肠杆菌z0206细菌多糖的制备方法及应用的利记博彩app

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【专利摘要】本发明公开了一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，步骤如下：取保藏号为CGMCC?No.2279的肠杆菌Z0206；接种到灭菌PDA加富固体培养基上，得到活化菌种；将活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，得到发酵种子液；接种发酵种子液，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；加入乙醇，分离取沉淀，得到粗多糖粉末；将粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；将所得的蛋白酶处理液取上清；向所得的清液中加Sevag试剂，制得多糖溶液；将所得的多糖溶液，经真空冷冻干燥等步骤后，得多糖精品。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高产细菌多糖菌株，及利用该菌株发酵生产多糖的方法和多糖的 应用，它属于生物工程【技术领域】。 肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法及应用

【背景技术】
[0002] 多糖在自然界分布很广，在高等植物、动物、微生物体内均有存在，是自然界含量 最丰富的生物聚合物之一。多糖具有多方面的功能，如能量储存、结构支持、防御功能等。 早在上世纪40年代，多糖就开始用作药物，1951年美国人Reihy Η首次发现微生物担子菌 中的多糖有抑制肿瘤的活性，到了 60年代，多糖作为广泛的免疫促进剂引起人们的极大兴 趣，开发多糖为保健食品与药物也倍受关注。已有研究证明饲料中添加活性多糖能显著提 高动物免疫功能，改善动物生长和生产性能，降低动物死亡率。
[0003] 很多多糖具有免疫增强活性，表现出对宿主免疫的介导和调节作用，通过刺激免 疫细胞的成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主细胞对淋巴因子、激 素及其他生理因子的反应性。以此为基础，多糖表现出与免疫力相关的多种活性功能，如抗 肿瘤、降血糖、抗衰老、促进肝脏和骨髓细胞的蛋白质和核酸的合成、抗炎及抗辐射作用等。
[0004] 近年来，我们通过分离、筛选和纯化，从肉灵芝中分离得到了一株高产胞外多糖的 细菌菌株阴沟肠杆菌Ζ0206。所谓肉灵芝，在民间被称之为"太岁"，据《本草纲目》记载，肉 灵芝为本草上品，它是在我国发现的一种天然珍稀物种，即被我国科学界早已认定的一种 原生质生命体，确切定名应为"特大型粘菌复合体"。研究表明，菌株阴沟肠杆菌Ζ0206具有 高产多糖的特性，这种细菌多糖以分泌的形式到达胞外，具有产量高、安全、无毒副作用等 优点。阴沟肠杆菌Ζ0206细菌多糖具有一定的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性。 因此，阴沟肠杆菌Ζ0206细菌多糖制备在抗氧化和抗肿瘤药物及添加剂开发和应用上具有 重要的意义和广阔的前景。


【发明内容】

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种肠杆菌Ζ0206细菌多糖的制备方法及应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种肠杆菌Ζ0206多糖的制备方法，（1)斜 面种子培养：取保藏号为CGMCC No. 2279的肠杆菌Ζ0206 ;种肠杆菌Ζ0206多糖的制备方 法：接种到灭菌PDA加富固体培养基上，28-32°C培养36-48h，再次转接到PDA加富固体培 养基上，28-32°C培养36-48h，得到活化菌种；（2)发酵罐培养：将步骤（1)所得到的活化菌 种接种至PDA加富液体培养基中进行摇瓶发酵，温度28-32°C摇床振荡培养18-20h，得到 发酵种子液；发酵罐内加入70%发酵培养基，121°C蒸汽灭菌20min，接种发酵种子液，发酵 时间48-72h，得到含有肠杆菌Z0206胞外多糖的发酵液；（3)将步骤（2)所得的发酵液于 60-70°C条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/10,加入3-5倍体积预冷的95%乙醇，分离取 沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，得到粗多糖粉末；(4)将步骤（3) 所得的粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，用Na 2C03调pH至7. 0-9. 