一种表达α-淀粉酶工程菌的构建及该工程菌在动物饲料中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，也属于动物饲料科学领域，公开了一种表达α-淀粉酶工程菌的构建及该工程菌在动物饲料中的应用。本发明提供了一株耐高温酿酒酵母FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN，保藏号为CCTCC M 2014390)、一种α-淀粉酶基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)及其编码的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，本发明还提供了包含上述基因的重组载体、重组菌株及其在动物饲料中的应用。利用该基因构建的重组工程菌能高效表达α-淀粉酶，在以可溶性淀粉为底物时该酶可以达到490U/mL粗酶液。该工程菌能够利用淀粉生产菌体，降低生产成本；在瘤胃发酵中，该工程菌可以提高饲料中淀粉的利用率，增加微生物蛋白和总挥发性脂肪酸含量，降低氨态氮含量，促进动物健康生长。
CCTCC M2014390
2014.08.22
【专利说明】一种表达a-淀粉酶工程菌的构建及该工程菌在动物饲料 中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和动物饲料科学领域，具体阐述一种表达a -淀粉酶工程菌 的构建及该工程菌在动物饲料中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，国外对饲料酵母及酵母培养物（Yeast Culture, YC)已经进行了很深入的 研究，但我国开展研究的时间比较迟。近年来，由于国家限制抗生素类产品在动物饲料中使 用，所以酵母及酵母培养物已经成为替代抗生素的重要产品之一，其实际生产意义是深远 的。酵母菌具有很多生理功能，使其在饲料工业中得到了广泛的研究与应用。在反刍动物 上，酵母培养物能保持动物胃肠道微生态平衡；增强动物免疫功能；消除动物体内有毒物 质及抗氧化作用；改善动物生长性能。但天然野生的酿酒酵母不含淀粉酶，不能分泌淀粉 酶，且反刍动物的消化过程中淀粉得不到充分消化，约会残留5%左右。
[0003] 因此，研究携淀粉酶的酿酒酵母作为反刍动物饲料添加剂对瘤胃微生物发酵的影 响有着重要的意义。携淀粉酶的酿酒酵母作为反刍动物饲料添加剂，不仅能促进瘤胃微生 物发酵、提高生产性能，还能提高饲料中淀粉的利用率。因此，可以通过基因工程的方法把 外源淀粉酶基因转入到酿酒酵母菌中表达，从而使酿酒酵母菌可以分泌淀粉酶。
[0004] 在基因工程中，酵母表达系统已经发展很久了，其最先使用的是酿酒酵母，因为酿 酒酵母一直以来被认为是安全生物，并且遗传背景相对清楚。酿酒酵母表达载体可以有自 主复制型游离质粒和随染色体同步复制的整合型两种。自主复制型质粒由于含有来自酵母 天然质粒2 Ii m复制起点序列ARS(autonomously replicating sequence)，能够独立于酵母 染色体外自主复制，拷贝数通常可达30拷贝以上，但在多数情况下，如果没有选择压力，它 们是不稳定的，容易丢失。整合型载体不含自主复制序列（ARS)，可整合到酵母宿主菌的染 色体上，这类载体的优点是稳定性好，但它的缺点是拷贝数低。一般来说，外源基因在酵母 中的表达和基因的转录水平有密切的关系，所以，选用强启动子对高效表达就十分重要。目 前，酿酒酵母组成型的强启动子有PGK、ADH1、GPD等，诱导型强启动子有GALUGAL7等。（董 清华，沈元月.酵母表达系统研究进展与展望.北京农学院学报[J]，200823 (2) :72-75.) 酿酒酵母表达分泌到细胞外的蛋白质是通过信号肽来实现的，信号肽是存在于分泌蛋白质 N末端的特异氨基酸序列，引导新合成的分泌性蛋白质至不同的转运系统。酵母表达系统的 信号肽主要可以分为4种：一蛋白质自身信号肽，二酵母信号肽，三外源信号肽，四改造信 号肽。（覃晓琳，刘朝奇，郑兰英。信号肽对酵母外源蛋白质分泌效率的影响[J]。生物技 术，2010, 20 (3) :95-97.)现在已有多种淀粉酶基因在酿酒酵母中成功表达。
