一种食品中沙门菌的pcr检测方法
【专利摘要】本发明具体为一种食品中沙门菌的PCR检测方法。该检测方法包括以下步骤：（1）样品预处理：取样后加入无菌生理盐水溶解；（2）细菌培养：先进行前增菌再进行选择性增菌，并进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；（3）DNA提取：取菌悬液离心，沉淀洗涤，煮沸，悬浮菌体，冷却加入Tris-HCL缓冲液，离心，取上清作为模板；（4）PCR扩增：取沙门菌的引物对步骤（3）中的模板进行PCR扩增得PCR扩增产物；（5）PCR产物检测：取扩增产物，进行凝胶电泳成像。该检测方法可迅速检出食品中沙门菌，检测结果准确，敏感度及特异度高。
【专利说明】-种食品中沙门菌的PCR检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属食品安全检测领域，具体涉及食品中沙门菌的快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 沙门菌广泛存在于自然界，是引起食源性疾病的首要病原菌，人与动物均可感染， 人类感染沙门菌后可发生伤寒、副伤寒、胃肠炎等疾病，伤寒传染性强、病程长，患者需住院 隔离治疗，是我国《传染病防治法》中规定报道的乙类传染病。近年来，随着临床抗生素的 不合理应用，且病原菌耐药性的产生及变异增加，伤害早期诊断较困难，因此，有必要开发 灵敏的病原菌的早期检测方法。
[0003] 目前，公共卫生、食品安全及出入境检验检疫中均将沙门菌检测作为常规必需检 测的项目。经典的检测方法为血培养，阳性率可达60% -80%，但该检测方法耗时长，约 3-5d，且检出率受采血量及服用抗生素等多种因素影响，此外，分离培养也较困难，因此，准 确性及特异性均较差。近年来，有文献报道采用PCR方法检测食品中沙门菌，但这些方法大 多侧重于单一 PCR，而食品中沙门菌含量往往极低，传统的PCR检测则显示出明显缺陷。为 此，本发明提供一种特异性强灵敏度高的多重PCR检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明针对上述现有技术的不足，提供一种食品中沙门菌的快速检测方法，检测 结果准确，特异性及灵敏度均较高。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] -种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
[0007] (1)样品预处理：准确称取固体样品2_5g，粉碎，或量取液体样品5-10ml，在粉碎 后的固体样品及液体样品中加入无菌生理盐水进一步溶解；
[0008] (2)细菌培养：将待测样品置入培养基中培养4_6h，取2_5g培养后红色可疑菌落， 继续培养4_6h，将培养后的产物进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成 菌悬液；
[0009] (3) DNA提取：取步骤⑵中的菌悬液5-10ml，离心5-8min，沉淀洗漆，煮沸 5-8min，加入NaOH溶液悬浮菌体，冷却加入Tris-HCL缓冲液，离心，取上清l-3ul作为模 板；
[0010] (4)PCR扩增：取沙门菌的引物对步骤（3)中的模板进行PCR扩增；
[0011] 反应体系：10XPCR buffer 缓冲液 2. 5-5ul，Mg2+试剂 5-10ul，PCR 引物 5-10ul， Taq DNA聚合酶2_5ul，加纯化水补足至25ul ;
[0012] 反应过程：95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，进行30 个循环；最后72 °C延伸5min，得PCR扩增产物；
[0013] (5) PCR产物检测：取步骤（4)中反应得到的PCR扩增产物5-10ul，分别进行凝胶 电泳成像。
[0014] 优选的，所述的培养基为加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMagar显色增养基。
[0015] 优选的，所述的沉淀洗涤均采用PBS缓冲液，所述的沉淀洗涤重复操作2-5次。
[0016] 优选的，所述的NaOH溶液浓度为2-5mol/L，所述的Tris-HCL浓度为1. 2-1. 5mol/ L，PH 为 8. 2-8. 4。
[0017] 优选的，所述的离心速度为10000-12000转/min。
[0018] 步骤⑷中PCR扩增采用的PCR引物为：
[0019] Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ;
[0020] R：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0021] Hi la 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0022] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
[0023] 优选的，所述的Mg2+试剂选自MgCL2或MgS0 4的一种或多种，所述的Mg2+试剂浓度 % 1. 5-2. 0mmol/L〇
[0024] 优选的，所述的PCR引物浓度为为8-10mmol/L。
[0025] 优选的，所述的Taq DNA聚合酶浓度为2_5U/ul。
[0026] 本发明与现有技术相比，有益效果体现在：
[0027] 1.本发明先对细菌先进行前增菌，然后进行选择性增菌，并鉴定，可对食品中沙门 菌先进行定性检测，操作简便，为后续的PCR定量检测提供了条件。
[0028] 2.本发明中对待测样品进行细菌培养时，培养基不采用传统的NaCl肉汤，而是采 用加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMagar显色增养基，增菌效果好，多重PCR效果良好。
