一种多级连续发酵生产丁二酸的方法
【专利摘要】一种多级连续发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液；第二步，对串联发酵罐组、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理；第三步，取灭菌后的血清瓶，接入灭菌后的种子培养基，通入CO2后再接入产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes）NJ113摇床培养后作为发酵菌种；第四步，多级连续发酵。由于本发明生产方法简单，丁二酸的产率和纯度高，适合产业化生产。
【专利说明】一种多级连续发酵生产丁二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于丁二酸制备领域，具体涉及一种多级连续发酵生产丁二酸的方法。
【背景技术】
[0002] 丁二酸，又名琥拍酸（succinate acid),是一种常见的天然有机酸，是三羧酸循环 的中间代谢产物之一，广泛存在于动、植物和微生物中。作为一种重要的碳四平台化合物， 丁二酸是重要的中间产物和1，4-丁二醇（BDO)、丁内酯、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮 (NMP)、已二酸、苹果酸以及新型的生物降解塑料产品聚丁二酸丁二醇酯（PBS)等专业化学 制品的前体物质，这些化学品的市场总额达150亿美金。最新的研究结果还表明丁二酸在 生物降解塑料的制备应用方面具有非常广阔的前景。将丁二酸与1，4-丁二醇进行聚合反 应可生成一类新型的生物降解塑料产品--聚丁二酸丁二醇酯（PBS)。
[0003] 丁二酸的合成方法有化学法和生物法，目前工业应用的主要为化学法生产丁二 酸。化学法主要有催化加氢法、石蜡氧化法、电化学合成法。但是化学法主要利用不可再生 的石油资源作为原料，成本高，污染严重而且无法可持续发展，严重限制了丁二酸的发展。 近年来，随着石化资源的日益枯竭，环境危机日益加剧，越来越多的国内外研究者将目光放 在了生物法制备丁二酸上。与传统化学法相比，生物法具有明显的优势。生物法发酵丁二 酸具有成本低、优良的环境效益以及具有固定温室气体C0 2等优势。丁二酸是三羧酸循环 的中间代谢产物，也是众多厌氧微生物和兼性厌氧微生物的还原性终端代谢产物，几乎所 有的动植物均能合成丁二酸，常用微生物有产琥珀酸厌氧螺菌，产琥珀酸放线杆菌，大肠杆 菌，谷氨酸棒杆菌，曼海姆产琥珀酸菌等。
[0004] 中国专利CN101857888 A公开了一种利用乳清发酵生产丁二酸的方法，采用产琥 拍酸放线杆菌swcciflogefles NJ113在含30?100g/L乳糖的乳清的培养 基中发酵产琥珀酸，产物浓度高达47. 51g/L，收率高达67. 9%。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多级连续发 酵生产丁二酸的方法，制备过程简单，丁二酸产量高。
[0006] 技术方案：为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案： 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤： 第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液； 第二步，对发酵罐、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补 料罐培养液、培养基补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理； 第三步，取灭菌后的血清瓶，接入灭菌后的种子培养基，通入co2后再接入产琥珀酸放 线杆菌)NJ113摇床培养后作为发酵菌种； 第四步，多级连续发酵，将灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入初始发酵培养 基，通入气体，再按照接种量体积比为3-10%接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐 流入二级发酵罐、三级发酵罐，依次流到最后一级发酵罐中，通过调节通气量、一级发酵罐 的初糖浓度、各级发酵罐的补糖速率、发酵液流出速率和发酵液流入速率控制各级发酵罐 内的糖浓度，通过控制各级发酵罐中细胞生物量和细胞回流速率来完成丁二酸的发酵，发 酵全程pH为6. 5-7. 5,温度为35-40°C进行50-750h。
[0007] 作为优选的是，当发酵罐数量为3个时，该三级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级： 90%-80%残糖；二级：60%-45%残糖；三级：15%-0%残糖； 当发酵罐数量为4个时，该四级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级： 70%-55%残糖；三级：40%-25%残糖；四级：15%-0%残糖； 当发酵罐数量为5个时，该五级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级： 75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖； 当发酵罐数量为6个时，该六级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二级： 80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：50%-40%残糖；五级：30%-20%残糖；六级：15%-0% 残糖； 当发酵罐数量为7个时，该七级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二 级：80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：60%-45%残糖；五级：45%-35%残糖；六级： 35%-15%残糖；七级：15%-0%残糖。
[0008] 作为优选的是，第四步，所述气体为体积比为1:1的〇)2和!12的混合气、纯C0 2或 纯队中的一种，通气量为0.01-0.04 L/ (min*L)。
[0009] 作为优选的是，第四步，一级发酵罐的初糖浓度为50- 150 g/L，各级发酵罐的补 糖速率为10-40 ml/h，发酵液流出速率为40-160 ml/h，发酵液流入速率为10-150 ml/h，细 胞回流速率10-50 ml/h。
[0010] 作为优选的是，碳源补料罐培养液为葡萄糖溶液、蔗糖溶液、淀粉糖化液、糖蜜或 木质纤维素水解液中一种。
[0011] 作为优选的是，第四步，pH通过加入碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾 或氢氧化镁中的一种或多种来调节。
[0012] 有益效果 本发明利用多级连续发酵生产丁二酸的方法简单，易操作，与现有发酵技术相比，丁二 酸的产量高，适合工业化操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为丁二酸标准品的高效液相色谱图； 图2为实施例1的发酵产物的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0014] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
