鸡b、d、e-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性分子标记及应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性分子标记及应用。该分子标记为TVB基因DNA序列SNP-3674C/T，或TVB基因的编码序列SNP-298C/T。本发明的分子标记可被用于鉴别鸡的B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征，相应的可以采用PCR-RFLP方法进行区分，进一步还可应用于抗性育种，从源头上控制B、D、E-亚群禽白血病的发生风险，具有目的性强，操作简便易行，大幅降低筛选成本等优势，实践意义重大。
【专利说明】鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性 分子标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子检测【技术领域】，具体涉及一种鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性 相关的单核苷酸多态性分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 我国是肉鸡生产大国和消费大国，肉鸡产量居世界第二位。2010年，我国优质鸡年 出栏率达到50亿只，约占中国肉鸡产量的50%，中国成为世界最大的优质鸡生产基地和消 费市场，优质鸡产业已成为最具有中国特色的家禽产业，在国际市场上优势地位明显。多年 流行病学调查结果显示，禽白血病在优质鸡中的发病率高于快大型肉鸡，成为威胁优质鸡 产业的主要疾病之一。目前控制禽白血病的方法是通过淘汰阳性鸡来净化种鸡群。所以， 培育ALV抗性鸡是未来替代传统净化鸡群方法的必然趋势。制约ALV抗性育种的根本原因 是没有切实可行的ALV抗性育种方法。遗传抗性和免疫接种是降低疾病危害的基本策略， 而遗传抗性显然更符合可持续发展的要求，并且在一定程度上具有一劳"永"逸的意义。
[0003] 禽白血病是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus, ALV)引起的以造血细胞恶 性增生为主的一类免疫抑制性传染病。ALV分为A-J 10个亚群，A、B、C、D为外源性病毒，E 为内源性病毒（Bai et al, 1995;Benson et al, 1998;Payne et al, 1992)。在鸡群中 A 亚 群病毒最常见，B亚群病毒次之。ALV宿主范围广泛、感染率高、传播速度快和致死率高等特 点。不同遗传背景的鸡对ALV-B亚群的易感性不同，选育LVA-B亚群抗性鸡是防控禽白血 病的主要手段之一（Bacon L D et al，2003)。目前禽白血病的主要防控方法是通过淘汰阳 性鸡来净化种群，没有疫苗进行免疫防控。ALV的清除是一项极其费力、费时且花费巨大的 工作，鸡群中ALV的净化可能需要多年坚持不懈的努力。目前生产上继续寻求一种快速简 单的鉴别ALV遗传抗性的诊断方法，用于生产实际。
[0004] 鸡抗病性的遗传基础研究，建立遗传抗性鸡鉴别诊断方法，快速选育抗性个体更 是优质鸡产业发展极其紧迫的工作。2000年，欧洲5个学术团体和2个公司合作开始了一 个大规模的合作，目的是了解鸡抗病性的遗传基础，并且能建立快速简单地发现抗性个体 的遗传实验，这项计划被称为IMAGE，是第一个对家禽免疫表达基因进行测序的研究，也是 唯一的聚焦于研究疾病领域的遗传基因功能研究。他们主要集中于三种疾病的抗病性研究 (传染性法氏囊病、马立克氏病和球虫病)，研究结果发现在正常鸡和具有抗病性的鸡之间 某些基因的表达有明显差别。项目负责人指出，接下来的研究主要集中于研究由免疫产生 的抗病力和天然抗病力的区别。一般抗病力受多基因或环境影响。鸡一般抗病遗传力估计 在0.1以下（Bacon et al，2000)，而特殊抗病遗传力常常较高（Gavora et al，1990)。不同 遗传背景的鸡对ALV的易感性不同。
[0005] 目前还没有研究和报道鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征及如何检测的情 况，也没有建立鸡B、D、E_亚群禽白血病遗传抗性分型方法。国内外还没有关于B、D、E_亚 群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定方法的任何报道。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗 性相关的单核苷酸多态性分子标记。