[0029] 3. Inva是调控沙门菌侵入上皮细胞的重要因子，也是产生致病性的重要因子， Hila也是毒力岛SP11基因之一，与沙门菌对肠道上皮细胞的侵袭有关，本发明选择沙门菌 特异的Inva及Hila基因，设计沙门菌PCR引物，进行二重PCR扩增，可特异性的检测沙门 菌，提高检测结果的特异性，减少假阳性。同时，对二重PCR扩增的反应条件进行了优化，避 免了引物间相互干扰，提高了检测结的敏感性。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1
[0031] 一种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
[0032] (1)样品预处理：准确称取白木耳2g，粉碎，加入无菌生理盐水进一步溶解；
[0033] (2)细菌培养：将步骤（1)中得到的白木耳置入加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的 CHRMagar显色增养基中培养4h，取2g培养后红色可疑菌落，继续培养4h，将培养后的产物 进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；
[0034] (3)DNA提取：取步骤（2)中的菌悬液5ml，离心5min，采用PBS缓冲液沉淀洗涤，重 复2次，煮沸5min，加入2mol/L NaOH溶液悬浮菌体，冷却加入浓度为1. 2mol/L，PH为8. 2 的Tris-HCL缓冲液，离心，离心速度为10000转/min取上清lul作为模板；
[0035] (4) PCR扩增：取沙门菌的引物对步骤⑶中的模板进行PCR扩增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0036] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0037] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0038] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0039] 反应体系：10XPCR buffer 缓冲液 2. 5ul，1. 5mmol/L 的 MgCl2 试剂 5ul，8mmol/L PCR引物5ul，2U/ul的Taq DNA聚合酶2ul，加纯化水补足至25ul ;
[0040] 反应过程：95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，进行30 个循环；最后72 °C延伸5min，得PCR扩增产物；
[0041] (5) PCR产物检测：取步骤（4)中反应得到的PCR扩增产物5ul，进行凝胶电泳成 像。
[0042] 实施例2
[0043] 一种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
[0044] (1)样品预处理：准确称取香菇5g，粉碎，或量取液体样品加入无菌生理盐水进一 步溶解；
[0045] (2)细菌培养：将待测样品置入加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMagar显色增 养基中培养h，取5g培养后红色可疑菌落，继续培养6h，将培养后的产物进行细菌鉴定，取 鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；
[0046] (3)DNA提取：取步骤（2)中的菌悬液10ml，离心8min，采用PBS缓冲液沉淀洗涤， 重复5次，煮沸8min，加入5mol/L的NaOH溶液悬浮菌体，冷却加入浓度为1. 5mol/L，PH为 8. 4的Tris-HCL缓冲液，离心，离心速度为12000转/min取上清3ul作为模板；
[0047] (4) PCR扩增：取沙门菌的引物对步骤⑶中的模板进行PCR扩增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0048] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0049] Hila ：F ：CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ；
[0050] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0051] 反应体系：10XPCR buffer 缓冲液 5ul，2. Ommol/L 的 MgS0410ul，lOmmol/L 的 PCR 引物10ul，5U/ul的Taq DNA聚合酶5ul，加纯化水补足至25ul ;
[0052] 反应过程：95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，进行30 个循环；最后72 °C延伸5min，得PCR扩增产物；
[0053] (5)PCR产物检测：取步骤（4)中反应得到的PCR扩增产物10ul，分别进行凝胶电 泳成像。
[0054] 实施例3
[0055] -种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
[0056] (1)样品预处理：准确量取碳酸饮料5ml，加入无菌生理盐水进一步溶解；
[0057] (2)细菌培养：将待测样品置入加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMagar显色增 养基中培养5h，取3g培养后红色可疑菌落，继续培养5h，将培养后的产物进行细菌鉴定，取 鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；
