脑膜炎球菌nmb1870的嵌合型、杂交和串联多肽的利记博彩app
【专利摘要】NMB1870是脑膜炎奈瑟球菌的一种蛋白质。已知NMB1870有三个家族。为增强NMB1870蛋白质引发在家族之间有交叉反应性的抗体的能力，工程改造了NMB1870。可用一个NMB1870家族的序列取代另一家族的相应位置。不同家族的NMB1870蛋白质序列可彼此相连。
【专利说明】脑膜炎球菌NMB1870的嵌合型、杂交和串联多肽
[0001] 本申请是2006. 11. 27提交的 CN200680050927. X 的分案 201210223578. 4,题为"脑 膜炎球菌NMB1870的嵌合型、杂交和串联多肽"的根据专利法第31条第1款的分案申请。 本文引用的所有文件通过引用全文纳入。
【技术领域】
[0002] 本发明属于免疫接种，特别是免疫接种抵御奈瑟球菌（Neisseria)属，例如脑膜 炎奈瑟球菌（N. meningitidis)(脑膜炎球菌）病原菌所致疾病的领域。
【背景技术】
[0003] 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)是荚膜革兰氏阴性细菌，其寄居在约 10%人群的上呼吸道中。虽然已有抗血清群A、C、W135和Y的多糖和偶联物疫苗，但该方法 不能应用于血清群B，因为其荚膜多糖是聚唾液酸的聚合物，是一种人体自身抗原。现已利 用外膜囊泡（OMV)中所含的表面暴露蛋白来开发抗血清群B的疫苗。这些疫苗能引发血清 杀细菌抗体应答并提供保护以抵御疾病，但它们不能诱导交叉菌株保护作用[1]。因此，一 些研究人员将注意力集中在疫苗所用的特定脑膜炎球菌抗原上[2]。
[0004] 一种这样的抗原是"NMB1870"。该蛋白质最初披露为菌株MC58的蛋白质"741"[参 考文献3中的SEQ ID 2535和2536;本文SEQ ID 1]，也称为"GNA1870"[参考文献4-6,根 据参考文献2]和"0RF2086" [7-9]。该脂蛋白在所有脑膜炎球菌血清群中表达，也见于多 种脑膜炎球菌菌株中。NMB1870序列分成三个家族（在本文中称为家族1、11和III)，发现 针对某给定家族的抗血清在同一家族中具有杀菌活性，但对于表达其它两家族之一的菌株 无此活性，即具有家族内交叉保护作用，但不具有家族间保护作用。
[0005] 因此，为利用NMB1870实现交叉菌株保护作用，利用了多个家族的此蛋白。有人 提出可将不同家族蛋白表达成杂交蛋白[10-12]，包括将两种或三种所述家族中的此蛋白 表达在一条多肽链中，从而无需分别表达和纯化蛋白质。检验了几种杂交体，得到令人鼓舞 的抗脑膜炎球菌效力。
[0006] 本发明的目的之一是提供其它改进方法来克服NMB1870所致保护作用的家族特 异性，并利用这些方法来提供抵御脑膜炎球菌疾病和/或感染，特别是血清群B的免疫力。
【发明内容】
[0007] 作为补充参考文献13所述的工作，本发明人用一个家族的NMB1870序列取代入另 一家族的相应位置，其目的是产生不具有野生型多肽的家族特异性的嵌合型NMB1870。
[0008] 除了工程改造一种NMB1870使之具有所有三个家族的特征，本发明人还制备了包 含多个家族的NMB1870序列的新杂交多肽和串联多肽，从而补充了参考文献10和12所述 的工作。
[0009] 虽然各家族的NMB1870多肽能引发仅对同一 NMB1870家族内的菌株有效的抗体 (例如，在小鼠中），但本发明的嵌合型杂交和串联多肽能引发识别多个家族的NMB1870多 肽的抗体。
[0010] 本发明还鉴定了 NMB1870的各种新的多态性形式，包括与以前报道的三种家族不 同的序列（家族IV)。
[0011] NMB1870 家族取代
[0012] 参考文献13披露了将一个NMB1870家族的序列取代入另一 NMB1870框架中，从 而产生了嵌合型NMB1870多肽。本发明人对杂交体实施了进一步研究，鉴定到在家族I NMB1870序列中进行取代的许多关键残基。这些残基的取代可以提1?此多肤引发能与家族 II多肽交叉反应的抗体的能力。
