带有荧光标签的植物表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种带有荧光标签的植物表达载体及其构建方法。该载体为SEQIDNO.1所示的碱基序列。本载体采用在植物体内不同组织器官和不同的发育时期表达最为稳定的UBQ10启动子作为表达载体的启动子，并添加GFP为本载体的报道基因，便于在植物体内更快捷的观察目的蛋白在植物中的表达情况，为生物学研究提供便利。
【专利说明】带有荧光标签的植物表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物表达载体及其构建方法，特别是一种带有荧光标签的植物表 达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 表达载体（Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元 件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个 具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自PBR322和pUC的质粒复制起 点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下 游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp )，其后的多克隆位点可装载 要表达的目标基因。
[0003] 植物表达载体既可以在植物中表达目的蛋白的表达载体。在植物生物学 研究中经常会要求将所要研究的目的蛋白在植物中进行表达，常用的表达载体有 PCAMBIA1300, pCAMBIA2300等，他们的启动子均为35S启动子，替换启动子在植物研究中有 着非常普遍的使用，但在一些需要目的蛋白稳定地表达的科学研究中就存在一定的缺陷， 比如在将植物置于非正常生长温度的条件下生长时其不能稳定的表达目的基因，它会受到 温度的影响而出现波动，所谓稳定地表达即将植物用高于或低于正常生长温度的温度进行 处理后目的蛋白仍能稳定地表达而不受外界条件如温度等的影响。
[0004] GeNorm和NormFinder研究发现泛素结合酶基因18(挪67妁在所有供试基因中表 达稳定性最好，挪你和挪仍P在不同组织器官和发育时期样品中表达最为稳定，而在植物 研究中经常要研究目的蛋白在不同组织器官和发育时期的表达，因此本发明采用在不同组 织器官和发育时期样品中表达最为稳定的挪仍P的启动子为表达载体的启动子，为了能更 简单快捷的观察目的蛋白在植物中的表达情况，本发明在表达载体目的基因后面添加 为报道基因，使其和目的蛋白成为目的蛋白的融合蛋白，更方便快捷的观察目的蛋白 在植物体内的表达情况。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于克服现有技术中植物表达载体在植物中表达不够稳定和 不便观察的问题，提供一种带有荧光标签的植物表达载体。
[0006] 本发明的目的之二在于提供该载体的构建方法。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种带有荧光标签的植物表达载体，其特征在于该载体为SEQ ID NO. 1所示的碱基序 列。
[0008] -种上述的带有荧光标签的植物表达载体的构建方法，其特征在于该方法的具体 步骤为： a.在www. arabidopsis. org网站上下载挪￠7(9的启动子序列，并根据此序列设计引物， 该引物为： 上游III) CCCAAAGCTTCTCTTATAAGTTACAAACCCT 下游（fee I) CCCAAAGCTTCTCTTATAAGTTACAAACCCT ; 在上述的上下游引物的两端分别加入历III和fee I酶切位点，长度选取转录起始 点至上游1814bp，然后进行扩增，并将所扩增的目的片段用Taq酶进行加 A处理(在所扩增 目的片段双链DNA每条链的3'端加上一个突出的碱基A，PMD18-T载体是一种已经线性化 的载体，载体每条链的3'端带有一个突出的T，利用AT配对的原理将目的片段与PMD18-T 载体进行连接)，加 A后进行凝胶回收，将所回收得到的目的片段连入PMD18-T载体； b. 将pl300载体用I进行酶切并回收载体片段，然后将步骤a所得 UBQ10启动子序列用历it/ IlUac I从PMD18-T载体上酶切下并回收，并连入pl300载体 中；然后以及_71、5^ I进行酶切，并回收载体片段备用； c. 在WWW. arabidopsis. org网站上下载6/?°的⑶S序列，根据6/?°序列设计特异性引 物，并在上游和下游引物分别加上和I酶切位点扩增报告基因 ffP，该引物为： 上游该丽71) CGGGATCCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 下游（fe/ I) GCGTCGACGTTTACTTGTACAGCTCGTCC 使用与步骤a中相同的方法，将扩增得到的目的片段进行加 A处理，克隆入PMD18-T载 体进行测序处理。