[0058] (3)DNA提取：取步骤（2)中的菌悬液8ml，离心6min，采用PBS缓冲液沉淀洗涤， 重复3次，煮沸6min，加入3. 5mol/L的NaOH溶液悬浮菌体，冷却加入1. 3mol/L，PH为8. 3 的Tris-HCL缓冲液，离心，离心速度为11000转/min，取上清2ul作为模板；
[0059] (4) PCR扩增：取沙门菌的引物对步骤⑶中的模板进行PCR扩增，Inva引物：F : CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ；
[0060] R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ；
[0061] Hi 1 a :F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ;
[0062] R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT ；
[0063] 反应体系：10XPCR buffer 缓冲液 4ul，1. 8mmol/L 的 MgCL2 试剂 8ul，9mmol/L 的 PCR引物5-10ul，3U/ul的Taq DNA聚合酶3. 5ul，加纯化水补足至25ul ;
[0064] 反应过程：95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，进行30 个循环；最后72 °C延伸5min，得PCR扩增产物；
[0065] (5) PCR产物检测：取步骤（4)中反应得到的PCR扩增产物5-10ul，分别进行凝胶 电泳成像。
[0066] 上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域 技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保 护范围之内。
【权利要求】
1. 一种食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 样品预处理：准确称取固体样品2-5g，粉碎，或量取液体样品5-10ml，在粉碎后的 固体样品及液体样品中加入无菌生理盐水进一步溶解； (2) 细菌培养：将待测样品置入培养基中培养4-6h，取2-5g培养后红色可疑菌落，继续 培养4-6h，将培养后的产物进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬 液； (3) DNA提取：取步骤（2)中的菌悬液5-10ml，离心5-8min，沉淀洗涤，煮沸5-8min，力口 入NaOH溶液悬浮菌体，冷却加入Tris-HCL缓冲液，离心，取上清l-3ul作为模板； (4) PCR扩增：取沙门菌的引物对步骤（3)中的模板进行PCR扩增； 反应体系：l〇XPCR buffer 缓冲液 2. 5-5ul，Mg2+试剂 5-10ul，PCR 引物 5-10ul，Taq DNA聚合酶2-5ul，加纯化水补足至25ul ; 反应过程：95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，进行30个循 环；最后72°C延伸5min，得PCR扩增产物； (5) PCR产物检测：取步骤（4)中反应得到的PCR扩增产物5-10ul，进行凝胶电泳成像。
2. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤⑵中所述 的培养基为加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMagar显色增养基。
3. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤⑶中所述 的沉淀洗涤均采用PBS缓冲液，所述的沉淀洗涤重复操作2-5次。
4. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤⑶中所述 的 NaOH 溶液浓度为 2-5mol/L，所述的 Tris-HCL 浓度为 1. 2-1. 5mol/L，PH 为 8. 2-8. 4。
5. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤⑶中所述 的离心速度为10000-12000转/min。
6. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤（4)中PCR 扩增采用的PCR引物为： Inva 引物：F :CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC ; R ：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT ； Hila 引物：F :CTGCCGCAGTGTTAAGCATA ; R：CTGTCGCCTTAATCGCATGT〇
7. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤⑷中所述 的Mg2+试剂选自MgCL 2或MgS04的一种或多种，所述的Mg2+试剂浓度为1. 5-2. Ommol/L。
8. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤⑷中所述 的PCR引物浓度为为8-10mmol/L。
9. 根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤⑷中所述 的Taq DNA聚合酶浓度为2-5U/ul。
【文档编号】C12Q1/04GK104195240SQ201410404056
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月16日 优先权日:2014年8月16日
【发明者】郭狄 申请人:中山鼎晟生物科技有限公司