[0007] 本发明提供的鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性分子标 记，为TVB基因 DNA序列SNP-3674C/T，或TVB基因的编码序列SNP-298C/T。TVB基因 DNA 序列如SEQIDN0:5所示，其第 3674位碱基为C或T;TVB基因的编码序列如SEQIDN0:6 所示，其第298位碱基为C或T。
[0008] 禽白血病病毒（ALV)是通过特定膜蛋白作为受体位点吸附进入细胞的，ALV-B、 ALV-D、ALV-E亚型受体是TVB，相对应的编码基因是肿瘤坏死家族的成员；TVB是B、D、E-亚 群禽白血病病毒进入宿主的受体基因，该受体基因能否正常表达就决定了 B、D、E-亚群禽 白血病病毒能否感染鸡。我们研究发现，TVB基因基因 DNA序列第3674位碱基，或其编码 序列的第298位碱基C突变为T，则形成一个终止密码子（TGA)，TVB基因不能表达为完整的 受体基因，即对B、D、E-亚群禽白血病病毒具有抗性。实验证明该位点是抗性位点。
[0009] 本发明还提供上述鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性分子 标记在检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征中的应用。
[0010] 本发明还提供用于鉴定上述单核苷酸多态性分子标记的引物对，其核苷酸序列如 SEQIDN0:1?2，*SEQIDN0:3?4K*。
[0011] 本发明还提供一种检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征的方法，是检测上 述单核苷酸多态性分子标记，TVB基因 DNA序列第3674bp处碱基为T，或TVB基因编码序列 第298bp处碱基为T的鸡具有B、D、E-亚群禽白血病遗传抗。TVB基因的两个等位基因该 位点均突变为T时，为纯合抗性个体。
[0012] 优选地，上述检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征的方法，是利用PCR-RFLP 技术，获取待测鸡的基因组DNA，扩增TVB基因序列，扩增产物用限制性内切酶进行 酶切反应，酶切产物经电泳后只有两条条带的，判定其具有B、D、E-亚群禽白血病遗传抗 性。
[0013] PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)也叫聚合酶链式反应一限制性片段长度多态分析技术，是在PCR和DNA序列 分析基础上产生的RFLP技术。该方法是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的 限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基 因型的目的。本发明中最为适用的限制性内切酶为市售商品)，能够识别TVB基因 编码序列第298bp发生C - T突变的条带并将其切割成两部分，未发生突变的则不能被识 别与切割。
[0014] 优选地，上述检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征的方法，是以SEQ ID NO: 1~2所示序列作为引物扩增TVB基因，扩增产物经酶切后的产物中两条条带长分别为 158bp 和 245bp。
[0015] 本发明还提供一种鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征检测试剂盒，其包括扩 增TVB基因的引物对序列和限制性内切酶J/7III。
[0016] 本发明还提供一种B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性鸡的选育方法，是通过检测权 利要求1所述的单核苷酸多态性分子标记，筛选出TVB基因 DNA序列第3674bp处碱基为 T，或TVB基因编码序列第298bp处碱基为T的抗性种鸡样品，选取公、母均为抗性的种鸡杂 交，获得的F1代小鸡即为B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性鸡。
[0017] 本发明具有以下有益效果： (1)目前控制B、D、E-亚群禽白血病的方法是采用淘汰阳性鸡的净化方法，大量使用如 IDEXXP27抗原试剂盒，对所有的种鸡--进行检测，淘汰阳性鸡个体。这样费钱费力费时， 不可能从根本上控制ALV的发生和流行，以及消除潜在地大规模爆发的威胁。用本发明的 分子标记，从保种的源头上进行检测，可以快速准确地鉴定筛选B、D、E-亚群禽白血病遗传 抗性鸡,淘汰掉易感鸡，通过育种，也能达到从源头上控制B、D、E-亚群禽白血病的目标。
[0018] (2)生产上通过表型性状进行的直接或间接选择的禽白血病抗性鸡，这种抗病育 种实践耗费的育种成本很高，而且抗病力性状往往都是低遗传力的，很难很快选到很好的 抗病品系。用本发明的方法则可以很快速地筛选到对B、D、E-亚群禽白血病有抗性的鸡，这 种抗性育种方法目的性强，操作性强，具有实践意义。