[0005] 然而，野生酿酒酵母一般在39°C (反刍动物瘤胃的温度）下代谢缓慢，分泌淀粉酶 的能力降低，所以有必要得到耐高温的突变菌株。本发明就是构建一株在39°C下能正常生 长的可分泌淀粉酶的酿酒酵母用于反刍动物饲料添加剂，以促进瘤胃微生物发酵，提高生 产性能和饲料中淀粉的利用率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一株耐高温的酿酒酵母菌FCN (Saccharomyces cerevisiae FCN)，其在中国典型培养物保藏中心（中国湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大 学）的保藏号为：CCTCC M 2014390。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种真菌的编码a _淀粉酶的基因，极其编码的蛋白 质。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述a _淀粉酶基因的重组载体。
[0009] 本发明的另一目的是提供包含上述a _淀粉酶基因的工程菌。
[0010] 本发明的另一目的是提供上述工程菌在动物饲料中的应用。
[0011] 本发明的具体方法步骤：
[0012] 1.从牛瘤胃中筛选耐高温酿酒酵母菌：取少许瘤胃液加入马铃薯-葡萄糖液体培 养基，39°C下富集耐高温酿酒酵母菌，然后在虎红培养基上39°C下分离耐高温酿酒酵母菌。 筛选在39°C下生长最旺盛的一株酿酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)，将其 接种在淀粉-Yro培养基平板上生长。
[0013] 2. a -淀粉酶基因重组载体的构建：从一种真菌基因组上PCR扩增a -淀粉酶基 因，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，有1485个碱基组成，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO. 2所示，有494个氨基酸组成。PCR两条引物的5'端有与大肠杆菌和酿酒酵母穿梭 表达质粒pAUR123(购自TaKaRa)相对应的酶切位点。PCR产物连接T-载体，转化大肠杆菌 测序。a -淀粉酶基因DNA序列测序正确的大肠杆菌提取质粒，该质粒与pAUR123载体用相 应的限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收对应的酶切片断。回收的a-淀粉酶 基因DNA片断和pAUR123载体片断用T4连接酶连接，然后转化大肠杆菌，通过测序验证是 否连接正确，从而完成a-淀粉酶基因重组载体（PAUR123-AMY)的构建。
[0014] 3.含a-淀粉酶基因的工程菌转化、用碳源为淀粉的培养基培养工程菌以及工程 菌a-淀粉酶活性的测定：优选耐高温酿酒酵母菌为宿主菌。从步骤2中转化的大肠杆菌中 提取质粒pAUR123_AMY，用醋酸锂法转化酿酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN) (具体步骤参见TaKaRa的pAUR123载体说明书），用含有AureobasidinA的YNB培养基筛 选到的阳性转化子，得到含有a -淀粉酶基因的工程菌。
[0015] 用碳源为淀粉的培养基培养工程菌，培养的菌液离心得到的上清就是a _淀粉酶 的粗酶液。a-淀粉酶活性的测定采用二硝基水杨酸法。
[0016] 4.工程菌在动物饲料中的应用：过0.5mm筛的黄豆粉、干稻草粉和可溶性淀粉，按 5 : 3 : 1比例配成人工饲料。瘤胃液从装有永久瘤胃瘘管的成年肉牛瘤胃内采集，在厌 氧状态下用四层医用纱布过滤，得到备用瘤胃液。向15个IOOml培养瓶中分别加入经准确 称量的人工饲料〇. 4g、瘤胃液IOml和人工唾液10ml，然后将15个培养瓶分成3组，每组5 个，第一组加Iml经过离心的不含菌体的原始菌培养液，第二组加Iml培养原始菌的菌液， 第三组加Iml培养工程菌的菌液。整个操作过程在是充满N 2无O2的状态下完成的。加好 料的15只培养瓶密封后充分混匀，在39°C下恒温培养。
[0017] 分别取发酵12、18和24h的发酵液样品，用碘液检测发酵液是否还存在淀粉残留； 取发酵24h的发酵液样品，用气相色谱法测定样品中的总挥发性脂肪酸的浓度，用嘌呤法 测定样品中的微生物蛋白质含量，用比色法测定样品中氨态氮的浓度。
[0018] 本发明所具有的优点：
[0019] 1.由于本发明的工程菌能够利用淀粉作为碳源，而可以不必利用价格相对昂贵的 葡萄糖作为碳源，这就给生产菌体节约了大量的成本。
[0020] 2.在瘤胃发酵中，工程菌能促进饲料中淀粉的利用率，从而提高饲料的利用率。
[0021] 3.在瘤胃发酵中，工程菌能提高促进动物生长的挥发性脂肪酸和微生物蛋白的含 量。