[0009] d.将步骤b中已经连入UBQ10启动子的pl300载体用及丽71和I酶切，并将 测序正确的片段用相同的酶从PMD18-T载体上酶切下来，将二者进行连接处理，即得到 带有荧光标签的植物表达载体。
[0010] 所述的特异性引物，是指：在上下游引物上加有特异性酶切位点，在挪仍Ρ启动子 的上游引物上添加历III酶切位点，在下游引物上添加 fee I酶切位点，在报道基因 的上游引物上添加及酶切位点，在下游引物上添加 I酶切位点。挪仍P启动子和报 道基因的上下游引物所带的酶切位点可确保挪仍P启动子和报道基因可以连接在 P1300表达载体的相应位置以构建新的植物表达载体。
[0011] 本载体将原有的P1300载体进行改造，将pl300载体中的35S启动子替换成在植 物不同组织器官中都可以广泛且稳定表达的挪仍P启动子，有效的避免了不同器官组织中 35S启动子启动基因的表达的不均一性，并且添加绿色荧光蛋白为本载体的报道基因， 使用该载体时，可以在报告基因前面添加需要过量表达的目的基因，构建成目的蛋白 与的融合蛋白，利用绿色荧光蛋白的荧光特性来直观、快捷的观察目的蛋白的表达情 况，为生物学研究提供便利。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】 图1本发明最终构建好的植物表达载体PUBG5300结构示意图 图2为启动子的PCR扩增 图3为的PCR扩增 图4为转基因拟南芥阳性苗的鉴定 图5为转基因 ΒΥ2细胞阳性细胞团的鉴定 图6为拟南芥阳性苗叶片荧光观察 图7为拟南芥阳性苗花药荧光观察 图8为烟草BY2细胞荧光观察。
【具体实施方式】
[0013] 1.基因组抽提 基因组抽提采用试剂盒抽提方法。试剂盒购自康为世纪生物技术公司。
[0014] 2.UBQ10启动子克隆 在《^￥.8四13丨(1(^8丨8.0找网站下载挪仍(9启动子序列，根据启动子序列设计引物，上下 游引物两端分别加入历III和fee I酶切位点。长度为1841bp。引物合成由上海生工 生物工程公司进行合成。
[0015] 引物序列为： 上游III) CCCAAAGCTTCTCTTATAAGTTACAAACCCT 下游（fee I) CCCAAAGCTTCTCTTATAAGTTACAAACCCT 用上述基因组为模板，采用PCR方法对目的序列进行扩增，扩增采用TAKARA公司生产 的KOD PCR扩增试剂盒。PCR扩增参数为：
【权利要求】
1. 一种带有荧光标签的植物表达载体，其特征在于该载体为SEQ ID NO. 1所示的碱基 序列。
2. -种根据权利要求1所述的带有荧光标签的植物表达载体的构建方法，其特征在于 该方法的具体步骤为： a. 在www. arabidopsis. org网站上下载挪￠76的启动子序列，根据挪￠76序列设计引 物，该引物为： 上游III) CCCAAAGCTTCTCTTATAAGTTACAAACCCT 下游（fee I)CCCAAAGCTTCTCTTATAAGTTACAAACCCT; 在上述的上下游引物的两端分别加入历III和fee I酶切位点，长度选取转录起始 点至上游1814bp，然后进行扩增，并将所扩增的目的片段用Taq酶进行加 A处理(在所扩增 目的片段双链DNA每条链的3'端加上一个突出的碱基A，PMD18-T载体是一种已经线性化 的载体，载体每条链的3'端带有一个突出的T，利用AT配对的原理将目的片段与PMD18-T 载体进行连接)，加 A后进行凝胶回收，将所回收得到的目的片段连入PMD18-T载体； b. 将pl300载体用I进行酶切并回收载体片段，然后将步骤a所得 UBQ10启动子序列用历I从T载体上酶切下并回收，并连入pl300载体中；然 后以及_71、5^ I进行酶切，并回收载体片段备用； c. 根据GFP序列设计引物，引物序列为： 上游该丽71) CGGGATCCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 下游（fe/ I) GCGTCGACGTTTACTTGTACAGCTCGTCC 上述上下游引物的两端分别加入和I酶切位点，再进行扩增，将扩增后的 片段用及丽W、免/ I从T载体上酶切下来，并和步骤b所得的连有挪启动子的p 1300 载体相连接，即得到带有荧光标签的植物表达载体。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤a中的扩增参数为：
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤c中的扩增参数为：
【文档编号】C12N15/65GK104152486SQ201410187618
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】张卫, 郑亚杰, 郑帮, 司英语 申请人:上海大学