一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法

一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法，所述方法是将酿酒酵母的JJJ1基因敲除；本发明方法可以高效地获得对纤维素水解液抑制物耐性显著提升的酿酒酵母工程菌株，在多种抑制物(乙酸、糠醛、甲酸和5-羟甲基糠醛)存在时乙醇发酵速率明显提高，发酵时间缩短20h以上。该发明方法获得的酿酒酵母工程菌株更加适用于纤维素燃料乙醇发酵生产工艺。
【专利说明】一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法 一、

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种纤维乙醇发酵的方法，特别涉及一种提升酿酒酵母纤维乙醇发酵 性能的方法。 二、

【背景技术】
[0002] 由于石油、天然气和煤炭等化石燃料的储量有限和用量急增，伴随着环境污染等 系列问题，利用可再生物质生产清洁能源越来越被世界各国重视。生物燃料是具有良好发 展前景的可再生能源，其中以燃料乙醇发展最为迅速。纤维素是自然界中分布最广、含量最 多的一种多糖，可以水解成葡萄糖，用于燃料乙醇的生产。利用纤维素生产燃料乙醇，既有 助于缓解化石燃料短缺，改善环境，也有利于整个社会的可持续发展，实现人与环境的和谐 相处。
[0003] 当前，在纤维素原料预处理过程中（蒸汽爆破和酸处理），由于酸和热的作用，会 产生甲酸、乙酸、糠醛等一系列有害物质，其中乙酸所占比例最大。这些抑制物在高浓度条 件下会引起酵母细胞的生理代谢失衡甚至死亡，从而极大地限制纤维乙醇发酵效率。因此， 很有必要选育具有高抑制物耐受性的酿酒酵母菌株。通过寻找与细胞胁迫耐性相关的基 因，对酿酒酵母菌株进行基因工程改造，是提升酵母燃料乙醇发酵效率的一种重要育种策 略。酿酒酵母JJJl基因是热击蛋白HSP40家族中的一员，已有研究表明该基因编码的蛋白 可激活蛋白Ssalp的ATPase酶的活性，参与核糖体大亚基的合成，但未见关于该基因与纤 维素水解液中抑制物耐受性关系的报道。 三、


【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法，具体是构建纤 维素水解液高浓度抑制物耐受性的酿酒酵母菌株的方法，从而使其可以在高浓度抑制物存 在条件下快速高效的进行乙醇发酵，以改进现有技术中酿酒酵母发酵生成纤维乙醇受到乙 酸、糠醛、甲酸和5-羟甲基糠醛等抑制物影响的问题。
[0005] 本发明提供一种提高酿酒酵母纤维乙醇发酵性能的方法，所述方法是将酿酒酵 母的JJJl基因敲除（JJJl基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示，JJJl基因上下游延长 IOOObp的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示）。
[0006] 进一步，所述JJJl基因敲除是以PUG6质粒为PCR模板，在引物JJJlS和引物JJJlA 的作用下进行PCR扩增，获得2038bp的DNA片段作为JJJl基因敲除组件，然后将敲除组件 转入酿酒酵母，即获得提高纤维乙醇发酵性能的酿酒酵母；
[0007]引物 JJJlS 为：
[0008] 5'-GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGA CCAGCTGAAGCTTCGTACG-3' ；
[0009] 引物 JJJlA 为：
[0010] 5'-AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3' 。
[0011] 更进一步，所述酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) YJS329 (购自 CCTCC，编号为 CCTCC 2011275)。
[0012] 本发明所述提高酿酒酵母菌株纤维乙醇发酵性能的方法按如下步骤进行：
[0013] (I)JJJl基因敲除组件的获得
[0014] 根据已报道的酿酒酵母JJJl基因（GenBank号：NC_001146. 8)和PUG6质粒 (GenBank号：AF298793. 1)的序列设计一对引物JJJlS和JJJ1A，以pUG6质粒为PCR模板， 扩增获得长度为2038bp的JJJl基因敲除组件（核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示）。
[0015] JJJlS 为：
[0016] 5' -GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTG ACCAGCTGAAGCTTCGTACG-3'，
[0017] JJJlA 为：
[0018] 5' -AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3'。
[0019] (2)高纤维乙醇发酵性能菌株的构建
[0020] 将 IO8 个酿酒酵母 YJS329 细胞，50 μ 1 鲑鱼精 DNA 溶液（2mg/ml)，240 μ 1 50 % (w/v)的PEG3350溶液，36 μ I I. OM醋酸锂溶液，步骤⑴获得的DNA片段25 μ 1混匀后于 30°C培养箱培养半小时，42°C水浴热击40min，12000rpm离心Imin去上清，沉淀用Iml YPD 液体培养基重悬，30°C培养2-3h后，吸取100 μ 1培养液涂布含300 μ g/ml遗传霉素 G418的 YH)平板上，30°C培养。挑取单菌落抽提基因组DNA，用PCR方法验证是否为阳性转化子。分 别以敲除验证引物和JJJl基因内部引物进行PCR反应，所述敲除验证引物为KS和AJJJl， JJJl基因内部引物为JJJl-S和JJJl-A ;电泳检测JJJl基因内部引物扩增无条带而敲除验 证引物扩增的条带为1555bp的，判断为JJJl基因缺失的酿酒酵母菌株；
[0021] 引物 KS 为 5' -GATCGCGTATTTCGTCTCG-3' ；
[0022] 引物 AJJJl 为 5' -TTACTTGACGGAGCGCATT-3' ；
[0023] 引物 JJJl-S 为 5' -GAAGAACCAAGAGGGAAGT-3' ；
[0024] 引物 JJJl-A 为 5, -TGTAAGCCCTTGTCTCCTA-3'。
[0025] 所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YJS329菌体细胞制备方法为：将酿 酒酵母YJS329菌落接种到IOml YPAD (10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l 腺嘌呤半硫酸，溶剂为去离子水，pH5. 5)液体培养基中，30°C条件下培养16h，吸取Iml培养 液到25ml的2XYPAD(20g/l酵母粉，40g/l蛋白粉，40g/l葡萄糖，160mg/l腺嘌呤半硫酸， 溶剂为去离子水，PH5. 5)培养液中继续培养2-3h，然后吸取Iml培养液离心，无菌水洗两遍 获得菌体细胞。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明方法可以高效地获得对 纤维素水解液抑制物耐性显著提升的酿酒酵母工程菌株，在多种抑制物（乙酸、糠醛、甲酸 和5-羟甲基糠醛）存在时乙醇发酵速率明显提高，发酵时间缩短20h以上。该发明方法获 得的酿酒酵母工程菌株更加适用于纤维素燃料乙醇发酵生产工艺。 四、【专利附图】

