一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和检测培养液的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，公开了一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和检测培养液。该方法先提供一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液，过滤浓缩后加到检测培养液中培养，然后记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液的特征时间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程；然后将待测水样过滤浓缩，加入到检测培养液培养，在其410nm吸光度有明显变化的前提下，记录待测水样特征时间，将其代入到线性方程中获得浓度值。本发明基于酶底物法的原理，以吸光度和荧光强度为标准，采用适合于大肠埃希氏菌的检测培养液，能够快速、准确地检测出水中大肠埃希氏菌的浓度，可实时监测水中微生物污染情况。
【专利说明】一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和检测培养液
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种检测水中大肠埃希氏菌的方法和试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 总大肠菌群（Total Coliform)、耐热大肠菌群（Thermotolerant Coliform)和大 肠埃希氏菌（Escherichia coli)是指示水体中粪便污染的最重要的3个细菌学指标。这 些菌属可以在人、畜粪便中检出，也可以在营养丰富的水体中检出，即在非粪便污染的情况 下，也有检出这些细菌的可能性。耐热大肠菌群组成与总大肠菌群组成相同，但主要组成是 埃希氏菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有1个种，即大肠埃希氏菌，而其他如柠 檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属所占数量较少。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希氏菌检 出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些。
[0003] 目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要环境卫生学指标，并对其提 出了严格的限制。世界卫生组织《饮用水水质标准》（第二版）中规定，所有用于饮用的水 中大肠埃希氏菌或耐热大肠菌在任意l〇〇mL水样中不得检出；现行美国饮用水水质标准国 家一级饮用水标准规定总大肠菌群为〇CFU/ml ;中华人民共和国国家标准《生活饮用水水 质卫生规范》规定，总大肠菌群、耐热大肠菌群及大肠埃希氏菌每100mL水样中不得检出。
[0004] 检测大肠埃希氏菌等的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。多管发酵法适用于各 种样品，但操作复杂，检测时间较长，滤膜法主要用于检测杂质较少的水样，操作比多管发 酵法更为简单，但是不适合检测高浊度和其他复杂水样。这两种方法都具有检测周期长，程 序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。目前，国内外研究人员已经发展了一些新 方法进行大肠埃希氏菌等的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术（PCR)、免疫 分析法、生物传感器法等。
[0005] 其中酶底物法是已经纳入国标的标准检测方法，聚合酶链反应技术（PCR)、免疫分 析法、生物传感器法等方法还不成熟。
[0006] 与传统方法相比，国标酶底物法虽然将检测时间缩短至24h，但是仍然不能满足快 速检测的需要。以酶底物法为原理开发出来的在线实时监测仪器价格昂贵，而且基本上都 是以进口产品为主。
[0007] 中国专利200910148688. 7公开了快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法， 该方法以酶底物法为检测原理，首先选择培养液显色底物，连续测定不同稀释度粪大肠菌 群或大肠菌群的生长曲线，通过生长曲线设定显色底物特征值，然后测定不同稀释度粪大 肠菌群或大肠菌群显色达到特征值所需时间，并建立初始浓度与达到特征值所需时间之间 的线性关系，根据此曲线确定未知样品的菌浓度。但是，该方法检测对象是大肠菌群，其检 测方法并不适合用来检测大肠埃希氏菌，同时最为关键的显色培养基并未公开，而这些都 是影响检测准确度和检测时间的重要因素。此外，现有以酶底物法为原理的检测方法都存 在取样量过少的问题，一般只能取到55. 5-100mL，而取样量多少可以影响检测结果的不确 定性。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，使得该方 法能够快速检测出水中大肠埃希氏菌；
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，使得该方法能 够增加待检测样本取样量；
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种检测水中大肠埃希氏菌的检测培养液，使其能 够促使大肠埃希氏菌快速繁殖，缩短检测时间。
[0011] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0012] 一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，包括如下步骤：