[0013] 因此，本发明提供包含与SEQ ID N0:57有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽， 其中一个或多个以下残基被另一氨基酸取代或删除：F14 ;T16 ;Q18 ;Q20 ;D21 ;S22 ;E23 ; H24 ；S25 ；G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；I39 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T56 ；A67 ；G68 ；K70 ； T72 ；A78 ；A79 ；N83 ； K85 ；D97 ；D102 ；P105 ；G107 ；R109 ；S114 ；S116 ；L118 ；N120 ；Q121 ； A122 ；K135 ；T147 ；V148 ；N149 ；G150 ；I151 ；R152 ；H153〇
[0014] 优选以下残基中至少一个倍被取代：F14 ;T16 ;Q18 ;K31 ;Q33 ;R35 ;I36 ;G37 ;I39 ; T56 ;K70 ;T72 ;A78 ;A79 ;K85 ;D97 ;D102 ;S114 ;S116 ;L118 ;K135。参考文献 13 未选择这些 残基中的任一个进行取代。
[0015] 优选进行取代或删除的氨基酸是：F14 ;T16 ;Q18 ;Q20 ;D21 ;S22 ;E23 ;H24 ;S25 ; G26 ；K27 ；K31 ；Q33 ；R35 ；I36 ；G37 ；K48 ；E51 ；G52 ；R54 ；T72 ；A79 ；K85 ；P105 ；G107 ；R109 ； L118 ;N120 ;Q121 ;A122 ;T147 ;V148 ;N149 ;G150 ;I151 ;R152 ;H153。优选取代这些残基，而 优选删除E51。
[0016] 优选用家族II或III的NMB1870中相应氨基酸来取代所述残基。因此，优选的 取代是：F14L ;T16I ;Q18K ;Q20N ;D21N ;S22P ;E23D ;H24K ;S25I ;S25T ;G26D ;K27S ;K31Q ; Q33S ；R35L ；I36V ；G37S ；I39L ；K48Q ；G52D ；R54K ；T56E ；A67P ；G68N ；K70R ；T72H ；A78T ； A79K；N83H；N83Y ；K85R ；D97E ；D102E ；P105A ；G107E ；R109S ；S114L ；S116D ；L118R ；N120G ； Q121S ;A122E ;K135R ;T147I ;V148G ;N149E ;G150K ;I151V ;R152H ;H153E。该清单中只有残 基25和83具有一个以上的优选取代残基，因为所有其它残基在家族I、II和III的两个家 族中具有相同的氨基酸。
[0017] 所述氨基酸序列与SEQ ID N0:57有至少70 %相同性，例如彡75 %、彡80 %、 彡85%、彡90%、彡95%、彡96%、彡97%、彡98%、彡99%或更高。该序列可以是更大序 列的一部分。
[0018] 给予宿主动物后，该多肽能诱导杀细菌的抗-脑膜炎球菌抗体，在优选的实施方 式中，该多肽能诱导抵御三个NMB1870家族I-III中各家族菌株的杀细菌抗体。下文给出 了杀细菌应答的其它信息。
[0019] 一种优选的氨基酸序列是SEQ ID N0:58,与SEQ ID N0:57相比，其以下残基 被取代：F14 ;T16 ;Q18 ;Q20 ;D21 ;S22 ;E23 ;H24 ;S25 ;G26 ;K27 ;K31 ;Q33 ;R35 ;I36 ;G37 ; K48 ；G52 ；R54 ；T72 ；A79 ；N83 ；K85 ；P105 ；G107 ；R109 ；L118 ；N120 ；Q121 ；A122 ；T147 ；V148 ； N149 ;G150 ;I151 ;R152 ;H153。残基 E51 被删除。
[0020] 另一取代的序列是SEQ ID N0:59。另一取代的序列是SEQ ID N0:60。
[0021] 用于取代的表面环
[0022] 已鉴定的SEQ ID NO: 1表面环为：（1)氨基酸164-168 ; (2)氨基酸179-182 ; (3) 氨基酸 188-196;(4)氨基酸2〇3-2〇 8;(5)氨基酸 216-224;(6)氨基酸 233-237;(7)氨 基酸 247-251 ;和（8)氨基酸 262-263。