【附图说明】：
[0027] 图1为pUG6质粒图谱。
[0028] 图2为JJJl基因敲除不意图。
[0029] 图3为JJJl基因敲除组件和阳性转化子电泳验证图，泳道1为实施例1中引物 (JJJ1S和JJJ1A)获得的敲除组件DNA产物，泳道2为实施例2中引物（KS和AJJJ1)获得 的产物，泳道3为实施例2中引物（JJJ1-S和JJJ1-A)获得的产物。
[0030] 图4菌株YJS329与菌株YJS △ JJJl对纤维素水解液中抑制物耐受性比较，a为菌 体浓度 3X 107cells/ml，b 为菌体浓度 3X 106cells/ml，c 为菌体浓度 3X 105cells/ml。
[0031] 图5为菌株YJS329与菌株YJS Λ JJJl纤维乙醇发酵性能比较。 五、【具体实施方式】：
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0033] YPAD液体培养基组成：10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l腺嘌呤 半硫酸，溶剂为去离子水，pH值为5. 5。
[0034] Yro液体培养基组成：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L，溶剂为去离 子水，pH值为5. 5。
[0035] 实施例I JJJl基因敲除组件DNA的构建
[0036] 根据已报道的酿酒酵母JJJl基因（GenBank号：NC_001146. 8)，以及pUG6质粒 (GenBank号：AF298793. 1)的DNA序列，设计一对引物JJJlS和JJJ1A，以pUG6质粒为模板 扩增JJJl基因敲除组件。组件的构成为JJJl基因左翼同源序列（41bp)+pUG6匹配序列 (18bp匹配同源可以重叠，加起来59bp)+loxp+G418筛选标记+loxp+pUG6匹配序列+JJJl 右翼同源序列。
[0037] JJJlS 为：
[0038] 5'-GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGA CCAGCTGAAGCTTCGTACG-3' ；
[0039] JJJlA 为：
[0040] 5'-AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3' 。
[0041] PCR反应体系为：5Xbuffer 10μ I ;dNTP 3μ 1 ;模板2μ 1 ;引物2μ I ;DNA聚合酶 0· 5 μ I (Prime star ;宝生物工程（大连）有限公司）；ddH2032. 5 μ 1，反应条件为：95°C预 变性5min ;98°C变性IOs ;61. 5°C退火15s ;72°C延伸2min。得到PCR扩增产物，PCR清洁回 收试剂盒（AXYGEN生物技术有限公司）回收后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为单一长 度为2038bp的DNA片段（图3中泳道1)，表明敲除组件构建成功，序列为SEQ ID NO: 1所 示：
[0042] GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGACCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG ACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGT CCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGG GCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGG CCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGT TGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATA CTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACT CACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGG GCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTA GCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAG CATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGA AGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTT GTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGAT GCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATT CTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTT GTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTT TCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTT GATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTT TTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCC CAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCG ATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGC TATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCGGCCGCGGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAG TCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATT GGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTC AAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGG CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGA CGCCGAAACAGAAATTATTAGTAGAGCTGTGTAGAGTTTAATTT