0,加入质量为 多糖质量1/40-1/20的胰蛋白酶，55°C水解l-2h后，用草酸调pH至5. 0-5. 7,加质量为多糖 质量1/40-1/20的木瓜蛋白酶，65-70°C水解2-3h后，于KKTC水浴加热5-6min，以终止酶 反应；（5)将步骤（4)所得的蛋白酶处理液用草酸调pH值至7.0,加入3%的三氯乙酸，室 温下180-200r/min搅拌lh后，11000rpm离心l〇-15min，取上清；(6)向步骤（5)所得的清 液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡脱去蛋白，制得多糖溶液；（7)将步骤（6)所得 的多糖溶液用氨水调pH至8. 0,在50°C下滴加20%的H202，至溶液为淡黄色，保温2h，然后 用稀盐酸中和PH值至7. 0 ;自来水透析l-2d，蒸馏水透析2-3d后，经真空冷冻干燥得多糖 精品。
[0007] 作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的改进：所述步骤（1)和（2) 中，PDA加富固体培养基的配方如下：马铃薯20%，蛋白胨0. 2-0. 5%，酵母浸膏0. 3%，葡萄 糖2%，琼脂粉1.6% ;PDA加富液体培养基配方如下：马铃薯20%，蛋白胨0.2-0. 5g%，酵 母浸膏0. 3 %，葡萄糖2 %;发酵培养基的配方如下：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %，玉米浆干 粉 0· 6 %，Κ2ΗΡ04· 3Η200· 3 %，ΚΗ2Ρ040· 3 %，CaCl20. 1 %。
[0008] 作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的进一步改进：所述步骤（2) 中，摇瓶发酵条件为：接种量3环，往复振荡冲程4-10cm，振荡频率200-250rpm。
[0009] 作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的进一步改进：所述步骤（2) 中，发酵罐发酵条件为：接种量4%，pH为7. 5,温度32°C，通气量为0. 25-0. 75vvm，机械搅 拌转速 200-300rpm。
[0010] 作为对本发明所述的肠杆菌Z0206多糖的制备方法的进一步改进：所述步骤（6) 中的Sevag试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为4 :1。
[0011] 一种肠杆菌Z0206细菌多糖在制备增强机体抗氧化功能和免疫调节功能的保健 品或添加剂中的应用。
[0012] 本发明所用的肠杆菌Z0206是保藏号为CGMCC No. 2279的肠杆菌Z0206。
[0013] 本发明的优点：
[0014] 本发明采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含 量分别为：70. 36%、29. 33% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 8%和0. 01% ;结果 表明，上述提取富硒多糖的生产过程简单，产品纯度较高，富硒量较高。
[0015] 本发明制备的肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠 T细胞亚群和NK细胞活性的影 响明显；能增强免疫低下的小鼠体液免疫能力。

【具体实施方式】
[0016] 以下结合具体实例对本发明的技术方案做进一步说明（以下实施例中所用肠杆 菌Z0206是保藏号为CGMCC No. 2279的肠杆菌Z0206):
[0017] 实施例1、肠杆菌Z0206多糖的制备方法
[0018] (1)斜面种子培养：PDA加富固体培养基配方如下：马铃薯汁1000ml，蛋白胨3g， 酵母浸膏3g，葡萄糖20g，琼脂粉16g ;PDA加富液体培养基配方如下：马铃薯汁1000ml，蛋 白胨3g，酵母浸膏3g，葡萄糖20g。培养用的平板及PDA加富培养基121°C灭菌20min，在 无菌室倒平板，待培养基冷却凝固之后，取冷冻保存的阴沟肠杆菌Z0206菌种（保藏号为 CGMCC No. 2279的肠杆菌Z0206)，用接种环接种于PDA加富培养基平板上，30°C培养2d，重 复操作一次，得到活化的阴沟肠杆菌Z0206菌种。
