一种猪肺炎支原体选择性分离培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明属于兽医生物学【技术领域】，涉及一种猪肺炎支原体选择性分离培养基及其制备方法。本发明提供的一种猪肺炎支原体选择性分离培养基，其主要成分为水解乳蛋白，酵母浸粉，MEM培养基，Hank’s液，0.1％酚红溶液，健康马血清，青霉素和去离子水，特异性生长抑制血清。本发明的猪肺炎支原体选择性培养基能够用于猪肺炎支原体的快速分离鉴定，配制方法简单可行，试验结果可靠，分离时间缩短为103h～122h，时间缩短17%～23%，分离成功率高达75%以上，是现有培养基分离成功率的10倍以上。
【专利说明】一种猪肺炎支原体选择性分离培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽医生物学【技术领域】，涉及一种猪肺炎支原体选择性分离培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]猪肺炎支原体是引起猪的接触性慢性呼吸道疾病的重要病原之一，在全世界广泛存在，严重危害养猪业健康发展，其主要危害是引起猪的生长受阻、饲料转化率大幅下降，继发引起其他疾病的发生并加重发病症状。猪支原体肺炎灭活疫苗可以减少喘气病的发生，但优质疫苗的前提需要有一种好的疫苗株及地区猪肺炎支原体流行现状来支撑。培养基是人工合成各种营养物质供微生物生长的基质。支原体是一种微小原核生物，无细胞壁，可在人工培养基上生长，形成小菌落，但培养条件要求十分苛刻，且生长速度慢，猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体与猪肺炎支原体常同时存在于猪的体内，且其生长速度均高于猪肺炎支原体，从而开展猪肺炎支原体分离鉴定时常发生污染，而导致猪肺炎支原体分离失败，这样对防治猪气喘病的研究造成困难。在实际生产过程中，猪肺炎支原体典型症状仔猪，病料的猪肺炎支原体的分离率极低，甚至由于猪滑液支原体等病原微生物的污染分离率低至I~5%，亟待一种新的实验方案解决猪肺炎支原体的分离问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种适合猪肺炎支原体生长，且生长快、活菌滴度相对较高且能够抑制猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体生长的猪肺炎支原体选择性分离培养基，使用该选择性分离培养基用于临床分离培养猪肺炎支原体，提高分离过程中支原体生长速度，提高猪肺炎支原体的分离率，特异性和敏感性显著提高，用于猪肺炎支原体分离培养、生化特征、遗传、免疫等方面的研究。
[0004]本发明提供的一种猪肺炎支原体选择性分离培养基，其主要成分为水解乳蛋白，酵母浸粉，MEM培养基，Hank’ s液，0.1 %酚红溶液，健康马血清，青霉素和去离子水，特异性生长抑制血清(猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体)。
[0005]本发明另一目的是提供用于该猪肺炎支原体培养基的制备方法。
[0006]本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
一种猪肺炎支原体选择性分离培养基，其特征在于，按照下列配比制得:水解乳蛋白40~50g，酵母浸粉40~50g，MEM培养基40~50g，10XHank’s液20~60mL，0.1%酚红溶液10~20mL，青霉素500~800万单位，健康马血清1000~2000mL，特异性生长抑制血清25~45mL,去离子水调整至lOOOOmL。
[0007]进一步优化的配比如下:水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培养基49g，10 X Hank’ s液50mL，0.1 %酚红溶液10mL，青霉素600万单位，健康马血清1500mL，特异性生长抑制血清30mL，去离子水调整至lOOOOmL。
[0008]本发明用于猪肺炎支原体选择性分离培养基的制备方法，其特征在于，按照下列步骤制备:
(I)按配比称取水解乳蛋白40~50g、酵母浸粉40~50g、MEM培养基49g溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，加入10 X Hank’ s液20~60mL、0.1 %酚红溶液10~20mL、青霉素500~800万单位,用0.45 μ m滤膜过滤除菌,4°C保存备用。
[0009](2)临用前，加入健康马血清1000~2000mL、特异性生长抑制血清25~45mL，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6~7.8，使用去离子水适量调整至总体积lOOOOmL，即得猪肺炎支原体选择性分离液体培养基。
[0010]本发明所述特异性生长抑制血清是指同时抑制猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体的特异性生长抑制血清。
[0011]本发明的要点在于选择合适的组分制备常规猪肺炎支原体专用培养基，并在该基础上进一步加入猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等三种特异性生长抑制血清，制备成猪肺炎支原体选择性分离培养基，用于猪肺炎支原体的分离培养。在该培养基上，猪肺炎支原体接种后，生长良好。使用前加入制备的生长抑制血清，可抑制猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体的生长，选择性的分离培养猪肺炎支原体。
[0012]本发明具有以下优点:猪肺炎支原体选择性培养基能够用于猪肺炎支原体的快速分离鉴定，配制方法简单可行，试验结果可靠，分离时间缩短为103h~122h，时间缩短17%~23%，分离成功率高达75%以上，是现有培养基分离成功率的10倍以上。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。
[0014]按照下述配方所列配比及按照发明所述的制备方法制得配方一、配方二、配方三，具体如下:
