一株拟微绿球藻突变株及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一株拟微绿球藻突变株及其应用，本发明的拟微绿球藻突变株的分类学命名为Nannochloropsis sp.。本发明的拟微绿球藻突变株具有高温和杀虫剂耐受能力强、油脂含量高、性能稳定、环境适应性强的优点。
CGMCC No9321
20140618
【专利说明】一株拟微绿球藻突变株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株拟微绿球藻突变株ENN11-5及其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，全球石油资源日趋枯竭，能源短缺问题日益严重，同时环境污染、生态破 坏等问题日益严重，开发绿色、清洁的生物燃料代替传统石化燃料，已成为国际研究热点。 在生物燃料的众多原料中，微藻具有光合作用效率高、生长周期短、含油量高、环境适应性 强、易于遗传改良等特点，被认为是最有潜力替代石油的生物质资源。微藻生物质经过生物 冶炼不仅能生产出生物柴油、优质航空汽油等多种生物燃料，而且还能开发出平台化合物、 高蛋白食品或饲料等产品，可广泛应用于工农业和交通领域。
[0003] 拟微绿球藻（Nannochloropsis sp.)是一种重要的海产经济微藻，其生长速度快， 抗逆性强，脂肪酸组成简单，富含EPA，是一种非常有潜力的藻种。拟微绿球藻的最适生长温 度为25°C?30°C，当温度超过35°C时，生长受抑制，如果长期处于高温将导致藻细胞逐渐 死亡。我国大部分地区夏季炎热高温，拟微绿球藻难以在夏季进行大规模养殖。另外，微藻 室外大规模培养中，容易滋生原生动物、细菌等污染，严重污染藻株的生长。使用杀虫剂虽 然能有效抑制污染，但会伤害藻株，导致藻细胞活性下降而减产，杀虫剂浓度过高时会造成 藻细胞死亡。如果能通过诱变获得耐受杀虫剂和高温的藻株，将减少因使用杀虫剂和高温 带来的减产问题，对拟微绿球藻稳定、高产养殖具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 针对已有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株拟微绿球藻突变株及其应用。
[0005] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一株拟微绿球藻突变株ENN11-5,为Nannochloropsis sp.，保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，邮政编码：100101，保藏日期为2014年6月18日，保藏编号为CGMCC No. 9321。
[0007] 本发明分离的拟微绿球藻突变株ENN11-5具有杀虫剂和高温耐受能力强，油脂含 量高，性能稳定、环境适应性强的优点。
[0008] 本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-5的培养方法，所述方法包括：将拟微 绿球藻藻株ENN11-5绿色细胞接种在海水培养基中，其中光照强度为50-500 μ mol/m2. s， pH值为7-9,温度为25-42°C。
[0009] 本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-5在拟微绿球藻高温养殖中的应用。
[0010] 优选地，所述高温为38-42 °C。
[0011] 本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-5在拟微绿球藻养殖中使用杀虫剂时 的应用。
[0012] 优选地，所述杀虫剂的有效氯浓度为25ppm。
[0013] 本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-5在脂肪酸生产中的应用。
[0014] 本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENNl 1-5在营养品、饲料或饵料生产中的应 用。
[0015] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0016] 本发明分离得到的拟微绿球藻突变株具有杀虫剂和高温耐受能力强、油脂含量 高、性能稳定、环境适应性强的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是在3cm柱式反应器中常规培养本发明的拟微绿球藻ENN11-5的生长曲线 图。
[0018] 图2是在5cm柱式反应器中常规培养本发明的拟微绿球藻ENN11-5的生长曲线 图。
[0019] 图3是在3cm柱式反应器中杀虫剂压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-5的生长 曲线图。
[0020] 图4是在5cm柱式高温压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-5的温度变化曲线 图。
[0021] 图5是在5cm柱式高温压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-5的生长曲线图。
【具体实施方式】
[0022] 为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的 实施例如下：
[0023] 在本发明的一种典型的实施方式中，本发明分离的拟微绿球藻突变株ENN11-5,为 Nannochloropsis sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC), 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101,保藏日期为2014年6月18 日，保藏编号为CGMCC No. 9321。
[0024] 本发明分离的拟微绿球藻突变株ENN11-5具有杀虫剂和高温耐受能力强、油脂含 量高、性能稳定、环境适应性强的优点。
