一种脑膜炎球菌抗原组合及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了一种新的脑膜炎球菌的抗原组合及其应用。具体地，所述的抗原组合包括：由fHbp?V1变异型蛋白、fHbp?V2变异型蛋白、和NHBA蛋白。实验证明，采用本发明抗原组合制备的疫苗能够具有明显的协同效应，且表现出良好的广谱抗脑膜炎球菌能力。
【专利说明】一种脑膜炎球菌抗原组合及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及疫苗领域，尤其涉及脑膜炎球菌重组蛋白疫苗组分及其组合。
【背景技术】
[0002]细菌性脑膜炎严重地威胁人类的健康，全球每年死亡病例估计有17万例，而奈瑟脑膜炎球菌是引起细菌性脑膜炎的三种主要病原微生物之一，也是唯一引起流行性脑膜炎(流脑)的致病菌。全球流脑的平均发病率为1-10/10万，病死率10%左右，20%以上患者会留下永久的中枢神经系统损伤。
[0003]根据荚膜多糖化学结构的不同，脑膜炎球菌可分为13个血清群，主要的致病菌群是A、B、C、Y和W135群，可引起95%以上的病例。其他如29E、X等血清群也可致病，但病例数较少，最近在非洲发生小规模的X群流脑流行，中国也发现X群病例。在欧洲、美洲和大洋洲等地区，由B群菌株引起的脑膜炎超过1/3，在应用C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的国家，由B群菌株引起的病例超过了 2/3,甚至达到90% (Lucidarme J,等.J Clin Microb11.2009,47(11):3577-3585.) ο在中国，通常认为A群和C群是最主要的致病群。但是近年来，从病人和健康人中分离的脑膜炎球菌菌株中，B群为主要致病群的菌株约占1/3。
[0004]对于A、C、W135和Y群来说，用荚膜多糖及荚膜多糖_蛋白结合物制成的多糖疫苗和多糖结合疫苗可以预防。而B群多糖结构与人体组织成分有同源性，不能制成疫苗。
[0005]目前，只有几种外膜囊泡(OMV)疫苗在局部地区使用，这种疫苗的主要成分是I类外膜蛋白PorA。该蛋白是脑膜炎球菌亚型分类依据，具有高度变异性，因此OMV疫苗仅能用于预防与PorA同亚型的菌株。
[0006]随着基因组学、蛋白组学、逆向疫苗学等的发展，一系列位于细菌表面、能诱导杀菌抗体的疫苗候选蛋白被筛选鉴定出来，主要包括:1类外膜蛋白PorA、奈瑟菌黏附素(NadA)、H 因子结合蛋白(fHbp，其它名称 GNA1870、LP2086、0RF2086、NMB1870、fHBP，具有变异型V1、V2和V3)、肝素结合蛋白(NHBA，其它名称GNA2132)、奈瑟菌表面蛋白A(NspA)等。
[0007]由于脑膜炎球菌表面蛋白存在多样性和变异性，往往多抗原的组合才能达到较好、较广的保护效果，试验证据表明，多抗原的组合能发挥互补和协同作用。2013年I月，Novartis公司开发的一种B群脑膜炎球菌疫苗被欧盟批准上市，其成分为重组的GNA1870-fHbp (变异型VI)融合蛋白、NadA-3、NHBA_GNA2131融合蛋白，以及从NZ98/254菌株制备的OMV (主要成分为PorAl.4)。然而，多抗原疫苗中的各种抗原之间是否存在效价的互相影响以及是否会造成副作用的增大却是疫苗制备过程中潜在的风险。
[0008]因此，基于脑膜炎球菌表面蛋白的多样性和变异性，如何选择合适的蛋白成为研制B群脑膜炎球菌疫苗，乃至通用型脑膜炎球菌疫苗的挑战。故本领域迫切需要开发一种有效且具有一定覆盖面的B群疫苗。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种独特的适用于B群脑膜炎的组合疫苗，其能诱导针对多种脑膜炎球菌的杀菌抗体。
[0010]本发明的第一方面，提供了一种抗原组合，所述的抗原组合包括:
[0011]H 因子结合蛋白变异型 I (factor H binding protein, variantl, fHbp Vl 变异型蛋白)、H因子结合蛋白变异型2 (factor H binding protein, variant2, fHbp V2变异型蛋白)、和肝素结合蛋白(Neisserial Heparin Binding Antigen, NHBA 蛋白)。
[0012]在另一优选例中，所述的组合还包括将fHbp Vl变异型蛋白、fHbp V2变异型蛋白或NHBA蛋白的氨基酸序列分别经过一个或几个氨基酸的取代、删除或添加而形成的衍生蛋白的组合，且所述的衍生蛋白的组合具有激活机体对脑膜炎球菌B群产生免疫应答活性的功能。
[0013]在另一优选例中，所述的fHbp Vl变异型蛋白、fHbp V2变异型蛋白、和NHBA蛋白分别包括野生型和突变型。
[0014]在另一优选例中，所述的fHbp Vl变异型蛋白(如SEQ ID N0.: 1-3)第6-113位氨基酸序列的同源性≥95%。
[0015]在另一优选例中，所述的fHbp V2变异型蛋白(如SEQ ID N0.:4_6)第6-145位氨基酸序列的同源性≥95%。