配方一:水解乳蛋白40g，酵母浸粉40g，MEM培养基4(^，10\他1^’8液201^，0.1%酚红溶液10mL，青霉素500万单位，健康马血清1000mL,特异性生长抑制血清25mL，去离子水调整至lOOOOmL。
[0015]制备方法:(1)称取水解乳蛋白40g,酵母浸粉40g, MEM培养基40g溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，加入10 XHankj s液20mL，0.1%酚红溶液10mL，青霉素500万单位，用0.45 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用；(2)加入健康马血清lOOOmL、特异性生长抑制血清25mL，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6，使用去离子水调整至总体积lOOOOmL，即得猪肺炎支原体选择性分离液体培养基一。
[0016]配方二:水解乳蛋白50g，酵母浸粉50g, MEM培养基50g，10XHank，s液60mL，
0.1 %酚红溶液20mL，青霉素800万单位，健康马血清2000mL，特异性生长抑制血清45mL，去离子水调整至lOOOOmL。
[0017]制备方法:(1)称取水解乳蛋白50g,酵母浸粉50g, MEM培养基50g溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，加入10 X Hankj s液60mL，0.1 %酚红溶液20mL，青霉素800万单位，用0.45 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用。(2)加入健康马血清2000mL、特异性生长抑制血清45mL，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.8，使用去离子水调整至总体积lOOOOmL，即得猪肺炎支原体选择性分离液体培养基二。
[0018]配方三:水解乳蛋白458、酵母浸粉458、]\^]\1培养基498、10\他1^’ s液50mL、0.1 %酚红溶液10mL、青霉素600万单位、健康马血清1500mL、特异性生长抑制血清30mL、去离子水调整至lOOOOmL。
[0019]备方法:(1)称取水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培养基49g溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，加入10 XHank’ s液50mL，0.1 %酚红溶液IOOmL,青霉素600万单位，用0.45 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用。(2)加入健康马血清1500mL、特异性生长抑制血清30mL，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6，使用去离子水调整至总体积lOOOOmL，即得猪肺炎支原体选择性分离液体培养基三。
[0020]使用本发明培养基一、培养基二、培养基三作为本发明选用的培养基，使用KM2、A26两种培养基作为对照培养基，进行临床症状典型、且使用PCR方法证实猪肺炎支原体感染阳性的71份病料分别进行了猪肺炎支原体病原分离鉴定，结果如对照实验数据表所示(表 I)。
【权利要求】
1.一种猪肺炎支原体选择性分离培养基，其特征在于，由下列组份按照配比制得:水解乳蛋白40~50g，酵母浸粉40~50g，MEM培养基40~50g，10 X Hank’ s液20~60mL，0.1 %酚红溶液10~20mL，青霉素500~800万单位，健康马血清1000~2000mL，特异性生长抑制血清25~45mL，去离子水调整至lOOOOmL。
2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体选择性分离培养基，其特征在于，所述组份的配比为水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培养基为49g，10XHank’ s液50mL，0.1%酚红溶液10mL，青霉素600万单位，健康马血清1500mL，特异性生长抑制血清30mL，去离子水调整至lOOOOmL。
3.用于权利要求1的一种猪肺炎支原体选择性分离培养基的制备方法，其特征在于，按照下列步骤制备: (1)按配比称取水解乳蛋白40~50g、酵母浸粉40~50g、MEM培养基49g溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，加入10 X Hank’ s液20~60mL、0.1 %酚红溶液10~20mL、青霉素500~800万单位,用0.45 μ m滤膜过滤除菌,4°C保存备用； (2)临用前，加入健康马血清1000~2000mL、特异性生长抑制血清25~45mL，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6~7.8，使用去离子水适量调整至总体积lOOOOmL，即得猪肺炎支原体选择性分离液体培养基。
4.用于权利要求2的一种猪肺炎支原体选择性分离培养基的制备方法，其特征在于，按照下列步骤制备: (1)称取水解乳蛋白45g，酵母浸粉45g，MEM培养基49g溶解于去离子水5000mL，搅拌，使之完全溶解，加入10 X Hank’ s液50mL，0.1 %酚红溶液IOOmL,青霉素600万单位，用.0.45 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存备用； (2)加入健康马血 清1500mL、特异性生长抑制血清30mL，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6，使用去离子水调整至总体积lOOOOmL，即得猪肺炎支原体选择性分离液体培养基。
【文档编号】C12Q1/04GK104017856SQ201410233471
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】李书光, 李峰, 沈志强, 张娜 申请人:山东省滨州畜牧兽医研究院