[0019] (3)与目前的转基因技术相比，本发明具有安全性和推广性。目前的转基因方法， 即插入某一必需基因或基因修补或转入防御因子或病原体片段，还停留在试验阶段，况且 转基因产品或许还存在生态安全和食品安全问题，需要长期地跟踪其在大自然中遗传变异 的情况和产品安全问题；利用转基因鸡进行繁育来抗B、D、E_亚群禽白血病，则需要的时间 更长。
[0020] (4)目前尚没有看到国内关于鸡B、D、E-亚群禽白血病以基因型选择、遗传标记 辅助选择、或基因组型选择为抗性育种方法的研究报道。商业化育种公司的抗病育种还仍 然停留在传统的或略有改进的育种方法上，即主要通过某种表型的选择以提高品系的抗病 性。由于抗病性状遗传力低，且受营养、管理和环境影响大，选育的效果不明显，往往是事倍 功半。使用本发明，则可以快速达到预期的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是用引物TVB298-1和TVB298-2扩增的产物片段电泳结果，泳道1为1号鸡， Μ为分子量标准。
[0022] 图2是用引物TVB298-1和TVB298-2扩增的产物片段经酶切的电泳结果，泳道Ρ1 为SS基因型鸡(易感型)，泳道Ρ2为SR基因型鸡(杂合型)，泳道Ρ3为RR基因型鸡(抗性型)， Μ为分子量标准。
[0023] 图3是用引物tvbl和tvb2扩增的产物片段电泳结果，泳道1，2为1，2号鸡，Μ为 分子量标准。
[0024] 图4是用引物tvbl和tvb2扩增的产物片段经酶切的电泳结果，用引物tvbl和 tvb2扩增的产物片段经酶切的电泳结果，泳道pi为SS基因型鸡(易感型)，泳道p2为SR基 因型鸡(杂合型)，泳道P3为RR基因型鸡(抗性型)，Μ为分子量标准。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0026] 实施例1用TVB298引物对鉴定遗传抗性基因型 1、目的片段的PCR扩增 根据已知TVB基因的编码序列上的298位的SNP位点，用TVB基因的DNA序 列（GenBank登录号：NC_006109. 3)设计PCR-RFLP的扩增引物对TVB298,其中上游 引物TVB298-l:5'-GTGGGCAAGGTAAAACTCCA-3'（SEQIDN0:l)，下游引物TVB298-2 : 5'-GTGGGCAAGGTAAAACTCCA-3' （SEQ ID N0:2)。
[0027] 选取已知抗性基因型的样品鸡，编号分别为1 (标记为CC，基因型为SS，易感)、2 (标记为CT，基因型为SR3,易感）和3 (标记为TT，基因型为R3R3,抗性）的三只鸡，分别抽 提鸡的基因组DNA作为模板，用引物TVB298-1和TVB298-2进行PCR。
[0028] PCR 反应体系组成如下：模板 lPL，10Xbuffer 1〇μ?，dNTPs 8 μ?，引物 TVB298-1 1 μ?，引物 TVB298-2 lPL，Bland Taq 1 PL，ddH20 补至 10〇μ?。PCR 反应程序：94°C预变性 3min，l 个循环；94°C 40s，60°C 40s，72°C lmin，35 个循环；72°C后延伸 lOmin。
[0029] 扩增的片段长403bp，PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到 403bp左 右的特异性条带，见图1。
[0030] 2、PCR 产物的 J/7III 酶切 步骤1所得的PCR产物用J/7III内切酶（Invitrogen公司）酶切，反应体系： lOXbuffer M 10yLd/7III 5yL，PCR 产物 30yL，ddH20 补至 100yL，37°C 作用 3h，用 2% 的琼脂糖凝胶电泳检测时可以看到不同大小的酶切条带，如图2。
[0031] 图中泳道P1为编号1的SS易感基因型鸡，只有403bp长度的一条条带，表明扩增 产物未被酶切，该298位SNP位点的C未突变为T。泳道B2为编号2的SR3易感基因型鸡， 显示158bp、245和403bp的条带，该结果表明扩增产物没有被完全切开，其基因型为杂合 体，即TVB基因的一个等位基因298位的SNP位点发生突变而另外一个等位基因没有。泳 道B3显示158bp和245bp的两条条带，表明扩增产物被J/7III完全切开，表明该位点发生 了突变。