[0019] (2)发酵罐培养：向250ml三角瓶中加入70ml上述PDA加富液体培养基，121°C 灭菌20min，向培养基中接种3%活化菌种后放置于摇床中30°C振荡培养，往复振荡的冲程 4-10cm，振荡频率200rpm，培养18h后得到发酵罐种子液。发酵罐内加入70%发酵培养基 (加入的发酵培养基的体积为发酵罐体积的70%;发酵培养基配方为：玉米淀粉20%，豆柏 粉 1. 6 %，玉米浆干粉 0· 6 %，Κ2ΗΡ04· 3Η200· 3 %，ΚΗ2Ρ040· 3 %，CaCl20. 1 % ;发酵培养基配置 方法为：玉米淀粉200g、豆柏粉16g，玉米浆干粉6g，Κ2ΗΡ04· 3H203g，KH2P043g以及CaCl2lg， 取蒸馏水定容至l〇〇〇ml)，121°C蒸汽灭菌20min，接种种子液，接种量4%，发酵条件为pH = 7. 5、温度32°C、通气量为0. 45vvm、机械搅拌转速250rpm，发酵时间48h，得到含有阴沟肠杆 菌Z0206多糖的发酵液。
[0020] (3)阴沟肠杆菌Z0206多糖的分离提取：
[0021] a.粗多糖的提取
[0022] 发酵液用旋转蒸发仪，于60°C将其浓缩为原体积的1/10, 90°C水浴lh，5000rpm 离心15min，收集上清液，用磁力搅拌器边搅拌边向上清液中缓缓加入3倍体积的冷无水乙 醇，放入4°C冰箱沉淀过夜，然后5000rpm离心15min，沉淀再依次用预冷的丙酮和无水乙醚 洗涤，离心，最后将沉淀置于真空干燥器中干燥，得到粗多糖粉末。
[0023] b.蛋白酶处理
[0024] 取粗多糖粉末10g溶于200mL蒸馏水中（稍加热促溶），用Na2C0 3调PH值至8. 0， 加胰蛋白酶〇. 5g，55°C水解2h后，用草酸调PH值至5. 5,加木瓜蛋白酶0. 5g，70°C水解3h 后，加热至l〇〇°C，5min终止酶反应。
[0025] c. TCA (三氯乙酸）法脱蛋白
[0026] 取200mL的蛋白酶处理液，用草酸调PH值至7. 0,加入6g三氯乙酸，用磁力搅拌器 搅拌lh，llOOOrpm离心lOmin，取上清。
[0027] d.Sevag 法脱蛋白
[0028] 向上述步骤c所得的上清液中加入1/3体积的Sevag试剂（Sevag试剂配置方法 如下：氯仿和氯正丁醇的体积比为4:1)，置于250mL的分液漏斗中剧烈振荡20min，打开活 塞，放出下层氯仿及中间层变性蛋白，重复数次直至无变性蛋白出现为止。然后用3倍体积 的冷无水乙醇醇析，所得的沉淀用丙酮洗涤后，将沉淀冷冻干燥，得多糖。
[0029] e.脱色
[0030] 将步骤d所得脱蛋白后的多糖配成0. 5%的多糖溶液，用氨水调PH值至8. 0,在 50°C下滴加20%的H202，至溶液为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和至7. 0。自来水透析 48h，蒸馈水透析48h后，加入3倍体积的冷无水乙醇沉淀，依次用冷的无水乙醇、丙酮和无 水乙醚洗涤沉淀，重复2次。真空干燥，得多糖精品。
[0031] 实施例2、应用苯酚-硫酸法检测肠杆菌Z0206多糖含量
[0032] 方法如下：精确称取标准葡糖糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取 0· 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、l. OmL、l. 2mL、l. 4mL、l. 6mL 及 1. 8mL，各以蒸馏水补至 2. OmL， 然后加入6%苯酚1. OmL及浓硫酸5. OmL，静止lOmin，摇勻，室温放置20min以后于490nm 测光密度，以2. OmL水按同样显色操作作为空白，以多糖微克数为横坐标，光密度值为纵坐 标，绘制标准曲线。吸取样品液1. 〇mL(相当于40 μ g左右的多糖），按照上述步骤操作，测 光密度值，以标准曲线计算多糖含量。
[0033] 实施例3、应用凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中蛋白质含量
[0034] 采用国家标准规定的凯式定氮法（GB/T5009. 5-1985)测定肠杆菌Z0206多糖中蛋 白质含量。
[0035] 实施例2和实施例3 :采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中 多糖和蛋白质含量。测定结果显不：粗多糖中多糖、蛋白质含量分别为：70. 36%、29. 33% ; 多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 8%和0.01%。结果表明，上述提取多糖的生产过 程简单，产品纯度较高。
[0036] 实施例4、肠杆菌Z0206多糖的免疫调节活性研究
[0037] 取ICR小鼠（可够自浙江大学医学院实验动物中心）40只（雌雄各半），随机分为 对照组（I )，环磷酰胺组（II )，环磷酞胺+多糖组（III)和多糖组（IV )。II、111组在第 12天腹腔注射环磷酞胺（50mg/kg体重）诱导免疫低下，I、11组每天灌胃生理盐水0.4mL， III、IV组每天灌胃多糖0. 4mL (400mg/kg体重），试验期14d。在试验的第10天，所有的试验 鼠腹腔注射〇. 2mL10%的SRBC进行免疫。于最后1次给药后12h (禁食不禁水），从试验组 中随机取6只小鼠眼眶放血后，颈椎脱白处死，取样进行以下指标分析。
