转基因水稻品系134Bt的外源插入片段旁侧序列、其扩增引物及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供一种转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的3’端和5’端旁侧序列及其应用以及所述旁侧序列的扩增引物。利用该旁侧序列作为目的DNA扩增片段，可以建立灵敏、特异性的转基因水稻品系134Bt的品系特异性定性PCR检测方法，可广泛用于生物【技术领域】中的转基因水稻的安全评估和检测。CGMCC No934920140714
【专利说明】转基因水稻品系134Bt的外源插入片段旁侧序列、其扩增 引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物【技术领域】，具体地，涉及一种转基因水稻品系134Bt外源插 入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物。此外，本发明还涉及所述旁侧序列和引 物进行转基因水稻品系检测或鉴定的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用， 已经有多个转基因水稻品系获准环境释放。对此，需要对转基因植物进行监督管理，保障其 健康发展。例如对转基因植物进行转化事件特异性的检测。
[0003] 转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之 一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物转化事件特异性检测方法的重要技 术资料。目前已经有部分专利和文献报道了关于转基因植物外源插入载体旁侧序列，如张 大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系M0N863的外源插入片段的旁侧序 列，建立了转基因 M0N863玉米品系的特异性检测方法；杨永义等分析了转基因水稻品系 223f-S21的外源插入片段的旁侧序列，并进一步建立了转基因系特异性PCR的检测方法， 张秀杰等公开了转基因水稻PA110-5品系特异性PCR定性检测引物及定性检测方法和试剂 盒。
[0004] 水稻品系134Bt是利用农杆菌介导的遗传转化方法，将人工改造后的cryIAcl基 因（GENBANK登记号：AY126450)导入江浙沪地区目前广泛种植的高产优质粳稻品种"秀水 134"中，通过分子手段筛选出具有crylAcl转录活性的单拷贝的、整合了完整目的基因且 T-DNA插入位点未打断已知功能基因的独立转化体，并通过后代自交分离筛选获得纯系。但 是，到目前为止，尚未建立关于转抗虫基因134Bt品系的特异性PCR检测方法。
【发明内容】
[0005] 针对上述技术问题，本发明的一个目的为提供一种转基因水稻品系134Bt的外源 插入片段的旁侧序列，并针对该旁侧序列提供对其进行特异性检测的DNA序列，例如PCR扩 增引物序列。本发明的另一个目的为提供所述旁侧序列和引物的应用，包括提供旁侧序列 或引物在检测水稻中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分中的用途，或者制备检测 水稻中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分的试剂盒中的用途。此外，本发明的又 一个目的为提供一种转基因水稻品系134Bt的检测方法。
[0006] 本发明的转基因水稻品系134Bt按如下方式获得：
[0007] 取授粉后12-15天的未成熟的秀水134水稻种子经70%乙醇表明消毒1分钟，于 NaClO溶液中（体积比1:4,加2-3滴吐温20)消毒90分钟,用无菌水冲洗4-5次,然后用 解剖刀和镊子挑出幼胚并接种于N6培养基上诱导愈伤组织，置于28°C，暗室培养，5天后获 得的初生愈伤组织用于转化。
[0008] 菌液的准备具体为：含pZTRT-Bt质粒（T-DNA结构域见图1，其构建参见Eun Hye Kim等人，Chloroplast-targeted expression of synthetic cryIAc in transgenic rice as an alternative strategy for increased pest protection, Planta(2009)230:39 7 - 405)的农杆菌离心收集后用含200 μ M的乙酰丁香酮（AS)AA液体培养基悬浮（简称 AA-AS);超净工作台上将幼胚诱导的初生愈伤组织置于农杆菌AA-AS悬浮液中20min，期间 不断摇动；倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上风干5?IOmin ;然后，转移至表面以无菌 滤纸覆盖的CC-AS (200 μ M)共培养培养基中，28°C黑暗条件下培养50?55小时；共培养后 的愈伤组织转移到含2. 0mg/L的2, 4-D和500mg/L头孢霉素的N6抑菌培养基中，使愈伤组 织恢复3?4天；愈伤组织转移到含2. 0mg/L的2, 4-D、500mg/L头孢霉素和5mg/L Basta 的N6筛选培养基上继代培养3-4次就可以获得抗性愈伤组织；抗性愈伤组织转移到再生培 养基获得转基因植株；再生植株转移到Yoshida营养液中水培过渡，后移栽入大田或温室 土培直到成熟，共获得12个独立转化体。
[0009] 利用荧光定量PCR方法对12个独立转化体分析插入基因拷贝数，具体方法为： 水稻基因组DNA提取采用CTAB法，用BioPhotometer分光光度计（Eppendorf公司）检 测DNA含量及纯度。水稻内标准基因鹿糖磷酸合成酶基因 （Sucrose phosphate synthase gene，SPS GeneBank No. U33175)引物序列参照 Ding 等报道（Ding J Y, Jia J W, Yang L T, et al. Validation of a rice specific gene, sucrose phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes· J Agric Food Chem，2004, 52(11) :3372-3377.),利用 Primer Premier 5软件设计了 CrylAcl引物序列（见表I)。引物由上海生物工程有限公司合成， 其核苷酸序列和扩增片段长度见表1。