[0043] 实施例2 JJJl基因敲除菌株的构建
[0044] (1)酿酒酵母细胞获得：接种酿酒酵母菌株YJS329于YPAD液体培养基中， 30°C 200rpm培养12-16h，然后吸取Iml培养液到25ml 2 X YPAD培养液中，于30°C下200rpm 培养2-3h，然后取Iml培养液离心，无菌水洗两遍，获得待转化酿酒酵母细胞。
[0045] (2) JJJl基因敲除酿酒酵母菌株的构建：在步骤（1)制备的IO8酵母细胞中加入 50μ l、10mg/ml鲑鱼精DNA(沸水煮lOmin，置于冰水混合物冷却），240μ 1的500g/l的 PEG3350溶液；36 μ I I. OM醋酸锂溶液，25 μ 1基因敲除组件（实施例1中制备）。枪头吹 打混匀，30°C培养半小时后42°C水浴热击40min，12000rpm离心lmin，去上清，沉淀用Iml YH)液体培养基重悬，30°C、120rpm培养2-3h，吸取100 μ 1涂布于含终浓度400mg/L新霉素 G418(geneticin，G418 ;购自默克公司）的YPD平板上，30°C培养2天后，挑取单菌落抽取基 因组，用两对验证引物（KS和AJJJl JJJl-S和JJJ1-A)进行PCR反应来验证JJJl基因是 否被成功敲除。
[0046] 引物 KS 的序列为：5'-GATCGCGTATTTCGTCTCG-3' ；
[0047] 引物 AJJJl 为 5' -TTACTTGACGGAGCGCATT-3' ；
[0048] 引物 JJJl-S 为 5, -GAAGAACCAAGAGGGAAGT-3' ；
[0049] 引物 JJJl-A 为 5, -TGTAAGCCCTTGTCTCCTA-3'。
[0050] PCR反应体系为：10 μ 1的2XTaq MasterMix(康为世纪），1 μ 1引物，1 μ 1基因 组 DNA，8 μ I ddH20, PCR 反应条件为：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s ;5L 9°C和 50. 5°C退 火30s ;72°C延伸I. 5min。琼脂糖凝胶电泳后显示引物（JJJ1-S和JJJ1-A)无条带（图3 中泳道3)，而引物（KS和AJJJ1)的条带大小为1555bp (图3中泳道2)，判断为JJJl基因 缺失的酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母菌株YJS △ JJJl。
[0051] 实施例3菌株抑制物耐受性与发酵性能的比较
[0052] ⑴挑取YJS329和YJS Λ JJJl菌株接种至25ml YPD液体培养基中（20g/l葡萄糖、 20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物，溶剂为去离子水，pH值为5. 5)过夜培养，用无菌水将菌 体调整到3X 107cells/ml，并依此10倍稀释2个梯度。用移液枪吸取4 μ 1点样于对照YPD 平板和含多种纤维素水解液抑制物（下列抑制物同时加入，终浓度为：3g/l乙酸；0. 8g/l 糠醛；0. 2g/l甲酸和0. 3g/15-羟甲基糠醛）的YPD平板，点样后30°C恒温培养箱中培养5 天观察。图4显示YJS Λ JJJl较亲株YJS329对抑制物的耐受性有显著提高。
[0053] (2)接种上述培养的YJS329和YJSA JJJl的细胞至发酵培养基中（500ml锥形 瓶，每瓶200ml培养基，组成：10g/l葡萄糖，10g/l蛋白胨，5g/l酵母膏，3g/L乙酸，0.8g/ 1^糠醛，0.28/1甲酸和0.38/15-羟甲基糠醛，溶剂为去离子水，？!1值为4.5)，保证接种后 发酵液中的酵母细胞数约为l〇 7cells/ml，置于33?摇床培养，转数为IOOrpm,每隔8h左 右吸取ImL发酵样品，12000rpm离心lOmin，测定上清液中的葡萄糖和乙醇含量。图5显示 YJS △ JJJl较亲株的乙醇发酵速度和糖消耗速率有显著提高，总发酵时间约缩短21h。
【权利要求】
1. 一种提高酿酒酵母菌株纤维乙醇发酵性能的方法，其特征在于所述方法是将酿酒酵 母的JJJ1基因敲除。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述JJJ1基因敲除是以PUG6载体质粒为模 板，在引物JJJ1S和引物JJJ1A的作用下进行PCR扩增，获得2038bp的DNA片段作为JJJ1 基因敲除组件，然后将JJJ1基因敲除组件转入酿酒酵母，即获得提高纤维乙醇发酵性能的 酿酒酵母； 引物JJJ1S为： 5'-GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGACCAGC TGAAGCTTCGTACG-3' ； 引物JJJ1A为： 5'-AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTCGGCGTC GATTTTTGTGATG-3' 。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YJS329。
【文档编号】C12N15/87GK104278057SQ201410453324
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月6日 优先权日:2014年9月6日
【发明者】郑道琼, 张珂, 张黎杰, 李欧, 高克慧, 方雅红, 王品美, 吴雪昌 申请人:浙江大学