[0025] 本发明提供的拟微绿球藻 ENN11-5 可以在 25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、 31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C、41°C 或 42°C下生长。
[0026] 本发明提供的拟微绿球藻ENN11-5可以在5ppm、10ppm、15ppm、20ppm或25ppm的 有效氯压力下生长。
[0027] 本发明的拟微绿球藻突变株ENN11-5的培养方法，包括将拟微绿球藻藻 株ENN11-5绿色细胞接种在海水培养基中进行培养，其中光照强度为50 μ mol/ m2· s-500ymol/m2· s，pH 值为 7-9,温度为 25°C -42°C。
[0028] 在本发明的拟微绿球藻ENNl 1-5的培养方法中，光照强度可以为50 μ mol/m2. s、 100 μ mol/m2· s、150 μ mol/m2· s、200 μ mol/m2· s、250 μ mol/m2· s、300 μ mol/m2· s、350 μ mol/ m2· s、400 μ mol/m2· s、450 μ mol/m2· s 或 500 μ mol/m2· s ;pH 值可以为 7、7· 2、7· 5、7· 8、8、 8· 1、8· 5、8· 8 或 9 ;温度可以为 25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、3rC、32°C、33°C、34°C、 35°C、36°C、37t：、38t：、39t：、4(rC、4rC*42t：。
[0029] 本发明的拟微绿球藻ENNl 1-5可以应用在拟微绿球藻高温养殖中，其中，所述高 温可以是 38°C、39°C、40°C、41°C或 42°C。
[0030] 本发明的拟微绿球藻ENN11-5可以应用在拟微绿球藻养殖中使用杀虫剂的环境 下，所述杀虫剂的有效氯浓度为25ppm。
[0031] 本发明的拟微绿球藻ENN11-5可以应用在脂肪酸的生产中，所述脂肪酸是癸酸、 月桂酸、豆蘧酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、Y -亚麻酸、花生四 烯酸和/或二十碳五烯酸。
[0032] 本发明的拟微绿球藻ENNl 1-5可以应用在营养品、饲料或饵料的生产中，所述营 养品、饲料或饵料是包含癸酸、月桂酸、豆蘧酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、 十八碳二烯酸、Y -亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的营养品、饲料或饵料。
[0033] 以下将结合【具体实施方式】和具体实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0034] 具体实施例IENNl 1-5藻株的筛诜和获得
[0035] 将Nannochloropsis sp.的无菌藻液经EMS诱变处理，加入次氯酸钠杀虫剂和轻 脯氨酸反复压力处理和初筛、复筛，最终获得一种性能优良的突变株ENN11-5。该突变藻株 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9321。
[0036] 具体实施例2ENN11-5常规培养评价
[0037] I) 3cm柱式反应器评价：将处在对数生长期的ENN11-5绿色游动细胞接种在配制 好的海水培养基中，使细胞密度达到OD75tl为0. 8-1. 2之间，以野生型ENNll为对照。培养 过程光照强度控制在50-500umol/m2. s，L :D = 16 :8光暗周期培养。在培养期内，通过向培 养液中通入1. 5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培 养所使用的反应器为30_内径、长度600_的柱式反应器。培养8天，测定藻株生长曲线。
[0038] 如图1所示，常规条件下培养ENN11-5生长明显优于野生株ENN11，生长速度较对 照株提商31. 6 %。
[0039] 2) 5cm柱式反应器评价：将处在对数生长期的ENN11-5绿色游动细胞接种在配制 好的海水培养基中，使细胞密度达到OD75tl为0. 8-1. 2之间，以野生型ENNll为对照。培养 过程光照强度控制在50-500umol/m2. s，L :D = 16 :8光暗周期培养。在培养期内，通过向培 养液中通入1. 5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培 养所使用的反应器为50_内径、长度600_的柱式反应器。培养7天，测定藻株生长曲线。
[0040] 如图2所示，常规条件下培养ENN11-5生长明显优于野生株ENN11，生长速度较对 照株提商24. 0 %。
[0041] 具体实施例3ENN11-5杀虫剂压力培养评价
[0042] 将处在对数生长期的ENN11-5绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基中，使 细胞密度达到OD 75tl为0. 8-1. 2之间，以野生型ENNll为对照。培养过程光照强度控制在 50-500umol/m2. s，L :D = 16 :8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1. 5-2% 的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为 30mm内径、长度600mm的柱式反应器。接种初始加入有效氯25ppm压力，避光处理8小时， 再光照培养，培养8天，测定藻株生长曲线。
[0043] 如图3所示，加入有效氯压力后，野生株ENNll受到明显抑制，基本停止生长甚至 变黄死亡，而ENNl 1-5能恢复后继续生长，耐杀虫剂能力明显优于对照株。
[0044] 具体实施例4ENN11-5高淵压力培养评价
