萜类皂苷化合物的的工业化生产提供了技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为珠子参总RNA电泳图。
[0026]图2为DS功能域预测分析。
[0027]图3为DS系统进化树。
[0028]图4为表达载体pYES2-DS构建示意图。
[0029]图5为酶活力检测示意图。
[0030]HPLC检测酶促产物，图A酶产物被HPLC检测分析，检测紫外波长为202nm，B图为真正达玛烯二醇HPLC分析图
【具体实施方式】
[0031]本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。
[0032]实施例1:
[0033]珠子参转录组测序及数据分析
[0034]1、样品采集
[0035]珠子参植株来源于湖北恩施，分别取根茎、叶、花，果实置液氮中速冻后，在-80°C冰箱中冷冻保存备用。
[0036]2、珠子参总RNA的分离和检测
[0037]对_80°C保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并适当加大巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和巯基乙醇后，采用高浓度NaAc溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性(图1)，用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于_80°C冰箱备用。
[0038]3、转录组测序(RNA-Seq)
[0039]用oligo(dT)的磁珠从总 RNA 中富集 mRNA,接加入 fragmentat1n buffer 将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链,在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly (A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代SolexaHiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。
[0040]4、候选基因初步筛选
[0041]通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5.0构建系统发育树(图3)等软件分析初步筛选到达玛烯二醇合成酶的候选基因。
[0042]实施例2:
[0043]珠子参达玛烯二醇合成酶相关基因的克隆
[0044]分析候选基因读码框范围，的设计克隆候选基因全长序列，其克隆方法如下:
[0045]以以珠子参根茎cDNA文库为模板，利用正向引物Pl:5’ -ATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’ 反向引物 P2:5’ -TTAAAITTTGAGCTGCTGGTGGT-3’ 进行PCR反应。
[0046]反应条件:30个PCR反应循环，94°C变性lmin，42°C退火2min，75°C延伸3min。最后 75°C延伸 1min0
[0047]链接到克隆载体pMD18-T上并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5 α中，步骤如下:
[0048]a)从_80°C超低温冰箱中取100 μ L感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；
[0049]b)加入5 μ L连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰上放置30min ；
[0050]c) 42°C热激90s，迅速置冰上5min ；
[0051]d)向EP管中加入ImL LB液体培养基(不含抗生素)，37°C 200rpm45min ；
[0052]e)摇菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培养箱过夜；
[0053]f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培样过夜选取阳性克隆送样测序。
[0054]至此获得了珠子参达玛烯二醇合成酶基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。
[0055]实施例3:
[0056]DS基因的生物信息学分析
[0057]本发明涉及的珠子参达玛烯二醇合成酶(DS)基因全长cDNA的长度为2310bp，其序列为SEQ ID N0.1所示，含有I个开放阅读框编码769个氨基酸的蛋白，编码的蛋白质序列为SEQ ID N0.2所不。将珠子参全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS translat1n+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行检索。该基因具有典型IS0PREN-C2_like superfamily的结构域。如图2
[0058]实施例4:
[0059]DS基因功能的研究
[0060]1、表达载体的构建
[0061]以珠子参根茎cDNA文库为模板，利用正向引物Pl:5’ -GGTACCATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’ 反向引物 P2:5’ -CTCGAGTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT-3’ 进行 PCR 反应，取 5ul扩增产物进行琼脂糖电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为2322bp。以KpnI和XhoI酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用KpnI和XhoI酶在37°C下酶切pYES2载体2小时，加入5ul溴酚蓝进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用试剂盒回收5856bp片段
[0062]二者经连接酶在16°C连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄霉素的LB平板上筛选重组子。含DS克隆的pYES2质粒经PCR和限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列分析，保存且有正确目标的重组质粒PYES2-DS用于表达转化。该表达载体命名为PYES2-DS (图 4)。
[0063]2、蛋白的诱导表达
[0064]以PYES2-DS质粒转化突变酵母宿主菌GIL77，在缺少尿嘧啶的完全合成培养基SC-U (20ug/ml麦角固醇，13ug/ml血红素，5mg/mlTween80)上30°C震荡培养2d，收集细胞在不含葡萄糖的SC-U培养基(20ug/ml麦角固醇，13ug/ml血红素,5mg/mlTween80, 2%半乳糖)上30°C培养1h.收集细胞悬浮于0.1Μ，ρΗ7.0的磷酸钾溶液中添加3%葡萄糖和血红素30°C培养24h。回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。
[0065]3、酶促反应鉴定
[0066]体外酶促反应以2，3-氧鲨烯(501111101171)作为反应底物，向体系中加TritonX-100 (lmg πιΓ1)，1mmol L^1Tris (pH6.0), 0.2mmo1 L-1EDTA, 2ug 纯化蛋白。25°C条件下剧烈摇晃30min，后加入Iml 40% KOH终止酶促反应。