[0038] 1、采集抗凝血，通过流式细胞仪测定T细胞亚群和自然杀伤细胞（NK细胞）活性：
[0039] T细胞亚群：试验结束后，取部分血样肝素抗凝后，取两组试管，分为试验管和阴 性对照管。每支试验管中均加入FITG-⑶4、PE-⑶3、PE-cy6-⑶S，其阴性对照管中均加入相 应的同型对照抗体FITG-IgGZb、PE-IgG、PE-cy6-IgGZa之后，每份抗凝全血分别加入试验 管和阴性对照管各50 μ L，混匀机混匀后，避光保存25min，加入流式细胞检测剂2mL，混匀 机混勻后，避光保存15min后，1500r/min离心5min，弃上清，加入磷酸盐缓冲液（PBS) lmL, 混勻，1500r/min离心5min，弃上清，反复2-3次后，加 PBS至0. 5mL，混勻，流式细胞仪进行 检测，经CELLQuest软件进行分析，记录结果。
[0040] NK细胞活性：取流式管1支，依次加入NK细胞（PE)及CD3 (FITC)三色直标单抗各 5 μ L及EDTA抗凝血50 μ L混匀置暗处20-25°C孵育15min，每管加溶血素2mL，充分混匀， 准确放置暗处l〇min，1200r/min离心5min，倾弃上清液，每管加 PBS2mL充分混勻，1200r/ min离心5min，弃上清加少许PBS2mL混勻，上机检测分析。
[0041] 2、血清溶血素含量的测定
[0042] 分离血清，用生理盐水将血清稀释300倍。取用生理盐水稀释好的血清样品1 mL 加至反应管中，再加入10% SRBCO. 5mL，置冰浴中，并于试管中加入1 mL以生理盐水1:10稀 释的豚鼠血清，随即移至37°C恒温水浴锅中，保温lOmin。孵育完毕即放入冰浴中以终止反 应，以2000rpm离心lOmin。取上清液lmL加3mL都氏试剂，混勻，放置lOmin后，于540nm 处，以不加血清的空白管作对照，测各样品的吸光度值（0D)。取0. 25mL的SRBC用都氏试剂 稀释至4mL，摇勻，放置lOmin，以2000rpm离心lOmin，取上清液，测吸光度值。溶血素的量 以半数溶血值（HC 5(I)表示，样品半数溶血值（HC5(I)=(样品吸光度值/SRBC半数溶血时的 吸光度值）X稀释倍数。
[0043] 3、脾细胞抗体生成测定
[0044] 试验结束后，将各小组眼眶放血，颈椎脱白处死后，迅速取脾脏，用生理盐水制成 IX 107cell/mL的脾细胞悬液。另取试管，每管加入脾细胞悬液（空白对照管用生理盐水代 替）、0. 2% SRBC悬液和1:10稀释的新鲜的豚鼠血清各1 mL，混匀后置37°C水浴温育lh， 300orpm离心lOmin，取上清液，在分光光度计上于413nm处测定光密度值A413。
[0045] 试验结果如下表所示：
[0046] 表1为肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠 T细胞亚群和NK细胞活性的影响；
[0047] 表2为肠杆菌Z0206多糖对免疫低下小鼠体液免疫的影响；
[0048] 表 1
[0049] CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ NK activity(%) 对照组（I ) 63.28d 14.37 a 4.40d 7.28 d 环磷酰胺（II) 38.46b 18.79 b 2.05b 2.23 b 环磷酰胺+多糖组（III) 48.03d 17.62 1 2.73c 4.96 d S. E, Μ 1.126 0.137 0.054 0.071
[0050] 注：同列上标字母不同表示差异显著（p〈0. 05)
[0051] 与生理盐水对照组相比，小鼠注射环磷酞胺后，T淋巴细胞亚群紊乱，比例失调， CD4+ 显著降低（p〈0. 05)，CD8+ 显著升高（p〈0. 05)，CD4+/CD8+ 显著降低（p〈0. 05)，NK 细胞 活性显著下降（P〈〇. 05)。与环磷酰胺组相比，小鼠经400mg/kg多糖预防性灌胃在注射环磷 酰胺，CD4+、CD4+/CD8+ 和 NK 细胞活性分别提高了 19. 93% (ρ〈(λ 05)、24· 91% (ρ〈(λ 05)和 55. 04% (ρ〈0. 05)。
[0052] 表 2
[0053] HCs〇 A413 对照组（I ) 160. 10a 0.557d 环磷酰胺（II) 60. 34。 0. 2621 环磷酰胺+多糖组（III) 101. 85e 0.335° S. E. Μ 2.718 0.0069
[0054] 与生理盐水对照组相比，小鼠注射环磷酞胺后，血清溶血素半数溶血值（HC5(I)和 抗体形成细胞数目（PFC)分别降低了 62. 31% (P〈0. 05)和52. 96% (P〈0. 05)。与环磷酰胺 组相比，小鼠经400mg/kg多糖预防性灌胃在注射环磷酰胺，血清溶血素半数溶血值增加了 40. 76%，脾细胞抗体形成数目升高了 21. 79%。