[0023] MNRTA FCCLSLTTA LILTA CSSGGGGVA A DIGA GLA DA LTA PLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLA A QGA EKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESG EFQVYKQSHSA LTA FQTEQIQDSEHSGKMVA KRQFRI⑶IA GEHTSFDKLPEGGRA TYRGTA FGSDDA GGKLTYTIDFA A KQGNGKIEHLKSPELNVDLA A A DIKPDGKRHA VISGSVLYNQA EKGSYSLGIFGGKA QEVA GSA EVKTVNGIRHIGLA A KQ
[0024] 通过比对SEQ ID NO: 1与任何其它NMB1870序列，技术人员能鉴定出该序列中环 (1)-(8)的位置。然而，为便于引用，本文将环的坐标定义为NMB1870序列中一个或多个氨 基酸的串，在采用两两比对算法与SEQ ID N0:1比对时，所述氨基酸串始于和以上SEQ ID NO: 1中所鉴定环的第一个氨基酸残基比对的氨基酸，终于以上SEQ ID NO: 1中所鉴定环的 最后一个氨基酸。
[0025] 用一个家族的环序列取代入另一家族该环位置能产生具有多家族抗原性的嵌合 型 NMB1870。
[0026] 因此，本发明提供含有NMB1870第一家族的氨基酸序列修饰的多肽，其中所述修 饰的序列包含NMB1870第二家族的至少1个（例如，1、2、3、4、5、6或7个）表面环序列替代 了第一家族的表面环序列。
[0027] 本发明还提供包含分成九部分的骨架序列的多肽，骨架序列中具有插入的八个环 (骨架序列的各连续部分之间有一个），其中至少一个所述环序列取自不同于该骨架序列 的NMB1870家族的NMB1870序列。优选利用一个以上不同NMB1870序列的表面环，可将这 些环插入一条骨架序列中，因此，本发明提供含有以下氨基酸序列的多肽：
[0028] -B1-L1-B2-L2-B 3-L3-B4-L4-B5-L 5-B6-L6-B7-L7-B 8-L8-B9-
[0029] 其中：
[0030] (a)所述B1、B2、B3、B 4、B5、B6、B7、B8和B 9各自是：⑴SEQIDNO:M的片段；或（ii) 与⑴所述片段有至少m%序列相同性和/或包含⑴所述片段的至少d个连续氨基酸的 片段的氨基酸序列；
[0031] (b)所述 L1、L2、L3、L4、L5、L 6、L7和L8各自是：⑴SEQIDN0:1、SEQIDN0 :2和/ 或SEQ ID N0:3的片段；或（ii)与⑴所述片段有至少η%序列相同性和/或包含⑴所 述片段的至少e个连续氨基酸的片段的氨基酸序列，
[0032] 前提是，所述L1、L2、L3、L 4、L5、L6、L7和L8中至少一个不是SEQIDNO :M的片段。
[0033] 本发明还提供所述多肽的片段，只要所述片段包含ι^α2α3α 4α5α6α#ρ / *l8 中的至少一个，和Bi、b2、b3、b4、b 5、b6、b7、民和B 9中两个或多个的至少一个氨基酸。因此， 在一些实施方式中，最小的片段包含一个环，与该环N末端相连的一个氨基酸和与该环C末 端相连的一个氨基酸。
[0034] ]\1值选自1、2或3,81、82、83、8 4、85、86、87、88和89以及1^ 1、1^2、1^儿4、1^5儿6、1^和1^ 8 的定义取决于M值而不同。
[0035] "（i) SEQ ID NO:M的片段"的意义如下所示：
[0036]
【权利要求】
1. 一种如下式所示的杂交多肽： -A-[X-L-]n-B- 式中：X是包含奈瑟球菌序列的氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N 末端氨基酸序列，B是任选的C末端氨基酸序列，n是2或更高，其中至少一个-X-部分是 NMB1870序列，所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID N0:36。
2. 编码权利要求1所述的多肽的核酸。
【文档编号】C12N15/62GK104497145SQ201410386472
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2006年11月27日 优先权日:2005年11月25日
【发明者】V·马西格纳尼, M·斯卡塞利, R·拉普奥里, M·皮扎, M·朱利亚尼 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司