[0067]HPLC分析其酶促产物。色谱柱为硅胶柱(4.6mmX250mm);流动相为磷酸盐缓冲液(50mM, pH 4.5)和乙腈(90:10, v/v),流速 lmL/min ;检测波长 220nm ;柱温 40。。。如图 5。
[0068]将酶促产物与真正达玛烯二醇做HPLC分析，如图5所示，两种物质HPLC峰一致，则可证明，酶促产物是达玛烯二醇。
[0069]实施例5:
[0070]DS在珠子参中进行真核表达及转基因珠子参发根中三萜类皂苷化合物含量的测定
[0071]转基因用的受体材料珠子参采自湖北恩施
[0072]采用本领域的常规技术，根据珠子参达玛烯二醇基因的全长cDNA序列(SEQ IDN0.1)，在扩增编码区的正反方向引物上引入限制性内切酶位点(视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，筛选转基因植株检测其达玛烷型皂苷的含量。
[0073]以实施例2中获得的含有DS基因编码区(SEQ ID N0.1所示)的pMD18_T Vector的质粒为模版，在上述构建的正向引物前引入BamH I酶切位点，在反向引物前引入Sac I酶切位点，正向引物 Pl:5’ GGATCCATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG3’:反向引物 P2:5’ GAGCTCTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT3’进行PCR扩增后，TA克隆，提取质粒。以BamH I和Sac I酶切扩增产物4h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH I和Sac I酶在37°C下酶切pBI121载体4h，在16°C下利用T4连接酶连接产物过夜，在保证阅读框正确的前提下将珠子参DS基因的编码区克隆到植物表达载体PBI121上，将酶切鉴定好的表达载体PBI121-DS转入农杆菌中，遗传转化珠子参。
[0074]利用发根农杆菌介导的珠人参的遗传转化，所需的材料和操作步骤如下:
[0075](I)发根农杆菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28 °C培养过夜。
[0076](2)取珠子参细嫩叶片，洗净后置于70%酒精中浸泡lmin，弃酒精，加入2%次氯酸钠消毒lOmin，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4?5次，置于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片将珠子参叶片切成5mmX5mm小片，置于预培养固体培养基上，在(23±1)°C暗箱培养箱中预培养2d。
[0077](3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4°C中2h后取出。将预培养过的珠子参叶片浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，(23±1) °C黑暗条件下培养，每2周转移到新鲜培养基中I次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。
[0078]转基因株的筛选利用real-time PCR进行:
[0079]提取具有卡那霉素抗性的转化珠子参植株的总RNA，将RNA反转录成cDNA，半定量所用引物为珠子参达玛烯二醇合酶基因特异引物(正向引物5’ -ACAGCACGATGATTGG-3’;反向引物5’ -GGGTATGAGGGTAGTAGAG-3’)，反应程序为94°C时3分钟，94°C变性30秒，61°C退火30秒，72 °C延伸45秒，25个循环；循环完成后72°C延伸5分钟。用珠子参的act in基因做为内参基因，正向引物 5’ -GGAAAAGATTTGGCATC-3’，反向引物 5’ -GGGCGTAACCCTCATA-3，。对珠子参的野生型和转化系在相同生长状态下进行目的基因表达水平的分析。最终选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4倍以上(P〈0.01)的转化植株作为阳性株进行后续的研究
[0080](4)把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养25d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存-80°C中备用。
[0081](5)过表达珠子参达玛烯二醇基因的转基因珠子参发根的达玛烷型皂苷元含量的HPLC检测
[0082]转基因珠子参发根中达玛烷型皂苷的含量的检测可使用本领域的常规技术，本发明具体采用以下步骤:
[0083]发根系样品的前处理，用液氮将样品研磨成粉末，各取0.1g放入茄形瓶中，加入4ml左右的甲醇，将装有样品的茄形瓶固定在蛇形冷凝管上，置于80°C的水浴锅上，回流提取12h，将茄形瓶取出，吸出甲醇提取液，并用少量甲醇洗涤样品粉末二至三次，一并转入容量瓶中，定容至5ml，用0.45um有机系滤膜过滤后，即可用于HPLC进样检测。
[0084]采用美国Thermo Fisher公司液质联用仪(LCQ Fleet)的高效液相色谱仪,检测转基因发根中皂苷元原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)的含量，色谱柱为Hypersil0DS2C18柱(250nmX4.6mm，5um)，色谱条件如下:流动相为甲醇-水(90:10)流速1.0ml/min，柱温25°C，检测波长203nm。
[0085]以非转基因珠子参发根系为对照，对照组和转基因组均检测10株，比较其达玛烷型皂苷的平均含量。
[0086]检测结果表明:与对照组相比，过表达珠子参达玛烯二醇基因的转基因珠子参中，原人参二醇皂苷(PPD)的含量平均提高了 2.3倍，原人参三醇皂苷(PPT)的含量提高了 3.6倍。
[0087]由此证明，珠子参达玛烯二醇基因对促进珠子参达玛烷型皂苷含量的提高有显著作用，珠子参达玛烯二醇基因可用于利用转基因技术提高珠子参达玛烷型皂苷含量的研究和产业化中，具有一定的应用前景。
【权利要求】
1.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQID N0.1所示。
4.含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体。
5.含有权利要求4所述植物表达载体的转基因植株。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物达玛烷型皂苷含量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高珠子参达玛烷型皂苷含量中的应用。
8.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高珠子参总皂苷含量中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK104293755SQ201410476575
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】陈平, 张绍鹏, 杨涛, 朱闻君, 陈燕, 曾万勇, 伍翀, 王如峰, 邓琛, 陈超, 霍梦蕊 申请人:陈平, 张绍鹏, 杨涛, 朱闻君, 陈燕, 曾万勇, 伍翀, 王如峰, 霍梦蕊, 邓琛, 陈超