[0055] 对比例1、专利号为200810121312. 2的专利中，采用的发酵培养基配方如下： 蔗糖 2. 5%，酵母浸膏 0· 3%，蛋白胨 5%，Κ2ΗΡ040· 2%，ΚΗ2Ρ040· 1%，MgS040. 05% ;加入 0. 25% -1 %胰蛋白酶，加入0. 25% -1 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定 氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含量分别为：68.02^^28.41% ;多糖精品中多 糖、蛋白质含量分别为：99. 6%和0.03%。
[0056] 本发明中，采用的发酵培养基配方如下：玉米淀粉20 %，豆柏粉1. 6 %，玉米浆 干粉0.6%，1(2册04.3!1200.3%，腿 2?040.3%，〇&(：120.1%;加入2.5%-5%胰蛋白酶，加入 2. 5 % -5 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中 多糖和蛋白质含量分别为：70. 36%、29. 33% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 8% 和 0· 01%。
[0057] 从以上数据可以看出，在本发明经过对发酵培养基配方以及胰蛋白酶和木瓜蛋白 酶的加入量进行改变后，与专利号为200810121312. 2的专利中对比，产品纯度有明显的提 商。
[0058] 对比例2、采用的发酵培养基配方如下：玉米淀粉20%，豆柏粉1.6%，玉米浆干 粉 0.6%，Κ2ΗΡ04·3Η200·3%，ΚΗ2Ρ0 40·3%，CaCl20. 1% ;加入 0.25% -1%胰蛋白酶，加入 0. 25% -1 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多 糖中多糖和蛋白质含量分别为：68.09^^28.55% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为： 99. 7%和 0· 02%。
[0059] 本发明中，采用相同的发酵培养基配方，加入2. 5 % -5 %胰蛋白酶，加入 2. 5 % -5 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中 多糖和蛋白质含量分别为：70. 36%、29. 33% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 8% 和 0· 01%。
[0060] 对比例3、采用的发酵培养基配方如下：玉米淀粉20%，豆柏粉1.6%，玉米浆干 粉 0.6%，Κ2ΗΡ04·3Η200·3%，ΚΗ2Ρ0 40·3%，CaCl20. 1% ;加入 0.25% -1%胰蛋白酶，加入 2. 5 % -5 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中 多糖和蛋白质含量分别为：69. 02%、29. 01% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 7% 和 0· 03%。
[0061] 本发明中，采用相同的发酵培养基配方，加入2. 5 % -5 %胰蛋白酶，加入 2. 5 % -5 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中 多糖和蛋白质含量分别为：70. 36%、29. 33% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 8% 和 0· 01%。
[0062] 对比例4、采用的发酵培养基配方如下：玉米淀粉20%，豆柏粉1.6%，玉米浆干 粉 0· 6 %，Κ2ΗΡ04· 3Η200· 3 %，ΚΗ2Ρ040· 3 %，CaCl20. 1 % ;加入 2. 5 % -5 % 胰蛋白酶，加入 0. 25% -1 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多 糖中多糖和蛋白质含量分别为：69.03^^29.01% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为： 99. 61%和 0· 02%。
[0063] 本发明中，采用相同的发酵培养基配方，加入2. 5 % -5 %胰蛋白酶，加入 2. 5 % -5 %木瓜蛋白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中 多糖和蛋白质含量分别为：70. 36%、29. 33% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 8% 和 0· 01%。