[0016]在另一优选例中，所述的NHBA蛋白(如SEQ ID N0.: 7-9)第27_87位氨基酸序列的同源性≥85%。
[0017]在另一优选例中，所述的抗原组合中，fHbp Vl变异型蛋白的序列如SEQ IDN0.: 1-3所示；和/或
[0018]所述fHbp V2变异型蛋白的序列如SEQ ID N0.:4_6所示；和/或
[0019]所述NHBA蛋白的序列如SEQ ID N0.: 7-9所示。
[0020]在另一优选例中，所述抗原组合中的蛋白均来自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)。
[0021]本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸组合，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸分别编码本发明第一方面所述抗原组合中的抗原。
[0022]在另一优选例中，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.:10_18所示，分别编码SEQ ID N0.:1-9的蛋白。
[0023]本发明第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸组合中的多核苷酸。
[0024]在另一优选例中，所述的载体为表达载体。
[0025]在另一优选例中，所述的载体中可含有一个或多个本发明第二方面所述多核苷酸组合中的多核苷酸。
[0026]本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有本发明第二方面所述的多核苷酸组合。
[0027]本发明第五方面，提供了一种获得本发明第一方面所述抗原组合的方法，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得本发明第一方面所述的抗原组合。
[0028]本发明第六方面，提供了一种本发明第一方面所述抗原组合的用途，用于制备预防脑膜炎球菌性脑膜炎的疫苗组合物。
[0029] 在另一优选例中，所述的疫苗组合物包括本发明第一方面所述的抗原组合，以及疫苗学上可接受的载体。
[0030]在另一优选例中，所述的抗原组合还可用于作为载体蛋白用于制备多糖-蛋白结合疫苗。
[0031]在另一优选例中，所述多糖可以来自奈瑟脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、伤寒沙门菌、A群链球菌、B群链球菌；多糖可以来自于荚膜多糖、脂多糖、脂寡糖。
[0032]本发明第七方面，提供了一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括本发明第一方面所述的抗原组合，和疫苗学上可接受的载体。
[0033]在另一优选例中，所述的疫苗学上可接受的载体包括铝佐剂、MF59、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG佐剂、卡介菌核糖核酸、单磷酰脂A。
[0034]在另一优选例中，所述的疫苗组合物还可以用于制备联合疫苗。
[0035]在另一优选例中，所述的联合疫苗还包括A群、C群、Y群或W135群疫苗，Hib结合疫苗、肺炎球菌结合疫苗、百日咳白喉破伤风疫苗、伤寒Vi多糖结合疫苗、副伤寒多糖结合疫苗，组成多价脑膜炎球菌疫苗和/或联合疫苗。
[0036]在另一优选例中，所述的疫苗组合物还可以包含NadA、NspA、FetA。
[0037]在另一优选例中，所述的疫苗组合物，fHbp Vl变异型蛋白、fHbp V2变异型蛋白、NHBA蛋白之间的比例为1: (0.5-2): (0.5_2)，优选为1:1:1(按有效成分的重量计)
[0038]本发明第八方面，提供了一种制备本发明第七方面所述疫苗组合物的方法，包括步骤:将本发明第一方面所述的抗原组合与疫苗学上可接受的载体混合，从而获得本发明第七方面所述的疫苗组合物。
[0039]在另一优选例中，所述的抗原组合中的抗原通过基因重组或化学合成获得。
[0040]本发明第九方面，提供了一种预防脑膜炎球菌性脑膜炎的方法，向所需要的对象施用本发明疫苗组合物。
[0041 ] 在另一优选例中，所述的需要的对象包括哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、大鼠、兔。
[0042]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1显示了 fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA等3种蛋白基因的PCR扩增产物电泳图谱。
[0044]图2显示了重组表达fHbp-l、fHbp_2和NHBA3种蛋白的重组质粒的双酶切鉴定图
-1'TfeP曰。