[0013] 步骤1、提供一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液，浓缩，分别加入到检测培养 液中培养，然后记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液的特征时间，所述特征时间为各浓度 下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时 间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程；
[0014] 步骤2、将待测水样浓缩，加入步骤1所述检测培养液培养，在其410nm吸光度有明 显变化的前提下，记录待测水样特征时间，将其代入到步骤1中的线性方程中获得待测水 样中大肠埃希氏菌的浓度；
[0015] 其中，所述检测培养液包括Tryptone、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯 化钙、亚硫酸钠、吐温_80、NaH 2P04 ·Η20、Κ2ΗΡ04 ·3Η20、邻硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷、4-甲 基伞形酮-β -D-葡萄糖醛酸苷、3号胆盐。
[0016] 在本发明检测方法中，只有吸光度有明显变化且荧光强度达到所设定的阈值240, 才可认定为存在大肠埃希氏菌，然后通过荧光强度定量检测出水样的大肠埃希氏菌浓度。 如果只有吸光度有明显变化，而荧光强度超过l〇h未达到阈值240,或者只有荧光强度在 10h内达到阈值240,但吸光度未有明显变化，则不能认定待测水样中存在大肠埃希氏菌。 双标准的选择极大地增加了检测的准确性，杜绝了其他影响因素的干扰。
[0017] 本发明为了确保检测时间控制在10h以内，达到缩短检测时间的目的，以 IMPN/lOOmL的极低浓度水样在本发明所述检测培养液中培养10h左右达到的荧光强度240 为荧光强度阈值。为了达到前述目的，本发明在付出了创造性的劳动后，确立了优化后的检 测培养液组成。
[0018] 作为优选，所述检测培养液包括：
[0019] Tryptone 10. 0g/L、硫酸镁 50-100mg/L、硫酸猛 0· 5-lmg/L、硫酸锌 0· 5-lmg/ L、硫酸铵 5· 0-1(λ 0g/L、氯化钠 1(λ 0g/L、氯化钙 50-100mg/L、亚硫酸钠 40-100mg/L、吐 温
【权利要求】
1. 一种检测水中大肠埃希氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1、提供一系列不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液，过滤浓缩，分别加入到检测培养 液中培养，然后记录各浓度下的大肠埃希氏菌菌悬液的特征时间，所述特征时间为各浓度 下的大肠埃希氏菌菌悬液在365nm激发光下产生450nm荧光的荧光强度达到240时的时 间，建立大肠埃希氏菌菌悬液浓度和特征时间的线性方程； 步骤2、将待测水样过滤浓缩，加入步骤1所述检测培养液培养，在其410nm吸光度有明 显变化的前提下，记录待测水样特征时间，将其代入到步骤1中的线性方程中获得待测水 样中大肠埃希氏菌的浓度； 其中，所述检测培养液包括Tryptone、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯化 钙、亚硫酸钠、吐温
邻硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷、4-甲 基伞形酮-β -D-葡萄糖醛酸苷、3号胆盐。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测培养液包括： TryptonelO. Og/L、硫酸镁 50-100mg/L、硫酸猛 0· 5-lmg/L、硫酸锌 0· 5-lmg/L、硫酸铵 5. 0-10. Og/L、氯化钠 10. Og/L、氯化钙 50-100mg/L、亚硫酸钠 40-100mg/L、吐温-800. 5-2g/
、邻硝基苯-β -D-批喃半乳糖苷250mg/L、 4-甲基伞形酮-β -D-葡萄糖醒酸苷35mg/L、3号胆盐1. 0-3. 0g/L。
3. 根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述过滤浓缩采用膜孔径为0. 45 μ m、 膜直径为47mm醋酸纤维素滤膜过滤浓缩。
4. 一种检测水中大肠埃希氏菌的检测培养液，其特征在于，包括： Tryp t οn e、硫酸镁、硫酸猛、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠、氯化興、亚硫酸钠、吐温-8 0、
邻硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形酮-β -D-葡萄糖 醒酸苷、3号胆盐。
5. 根据权利要求4所述检测培养液，其特征在于，包括： TryptonelO. 0g/L、硫酸镁 50-100mg/L、硫酸猛 0· 5-lmg/L、硫酸锌 0· 5-lmg/L、硫酸铵 5. 0-10. 0g/L、氯化钠 10. 0g/L、氯化钙 50-100mg/L、亚硫酸钠 40-100mg/L、吐温-800. 5-2g/
邻硝基苯- β -D-批喃半乳糖苷250mg/L、 4-甲基伞形酮-β -D-葡萄糖醒酸苷35mg/L、3号胆盐1. 0-3. 0g/L。
【文档编号】C12Q1/06GK104087652SQ201410354559
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】单旭亮, 毛芳芳, 崔海松 申请人:杭州绿洁水务科技有限公司