[0010]定量 PCR 体系为：SYBR? Premix Ex Taq?(2X) 12. 5 μ I, PCR 上游引物 (10μπιο1/υ〇· 5μ 1，PCR下游引物（10μπιο1/υ〇· 5μ 1，DNA模板2μ 1，灭菌蒸馏水9· 5μ 1， 总体积25 μ 1。定量PCR的反应程序为（两步法PCR反应程序）：预变性95°C 30s，循环数 I :PCR反应第一步95°C 5s ;第二步，60°C退火延伸40s，共进行45个循环。荧光定量PCR仪 为ABI PRISM 7000Real-Time PCR system。每个试样做3个生物学重复,每个生物学重复 做3次技术重复。12个独立转化体中获得3个单拷贝转化体。
[0011] 表1定量PCR引物和探针序列
【权利要求】
1. 转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列为 如SEQ ID No: 1所示的3'端旁侧序列。
2. 转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列为 如SEQ ID No:2所示的5'端旁侧序列。
3. 如权利要求1和/或2所述的旁侧序列在检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻 品系134Bt来源的成分中的用途。
4. 如权利要求1和/或2所述的旁侧序列在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检 测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。
5. 转基因水稻品系134Bt的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括，通过检测待检 测水稻的基因组DNA中是否存在如权利要求1和/或2所述的旁侧序列或其片段，来检测 所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括，依据SEQ ID No: 1所示序列设计PCR扩增的正向引物和反向引物，以待检测水稻的基因组DNA作为模板， 采用所述正向引物和反向引物进行PCR扩增，通过检测是否扩增得到SEQ ID N〇:l所示序 列或其片段，检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分；和/或 依据SEQ ID N〇:2所示序列设计PCR扩增的正向引物和反向引物，以待检测水稻的基 因组DNA作为模板，采用所述正向引物和反向引物进行PCR扩增，通过检测是否扩增得到 SEQ ID N〇:2所示序列或其片段，检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成 分。
7. 根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，依据SEQ ID No: 1中第1-246位 序列设计正向引物，依据SEQ ID No: 1所示序列中第247-502位序列设计反向引物； 优选地，所述正向引物为SEQ ID N〇:3所示序列，所述反向引物为SEQ ID N〇:4所示序 列。
8. 根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，依据SEQ ID No:2中第1-298位 序列设计正向引物，依据SEQ ID N〇:2中第301-883位序列设计反向引物； 优选地，所述正向引物为SEQ ID No: 5所示序列，所述反向引物为SEQ ID No:6所示序 列。
9. 用于检测如权利要求1所述的旁侧序列的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列与 SEQ ID No: 1所示序列特异性退火； 优选地，所述DNA序列为PCR扩增SEQ ID No: 1所示序列的扩增引物； 更优选地，所述扩增引物为SEQ ID No:3所示的正向引物和SEQ ID No:4所示的反向 引物。
10. 用于检测如权利要求2所述的旁侧序列的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列与 SEQ ID No: 2所示序列特异性退火； 优选地，所述DNA序列为PCR扩增SEQ ID No: 2所示序列的扩增引物； 更优选地，所述扩增引物为SEQ ID No:5所示的正向引物和SEQ ID No:6所示的反向 引物。
11. 如权利要求9和/或10所述的DNA序列在检测水稻或其制品中是否含有转基因水 稻品系134Bt来源的成分中的用途。
12. 如权利要求9和/或10所述的DNA序列在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于 检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。
13. 检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求9和/或10所述的DNA 序列。
14. 如权利要求13所述的试剂盒在检测转基因水稻品系134Bt中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104388421SQ201410431657
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】朴钟泽, 杨瑞芳, 白建江, 方军, 李钢燮, 池铉昭, 朴成韩, 林惠敏 申请人:上海市农业科学院, 韩国农业科学技术院