[0032] 实施例2抗性鸡的鉴定选育 用建立的B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性鸡鉴定方法鉴定了 642份原种鸡临床样品， 鉴定出B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性鸡样品346份。选取346份样品中的种鸡样品20只 (公母均为抗性鸡）杂交，获得F1代小鸡52只（理论上全部是遗传抗性鸡)，1日龄攻肉瘤劳 氏病毒（lOOOffu)，5月龄后进行肿瘤检查，结果所有鸡都没有出现肿瘤。证明该方法具有 非常好的应用价值。
[0033] 实施例5设计的其他引物序列也能鉴定出遗传抗性鸡 用TVB基因的DNA序列（GenBank登录号：NC_006109. 3)设计PCR-RFLP的扩增引物 对 tvb，设计上游引物 tvbl: GAAAGCAGGCGTAATGGTGTCC (SEQ ID N0:3)和下游引物 tvb2: TGGGAGACAAACGCAGAGCAG (SEQ ID N0:4)。抽提鸡的基因组 DNA，用引物 tvbl 和 tvb2 扩增 的片段长1300bp。PCR反应体系组成如下：模板lPL，10Xbuffer l(^L，dNTPs 8 μ?，引物 tvbl 1 μ?，引物 tvb2 lPL，Bland Taq 1 PL，ddH20 补至 10〇μ?。PCR 反应程序：94°C预变性 3min，l 个循环；94°C 40s，67°C 40s，72°C lmin，35 个循环；72°C后延伸 10min。
[0034] PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到1625bp左右的特异性条带，见图 3。用Af/III内切酶（Invitrogen公司）酶切，不同基因型样品可以获得大小不同的条带。 见图4。
[0035] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本【技术领域】的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【权利要求】
1. 一种鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性分子标记，其为TVB 基因 DNA序列SNP-3674C/T，或TVB基因的编码序列SNP-298C/T。
2. 权利要求1所述的鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性相关的单核苷酸多态性分子标 记在检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征中的应用。
3. 用于鉴定权利要求1所述的单核苷酸多态性分子标记的引物对，其特征在于，核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1?2,或SEQ ID NO: 3?4所示。
4. 一种检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征的方法，其特征在于，检测权利要求 1所述的单核苷酸多态性分子标记，TVB基因 DNA序列第3674bp处碱基为T，或TVB基因编 码序列第298bp处碱基为T的鸡具有B、D、E-亚群禽白血病遗传抗。
5. 根据权利要求4所述的检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征的方法，其特征 在于，利用PCR-RFLP技术；获取待测鸡的基因组DNA，扩增TVB基因序列，扩增产物用限制 性内切酶I进行酶切反应，酶切产物经电泳后只有两条条带的，判定该待测鸡具有B、 D、E-亚群禽白血病遗传抗性。
6. 根据权利要求5所述的检测鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征的方法，其特征 在于，以SEQ ID NO: 1~2所示序列作为引物扩增TVB基因，扩增产物经酶切后的产物中两条 条带长分别为158bp和245bp。
7. -种鸡B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性特征检测试剂盒，其特征在于，包括扩增TVB 基因的引物对序列和限制性内切酶III。
8. -种B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性鸡的选育方法，其特征在于，通过检测权利要求 1所述的单核苷酸多态性分子标记，筛选出TVB基因 DNA序列第3674bp处碱基为T，或TVB 基因编码序列第298bp处碱基为T的抗性种鸡样品，选取公、母均为抗性的种鸡杂交，获得 的F1代小鸡即为B、D、E-亚群禽白血病遗传抗性鸡。
【文档编号】C12N15/11GK104152445SQ201410368493
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】谢青梅, 李鸿鑫, 舒鼎铭, 张焕民, 陈伟国 申请人:华南农业大学