[0064] 对比例5、采用的发酵培养基配方如下：蔗糖2. 5%，酵母浸膏0.3%，蛋白胨5%， 1(2即040.2%，腿孑040.1%，]\%50 40.05%;加入2.5%-5%胰蛋白酶，力口入2.5%-5%木瓜蛋 白酶的情况下，采用苯酚-硫酸法和凯式定氮法测定肠杆菌Z0206多糖中多糖和蛋白质含 量分别为：69. 08%、28. 88% ;多糖精品中多糖、蛋白质含量分别为：99. 58%和0. 25%。
【权利要求】
1. 一种肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征是： (1)斜面种子培养：取保藏号为CGMCC No. 2279的肠杆菌Z0206 ;种肠杆菌Z0206多糖 的制备方法：接种到灭菌PDA加富固体培养基上，28-32°C培养36-48h，再次转接到PDA加 富固体培养基上，28-32°C培养36-48h，得到活化菌种； ⑵发酵罐培养：将步骤⑴所得到的活化菌种接种至PDA加富液体培养基中进行摇 瓶发酵，温度28-321：摇床振荡培养18-2011，得到发酵种子液；发酵罐内加入70%发酵培养 基，121°C蒸汽灭菌20min，接种发酵种子液，发酵时间48-72h，得到含有肠杆菌Z0206胞外 多糖的发酵液； (3) 将步骤（2)所得的发酵液于60-70°C条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/10,加入 3-5倍体积预冷的95%乙醇，分离取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤，真空干 燥，得到粗多糖粉末； (4) 将步骤（3)所得的粗多糖粉末溶解于20倍体积热的蒸馏水中，用似20)3调pH至 7. 0-9.0,加入质量为多糖质量1/40-1/20的胰蛋白酶，55°C水解l_2h后，用草酸调pH至 5. 0-5. 7,加质量为多糖质量1/40-1/20的木瓜蛋白酶，65-70°C水解2-3h后，于100°C水浴 加热5-6min，以终止酶反应； (5) 将步骤（4)所得的蛋白酶处理液用草酸调pH值至7.0,加入3%的三氯乙酸，室温 下 180-200r/min 揽拌 lh 后，llOOOrpm 离心 10_15min，取上清； (6) 向步骤（5)所得的清液中加入1/3体积的Sevag试剂，充分振荡脱去蛋白，制得多 糖溶液； (7) 将步骤（6)所得的多糖溶液用氨水调pH至8.0,在50°C下滴加20%的H202，至溶液 为淡黄色，保温2h，然后用稀盐酸中和PH值至7. 0 ;自来水透析l-2d，蒸馏水透析2-3d后， 经真空冷冻干燥得多糖精品。
2. 根据权利要求1所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤 (1) 和（2)中，PDA加富固体培养基的配方如下：马铃薯20%，蛋白胨0.2-0. 5%，酵母浸 膏0.3 %，葡萄糖2 %，琼脂粉1.6% ;PDA加富液体培养基配方如下：马铃薯20%，蛋白胨 0. 2-0. 5g%，酵母浸膏0. 3%，葡萄糖2% ;发酵培养基的配方如下：玉米淀粉20%，豆柏粉 1. 6 %，玉米浆干粉 0· 6 %，Κ2ΗΡ04· 3Η200· 3 %，ΚΗ2Ρ040· 3 %，CaCl20. 1 %。
3. 根据权利要求2所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤 (2) 中，摇瓶发酵条件为：接种量3环，往复振荡冲程4-10cm，振荡频率200-250rpm。
4. 根据权利要求2或3所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步 骤（2)中，发酵罐发酵条件为：接种量4%，pH为7.5,温度32°C，通气量为0.25-0. 75vvm， 机械搅拌转速200-300rpm。
5. 根据权利要求4所述的肠杆菌Z0206细菌多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤 (6)中的Sevag试剂由氯仿和正丁醇组成；所述氯仿和正丁醇的体积比为4 :1。
6. 如权利要求1?5任一所述方法制备而得的肠杆菌Z0206细菌多糖在制备增强机体 抗氧化功能和免疫调节功能的保健品或添加剂中的应用。
【文档编号】C12R1/10GK104046664SQ201410318539
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月6日 优先权日:2014年7月6日
【发明者】汪以真, 靳明亮, 徐春兰, 羊雪芹 申请人:浙江大学