[0015] 本发明所说的多级连续发酵是根据串联发酵罐的个数来定，如串联三个发酵罐即 为三级连续发酵，其中第一个发酵罐为一级发酵罐，第二个发酵罐为二级发酵罐，第三个发 酵罐为三级发酵罐。
[0016] 实施例1 一种多级连续发酵装置生产丁二酸的方法，包括以下步骤： 第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液， 配方如下： 种子培养基（g · L_〇 :葡萄糖10 (分消），酵母膏5,玉米浆5, NaHC03 10, NaH2P04 · 2H20 9· 6, Κ2ΗΡ04 · 3H20 15. 5, pH 7· 0。
[0017] 初始发酵培养基（g·!/1):葡萄糖40(分消），酵母膏10,玉米浆10,乙酸钠1.36， ΚΗ2Ρ04 3, MgCl2 · 6H20 0· 2, CaCl2 0· 2, NaCl 1，Na2HP04 · 12H20 0· 31，NaH2P04 · 2H20 1. 6， pH 7. 0。
[0018] 碳源补料罐培养液（g · L_〇 :葡萄糖750。
[0019] 培养基补料罐培养液（g · Γ1):酵母膏30,玉米浆30,乙酸钠4. 08, ΚΗ2Ρ04 9， MgCl2 · 6H20 0· 6, CaCl2 0· 6, NaCl 3, Na2HP04 · 12H20 0· 93, NaH2P04 · 2H20 4. 8, pH 7. 0。
[0020] 第二步，取五个1L发酵罐、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培 养基、碳源补料罐培养液、培养基补料罐培养液以及l〇〇ml的血清瓶在121°C下灭菌15分 钟，备用； 第三步，取灭菌后的血清瓶，接入20ml的种子培养基，通入C02，再接入产琥珀酸放线 杆菌NJ113,摇床37°C转速为180 rpm下培养10小时，作为发酵菌种； 第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵培养 基，通入体积比为1:1的C02和H2混合气，利用储气罐控制通气量为0. 02 L/(min*L)，按照 接种量为1〇%(ν/ν)接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级， 利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率20-30ml/h，葡萄糖补糖速率为10-20 ml/h，发酵液流出速率为40-50 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过 程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60% 残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用氢氧化钠控制 pH为6. 5,发酵温度：37°C，控制细胞回流速率10 ml/h，发酵120 h后，取发酵产物进行高 效液相色谱分析，并测定发酵产物的量。
[0021] 实施例2 第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为200g/L蔗糖溶液。
[0022] 第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵 培养基，通入体积比为1:1的C0 2和H2混合气，利用储气罐控制通气量为0. OIL/ (min*L)， 按照接种量为10% (v/V)接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到 五级，利用碳源补料罐和培养基补料罐控制发酵液流入速率120-150 ml/h，蔗糖补糖速率 为30 ml/h，发酵液流出速率为150-160 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为150g/L，在连 续发酵过程中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级： 75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用氢氧 化镁控制pH为6. 5,细胞回流速率50 ml/h，发酵120 h后，取发酵产物进行高效液相色谱 分析，并测定发酵产物的量。
[0023] 实施例3 第一步至第三步同实施例2。
[0024] 第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵 培养基，利用储气罐控制纯N2,通气量为0. 04 L/ (min*L)，按照接种量为10% (v/v)接入 发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培养 基补料罐控制发酵液流入速率90-110 ml/h，蔗糖补糖速率为20 ml/h，发酵液流出速率为 110 -140ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为80g/L，在连续发酵过程中各级发酵罐中糖浓 度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级：55%-40%残 糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用碳酸钠控制pH为6. 5,细胞回流速率 40 ml/h，发酵120 h后，取发酵产物进行高效液相色谱分析，并测定发酵产物的量。
[0025] 实施例4 第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为淀粉糖化液。
[0026] 第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵 培养基，通入纯N 2，利用储气罐控制通气量为0. 01 L/ (min*L)，按照接种量为10% (v/v)接 入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培 养基补料罐控制发酵液流入速率50-70 ml/h，淀粉糖化液补糖速率为30-40 ml/h，发酵液 流出速率为80-110 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过程中各级发 酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级： 55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用碳酸钾和碳酸镁混合控制 pH为6. 5,细胞回流速率30 ml/h，发酵120 h后，测定发酵产物的量。
[0027] 实施例5 第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为糖蜜。