[0045]图3显示了纯化的重组fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA蛋白SDS-PAGE电泳图谱。
[0046]图4显示了重组fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA蛋白兔血清特异性抗体测定结果。
[0047]图5显示了重组fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA免疫兔血清与细菌结合的FACS试验结果(紫色填充的区域为阴性对照，未填充的红色/蓝色曲线为免疫血清检测结果)。
[0048]图6显示了重组fHbp-la/b、fHbp-2a/b、NHBA_a/b、及其组合免疫血清对细菌的杀囷力试验结果。
[0049]图 7 显示了重组 fHbp-lc、fHbp_2c、NHBA-c、fHbp-lc+fHbp-2c+NHBA_c 免疫兔血清在乳鼠被动免疫保护试验中的结果。
【具体实施方式】
[0050]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了，将来自于脑膜炎球菌的fHbp蛋白的V1、V2变异型以及NHBA蛋白共同组合，组成的抗原能够有效地在体内形成抗脑膜炎球菌B群的免疫，且这种免疫效果呈明显的协同效应。此外，实验证明，将这三种蛋白共同组合使用形成的疫苗能够具有良好的菌株覆盖能力，且鉴于脑膜炎球菌不具备群特异性，本发明疫苗组合物也可在一定程度上覆盖到A群和C群为主要致病群的脑膜炎球菌中，因此，本发明疫苗组合物可用作广谱的抗脑膜炎球菌疫苗。在此基础上，完成了本发明。
[0051]fHbp 蛋白
[0052]fHbp是一种膜表面脂蛋白，许多脑膜炎球菌的菌株都带有其基因，也发现不携带该基因的菌株(Lucidarme J,等.Clin.Vaccine Immunol.2011，18 (6): 1002-1014.)。根据氨基酸序列的不同，该蛋白可以分为3种变异型(VI变异型、V2变异型和V3变异型)，其中V2变异型与V3变异型具有一定的交叉保护作用，而它们与Vl变异型之间交叉保护作用弱。
[0053]变异型1、变异型2和变异型3基因分别编码280个左右氨基酸残基。相同变异型的fHbp蛋白的氨基酸同源性最低可达约90%,不同变异型的fHbp蛋白之间的氨基酸同源性可低至62%。
[0054]可用于本发明的fHbp Vl变异型蛋白没有特别限制，可以为任何野生型或突变型的fHbpVl变异型蛋白。优选地，可用于本发明抗原组合或疫苗组合的fHbp蛋白中，fHbpVl变异型的序列可选自SEQ ID N0.: 1-3，也可包括将SEQID N0.: 1_3进行一个或几个氨基酸添加、删除或取代的氨基酸序列，更优选地，可以是与野生型fHbp Vl变异型蛋白(如SEQID N0.:1-3序列)的第6-113位氨基酸同源性保持在90%以上，较佳地为95%以上的蛋白的序列。
[0055]可用于本发明的fHbp V2变异型蛋白没有特别限制，可以为任何野生型或突变型的fHbpV2变异型蛋白。优选地，可用于本发明抗原组合或疫苗组合的fHbp蛋白中，fHbpV2变异型的序列可选自SEQ ID N0.:4_6，也可包括将SEQ ID N0.:4_6进行一个或几个氨基酸添加、删除或取代的氨基酸序列，更优选地，可以是与野生型fHbp V2变异型蛋白(如SEQ ID N0.:4-6序列)的第6-145位氨基酸同源性保持在90%以上，较佳地为95%以上的蛋白的序列。
[0056]NHBA 蛋白
[0057]NHBA是奈瑟菌属特有的一种脂蛋白，几乎在所有的菌株上表达，但NHBA蛋白氨基酸序列具有一定的变异性，因此针对NHBA的单一疫苗往往无法覆盖大范围的菌株。
[0058]NHBA基因编码的氨基酸残基数约420-500个，不同的NHBA蛋白之间，除单个或多个位点的氨基酸变异外，还存在单个氨基酸或短肽的插入或缺失。不同的NHBA蛋白的氨基酸同源性可低至60%。
[0059]可用于本发明的NHBA没有特别限制，可以为任何野生型或突变型的NHBA变异型蛋白。由于野生型NHBA蛋白的同源性较低，因此一般与SEQ ID N0.: 7_9所示的NHBA蛋白同源性大于60 %，优选大于70 %，更优选地大于80 %的突变型NHBA也可用于本发明的抗原组合或疫苗组合。更优选地，可以是与野生型NHBA蛋白(如SEQ ID N0.:7_9序列)的第27-87位氨基酸同源性保持在85%以上，较佳地为90%以上的蛋白的序列。
[0060]抗原组合
[0061]本发明同时提供了一种含有多蛋白的抗原组合。其中，所述的抗原组合中的蛋白来自于脑膜炎球菌。
[0062]如本文所用，术语“本发明蛋白”指的是本发明抗原组合中一种或多种的蛋白总称。
[0063]如本文所用，术语“抗原”是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。