[0045] 将处在对数生长期的ENN11-5绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基中，使 细胞密度达到OD 75tl为0. 8-1. 2之间，以野生型ENNll为对照。培养过程光照强度控制在 50-500umol/m2. s，L :D = 16 :8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1. 5-2% 的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为 50mm内径、长度600mm的柱式反应器。冷暖水机控温，第3d开始高温处理，藻液温度达到 38°C，第4d至第6d，每天有6h藻液温度都达到42°C (温度变化如图4所示）。培养6天， 测定藻株生长曲线。
[0046] 如图5所示，高温处理开始后，野生型ENNll生长放缓，在生长第5天生物量开始 下降，高温抑制明显。相比野生株，高温对ENN11-5生长抑制程度相比要低，生长速度总体 高于野生株。高温处理后生长速度较对照株提高15. 7%。
[0047] 具体实施例5ENN11-5藻株的油脂含量
[0048] 将处在对数生长期的ENN11-5绿色游动细胞接种在30mm内径、长度600mm的柱式 反应器中，使用海水培养基进行培养。培养过程光照强度控制在50-500umol/m 2. s，L :D = 16 :8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入I. 5-2%的二氧化碳和空气的混合 气体，将培养基的PH值调节在7-9之间。培养进行到第8天，将藻液收集，通过离心或自然 沉降的方法获得藻泥，将藻泥再进行真空冷冻干燥。
[0049] 干燥完成后，测定其油脂组分含量如下表1，分析方法如下：
[0050] 1)脂肪酸提取：
[0051] 取50mg或IOOmg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻 璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4ml 10% DMSO-Methanol溶液，40°C砂浴（盛砂的烧 杯放置恒温加热磁力搅拌器上）5分钟；然后在4°C下磁力搅拌抽提30分钟，3500转离心， 转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1:1的乙醚、正己烷4-8ml 4°C下磁力搅拌抽提 1小时，3500转离心，转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上 述合并抽提液中加入纯水使四者（水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷）体积比例为1: 1:1: 1， 震荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转 移到事先称重过的I. 5ml塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重。
[0052] 2)脂肪酸分析：
[0053] 照上面方法进行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820气相色谱仪进行气 相色谱分析（色谱条件为载气：氮气流量lml/min、氢气流量30ml/min、空气流量300ml/ min，进样口温度：280°C，检测器温度：280°C，检测器类型：FID，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱 (30mX0. 25mm，0. 25μηι)，分流比：4:1。分析方法：内标法（气相色谱用氮气作载气，相当 于液相色谱的流动相）。
[0054] 本实施例中没有实施措施诱导脂肪酸的积累，养殖8天脂肪酸含量达到42. 28%， EPA含量达到3.4%。如采取相应措施，脂肪酸含量会更高。
[0055] 表1气相色谱测定的ΕΝΝ11-5第8d收集样品的总脂组分：
[0056]
【权利要求】
1. 一株拟微绿球藻突变株ENN11-5,为Nannochloropsis sp.，保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 9321，保藏日期为2014年 6月18日。
2. 如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-5的培养方法，其特征在于，所述 方法包括将拟微绿球藻藻株ENN11-5绿色细胞接种在海水培养基中，其中光照强度为 50-500 ii mol/m2. s，pH 值为 7-9,温度为 25-42°C。
3. 如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-5在拟微绿球藻高温养殖中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高温为38-42°C。
5. 如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-5在拟微绿球藻养殖中使用杀虫剂时 的应用。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述杀虫剂的有效氯浓度为25ppm。
7. 如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-5在脂肪酸生产中的应用。
8. 如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-5在营养品、饲料或饵料生产中的应 用。
【文档编号】A23L1/29GK104371929SQ201410456584
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】李青, 吴洪, 罗少敬, 陈传红, 崔春莉 申请人:新奥科技发展有限公司