[0028] 第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵 培养基，通入纯C0 2，利用储气罐控制通气量为0. 02 L/ (min*L)，按照接种量为10% (v/v) 接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和 培养基补料罐控制发酵液流入速率110-130 ml/h，糖蜜补糖速率为30-40 ml/h，发酵液流 出速率为140-160 ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过程中各级发 酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残糖；三级： 55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用氢氧化钾控制pH为6. 5， 细胞回流速率50 ml/h发酵120 h后，测定发酵产物的量。
[0029] 实施例6 第一步至第三步同实施例1，其中碳源补料罐培养液为木质纤维素水解液。
[0030] 第四步，将五个灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入600ml的初始发酵 培养基，通入纯N 2，利用储气罐控制通气量为0. 04 L/ (min*L)，按照接种量为10% (v/v)接 入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐流入二级、三级直到五级，利用碳源补料罐和培 养基补料罐控制发酵液流入速率120-130 ml/h，木质纤维素水解液补糖速率为30-40 ml/ h，发酵液流出速率为150-160ml/h，使得一级发酵罐中初糖浓度为50g/L，在连续发酵过程 中各级发酵罐中糖浓度相对发酵初始糖浓度依次为一级：95%-85%残糖；二级：75%-60%残 糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖，全程使用碳酸钠控制pH 为6. 5,细胞回流速率50 ml/h，发酵120 h后，测定发酵产物的量。
[0031] 对比例1 以目前文献报道的连续发酵产丁二酸，以A 供《μ 130Z为出发菌株，采用单 级连续发酵的方式，控制葡萄糖糖浓度为20g/L，稀释率为0. 2-1. 2, 丁二酸的最高浓度只 有 10. 4g/L。
[0032] 对比例2 以A swcciflici/Trot/wcefls ATCC No. 29305为出发菌株，采用单级连续发酵的方式， 控制乳糖浓度为20g/L，稀释率为0. 03-0. 14, 丁二酸的最高浓度只有14. Og/L。
[0033] 将本发明的发酵产物进行液相色谱分析后，与丁二酸标准品的高效液相色谱图对 t匕，确定本发明的发酵产物为丁二酸。与现有技术相比，本发明发酵生产丁二酸的产量高， 工艺简单，适合规模化生产发酵，其中表1为本发明不同实施例发酵得产物的量。
[0034] 表1本发明不同实施例发酵得产物的量
【权利要求】
1. 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤： 第一步，配种子培养基、初始发酵培养基、碳源补料罐培养液和培养基补料罐培养液； 第二步，对发酵罐、碳源补料罐、培养基补料罐、种子培养基、初始发酵培养基、碳源补 料罐培养液、培养基补料罐培养液以及血清瓶进行灭菌处理； 第三步，取灭菌后的血清瓶，接入灭菌后的种子培养基，通入co2后再接入产琥珀酸放 线杆菌)NJ113摇床培养后作为发酵菌种； 第四步，多级连续发酵，将灭菌后的发酵罐串联后，在一级发酵罐中接入初始发酵培养 基，通入气体，再按照接种量体积比为3-10%接入发酵菌种，初始发酵培养基从一级发酵罐 流入二级发酵罐、三级发酵罐，依次流到最后一级发酵罐中，通过调节通气量、一级发酵罐 的初糖浓度、各级发酵罐的补糖速率、发酵液流出速率和发酵液流入速率控制各级发酵罐 内的糖浓度，通过控制各级发酵罐中细胞生物量和细胞回流速率来完成丁二酸的发酵，发 酵全程pH为6. 5-7. 5,温度为35-40°C进行50-750h。
2. 根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于： 当发酵罐数量为3个时，该三级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：90%-80%残糖；二级： 60%-45%残糖；三级：15%-0%残糖； 当发酵罐数量为4个时，该四级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级： 70%-55%残糖；三级：40%-25%残糖；四级：15%-0%残糖； 当发酵罐数量为5个时，该五级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-85%残糖；二级： 75%-60%残糖；三级：55%-40%残糖；四级：35%-20%残糖；五级：15%-0%残糖； 当发酵罐数量为6个时，该六级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二级： 80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：50%-40%残糖；五级：30%-20%残糖；六级：15%-0% 残糖； 当发酵罐数量为7个时，该七级发酵罐各级罐内糖浓度为：一级：95%-90%残糖；二 级：80%-70%残糖；三级：70%-60%残糖；四级：60%-45%残糖；五级：45%-35%残糖；六级： 35%-15%残糖；七级：15%-0%残糖。
3. 根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：第四步，所述气 体为体积比为1:1的〇)2和!1 2的混合气、纯C02或纯队中的一种，通气量为0.01-0.04L/ (min*L)〇
4. 根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：第四步，一级发 酵罐的初糖浓度为50- 150 g/L，各级发酵罐的补糖速率为10-40 ml/h，发酵液流出速率为 40-160 ml/h，发酵液流入速率为10-150 ml/h，细胞回流速率10-50 ml/h。
5. 根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：碳源补料罐培 养液为葡萄糖溶液、蔗糖溶液、淀粉糖化液、糖蜜或木质纤维素水解液中一种。
6. 根据权利要求1所述多级连续发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：第四步，pH通过 加入碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁中的一种或多种来调节。
【文档编号】C12R1/01GK104152497SQ201410459744
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】陈可泉, 王震, 何珣, 肖文, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学