[0064]如本文所用，术语“fHbp Vl变异型蛋白、fHbp V2变异型蛋白和NHBA蛋白的组合”、“抗原组合”、“本发明蛋白组合”、“本发明组合”可互换使用，指的是将本发明蛋白或其衍生蛋白三者共同组合形成的抗原混合物。
[0065]如本文所用，术语“fHbpVl变异型”、“fHbp变异型1”、“变异型I”可互换使用，指的是脑膜炎球菌B群的fHbp蛋白的Vl变异型。术语“fHbpV2变异型”、“fHbp变异型2”、“变异型2”可互换使用，指的是脑膜炎球菌B群的fHbp蛋白的V2变异型。
[0066]此外，所述抗原组合还可以是以下序列构成的组合:即具有激活机体对脑膜炎球菌B群产生免疫应答活性的、SEQ ID NO:1-9所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):1-5个( 通常为1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3-4个以内，更佳地为1-2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。
[0067]本发明还包括所述的抗原组合的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”、“衍生蛋白”和“类似物”是指基本上保持激活机体对脑膜炎球菌B群产生免疫应答活性的蛋白。本发明的蛋白的片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明蛋白与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的衍生蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物可以是野生型的，也可以是突变型的，这些均属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0068]一类优选的活性衍生物指与SEQ ID N0.: 1-9的氨基酸序列分别相比，有至多5个，较佳地至多3-4个，更佳地至多1-2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0069]表1
[0070]
最初的残基~I代表性的取代I优选的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
【权利要求】
1.一种抗原组合，其特征在于，所述的抗原组合包括: H 因子结合蛋白变异型 I (factor H binding protein, variantl, fHbp Vl 变异型蛋白)、H因子结合蛋白变异型2 (factor H binding protein, variant2, fHbp V2变异型蛋白)、和肝素结合蛋白(Neisserial Heparin Binding Antigen, NHBA 蛋白)。
2.如权利要求1所述的抗原组合，所述的抗原组合中，fHbpVl变异型蛋白的序列如SEQ ID N0.: 1-3 所示；和 / 或 所述fHbp V2变异型蛋白的序列如SEQ ID N0.:4_6所示；和/或 所述NHBA蛋白的序列如SEQ ID N0.:7_9所示。
3.如权利要求1所述的抗原组合，其特征在于，所述抗原组合中的蛋白均来自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)。
4.一种分离的多核苷酸组合，其特征在于，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸分别编码权利要求1所述抗原组合中的抗原。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的多核苷酸组合中的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有权利要求3所述的多核苷酸组合。
7.一种获得权利要求1所述抗原组合的方法，其特征在于，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而获得权利要求1所述的抗原组合。
8.权利要求1所述抗原组合的用途，其特征在于，用于制备预防脑膜炎球菌性脑膜炎的疫苗组合物。
9.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包括权利要求1所述的抗原组合，和疫苗学上可接受的载体。
10.一种制备权利要求8所述疫苗组合物的方法，其特征在于，包括步骤:将权利要求1所述的抗原组合与疫苗学上可接受的载体混合，从而获得权利要求8所述的疫苗组合物。
【文档编号】C12N15/70GK104072590SQ201410290161
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】朱为, 吴根鹏, 袁萍, 黄帼英, 王晓, 毕慧, 荣家康 申请人:上海生物制品研究所有限责任公司