[0022] 4.在瘤胃发酵中，工程菌能降价对动物有毒害作用的氨态氮，有利于动物的康健 生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为筛选的耐高温酿酒酵母菌在淀粉-Yro培养基平板上生长的情况。
[0024] 图2为Xbal和Hpal双酶切后纯化的穿梭质粒pAUR123的DNA片断和淀粉酶基因 DNA片断。泳道1为双酶切后纯化的穿梭质粒pAUR123的DNA片断，泳道2为双酶切后纯化 的淀粉酶基因DNA片断，泳道Ml为Ikb DNAMarker，泳道M2为DL2000DNAMarker。
[0025] 图3为含有a -淀粉酶基因重组载体（PAUR123-AMY)的构建图。
[0026] 图4为含有a -淀粉酶基因的阳性转化子，即所要的工程菌。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
[0028] 实施例1
[0029] 从牛瘤胃中筛选耐高温酿酒酵母菌：取少许瘤胃液加入马铃薯-葡萄糖液体培养 基，39°C下富集耐高温酿酒酵母菌，然后在虎红培养基上39°C下分离耐高温酿酒酵母菌。筛 选在39°C下生长最旺盛的一株酿酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)(在中国 典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC M 2014390)，其在淀粉-YH)培养基平板上生长的 情况如图1所示。
[0030] 马铃薯-葡萄糖液体培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L。马铃薯去皮切片 200g，加水煮沸30min，纱布过滤，加入葡萄糖20g，补足蒸馏水1L，自然PH。
[0031] 虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5. Og/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4L Og/L, MgSO4O. 5g/L，孟加拉红 0? 033g/L，氯霉素 0? lg/L，琼脂 15g/L。
[0032] 淀粉-YH)培养基：可溶性淀粉10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L， 琼脂15g/L。
[0033] 实施例2
[0034] a-淀粉酶基因重组载体的构建：从一种真菌基因组上PCR扩增a-淀粉酶基因， 其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，有1485个碱基组成，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO. 2所示，有494个氨基酸组成。PCR两条引物的5'端分别有与穿梭质粒pAUR123相对应 的Xbal和Hpal酶切位点。PCR产物连接T-载体，转化大肠杆菌DH5a测序。
[0035] PCR 的引物，Up : TCTAGAATGCAAATTTCAAAAGCTGCTTTGCTTG ;
[0036] Down ：GTTAACTCATGAACAAATGTCAGAAGCATATTTAG
[0037] PCR 反应体系（50 ii L):
[0038]
【权利要求】
1. 一株耐高温的酿酒酵母菌FCN(Saccharomyces cerevisiae FCN)，其在中国典型培 养物保藏中心的保藏号为：CCTCC Μ 2014390。
2. -种编码α -淀粉酶的基因，其特征在于有1485个核苷酸序列：SEQ ID No. 1。
3. 如权利要求2所述的α-淀粉酶基因所编码的α-淀粉酶蛋白质，基特征在于有494 个氨基酸序列：SEQ ID No. 2。
4. 如权利要求2所述α -淀粉酶基因的重组质粒PAUR123-AMY，其特征在于将权利要 求2所述α -淀粉酶的基因克隆到pAUR123酵母表达载体中所得。
5. 含有权利要求权4所述重组质粒的重组工程菌，其特征一在于优选酿酒酵母菌为宿 主，其特征二在于耐高温，其特征三在于以权利要求1所述的酿酒酵母为原始出发菌株，其 特征四在于能够表达权利要求3所述的α-淀粉酶。
6. 利用淀粉为碳源生产如权利要求5所述的重组工程菌。
7. 如权利要求5所述的重组工程菌在动物饲料中的应用。
【文档编号】C12N1/19GK104293688SQ201410464589
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】王东升, 黄黄, 黄江丽, 张国华, 田晓娟, 于一尊, 丁建南 申请人:江西省科学院生物资源研究所