生产mstn双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法
【专利摘要】本发明公开了生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法，其利用高效简便的基因修饰技术TALEN技术，设计构建能高效敲除MSTN基因的质粒；通过电转染法转染猪胎儿成纤维细胞，磁珠分选阳性细胞作为供体细胞，化学辅助去核方法去核后进行体细胞核移植；经胚胎移植确定妊娠后26-36天取出胎儿进行基因测序，以MSTN双侧基因敲除胎儿细胞作为供体细胞再次体细胞核移植，胚胎移植；足月分娩后免疫组化及形态学观察，确定为双肌性状克隆猪。获得MSTN-/-双侧敲除的双肌性状克隆公猪，取精液对发情母猪进行人工受精，获得大量双肌猪。本发明工艺简单，易于实施，且可产业化生产双肌猪，利于农业生产和医学研究。
【专利说明】生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种克隆动物模型的构建方法，特别是一种生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法。
【背景技术】
[0002]随着人们对营养与健康的日渐重视，市场的瘦肉需求量也越来越大，而这种现象却导致了“注水猪肉”、“瘦肉精”、“三聚氰胺”等事件的发生，对人们的健康和生活造成了严重的困扰。中国是全世界最大的猪肉生产和消费大国，在生猪存栏量减少的情况下，人均猪肉占有量呈现上升势头。肌肉是动物胴体的最重要的组成部分，肌肉的生产是动物生产学中三大生产方向(肉、蛋、奶)之一，肌肉的产量是肉用畜禽的重要的经济性状，也是畜牧生产中最重要的生产方向。为此，长期以来育种学家们都将肌肉生产列为主要的研究目标。同时在医学方面肌肉消耗和衰竭症状的患者正逐年增多，为患者生产能够使双肌性状的克隆猪模型项目的启动迫在眉睫。
[0003]肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)是近几年来发现的骨骼肌生长的负调控因子，其活性的丧失，会引起动物肌肉的过度发育，肌纤维直径变大或肌纤维数增加，表现为动物的“双肌”性状。各国科学工作者分别将基因敲除、基因诊断、分子标记辅助育种、转基因等技术应用到畜牧生产上,力求培育出一些高产肉率、肉质好和饲料报酬高的肉用品种。
[0004]体细胞核移植技术是生产转基因猪的最有效方法。体细胞核移植技术与基因修饰技术结合代表了未来转基因技术的发展方向。2000年，Betthauser等系统地优化了猪体细胞核移植的各个步骤，包括卵母细胞的来源和体外成熟培养、供体细胞的培养、核移植后卵的激活、胚胎的体外培养和胚胎移植代孕，建立了一套稳定的猪体细胞核移植程序，为通过核移植技术生产基因修饰猪的技术路线奠定了基础。2001年，Park等报道以转有绿色荧光蛋白基因的猪成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植获得转基因猪，第一次打通了通过体细胞核移植技术生产转基因猪的技术路线。在国内2002年，赖良学等采用这一技术路线，利用同源重组技术敲除小型猪成纤维细胞α-1，3半乳糖苷转移酶(GGTAl)基因，得到四头GGTAl基因敲除克隆猪，第一次实现了猪的基因定点修饰，但此类核移植克隆猪技术还存在效率低的问题。
[0005]参阅CN101892264A等文献，虽然研究人员通过不同方法获得MSTN基因敲除胎儿，但均为MSTN单侧基因敲除，未达到理想的MSTN双侧基因敲除双肌性状健康猪个体。
【发明内容】
[0006]本发明的目的提供一种生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法，以解决现有技术中的技术问题。
[0007]为实现上述目 的，本发明提供如下技术方案:
[0008]一种敲除MSTN双侧基因的TALENs基因表达盒，其特征在于包含SEQ.N0.1~2所示的核酸序列。[0009]上述TALENs基因表达盒在生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪中的应用。
[0010]一种敲除MSTN双侧基因的TALENs质粒，包含用以切割MSTN基因特异位点而形成上述基因表达盒的TALENs质粒。
[0011]上述TALENs质粒在生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪中的应用。
[0012]利用上述TALENs基因表达盒或上述TALENs质粒构建的MSTN基因敲除阳性细胞系O
[0013]上述MSTN基因敲除阳性细胞系在生产双肌性状体细胞克隆猪中的应用。
[0014]一种生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法，包括如下步骤:
[0015](I)提供上述TALENs质粒，其作用靶位点位于MSTN基因第一外显子的特定序列，其如SEQ.N0.3所示；
[0016](2)提供猪胎儿成纤维细胞，并通过电转染法以所述质粒转染猪胎儿成纤维细胞，再分选出其中的阳性细胞作为供体细胞，且利用化学辅助去核方法去核后进行体细胞核移植；
[0017](3)经胚胎移植确定妊娠后26-36天取出胎儿建立胎儿成纤维细胞后进行基因测序;
[0018](4)以步骤⑵所获MSTN双侧基因敲除胎儿细胞作为供体细胞再次体细胞核移植，实现胚胎移植；
[0019](4)足月分娩后免疫组化及形态学观察，确定为双肌性状克隆猪；
[0020](5)利用步骤(4)所获MSTN双侧敲除的双肌性状克隆公猪，取精液对发情母猪进行人工受精，进而批量生产双肌猪。
[0021]与现有技术相比，本发明的优点包括:开发了一种生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法，其工艺简单，易于实施，且可产业化生产双肌猪，当应用于农业方面时，将改进肌肉质量和重量，生产具有商业化性质的优良品种家畜，而在医学领域也会对人的肌肉萎缩、肌营养不良等疾病提供良好的治疗切入点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的工艺流程图；
[0023]图2所示是本发明中TALEN介导的猪胎儿成纤维细胞及磁珠分选MACS后的富集细胞；
[0024]图3所示是本发明中公猪胎儿成纤维细胞的MSTN基因测序结果，其中，黑色加粗部分为碱基插入，“---”为碱基缺失。
[0025]图4所示是本发明所获的MSTN+双侧敲除体细胞克隆公猪的照片；
[0026]图5所示是本发明中肌肉形态测定分析图谱，经HE染色MSTN+双侧敲除公猪(图4b)比对照组(图4a)肌纤维明显肥大；
[0027]图6所示是本发明中免疫印迹分析图谱，MSTN+双侧敲除公猪Myostatin基因没表达；
[0028]图7所示是本发明中以Scion Image软件测量肌纤维直径分析400个肌纤维，并计算平均值所获图谱，结果显示MSTN+双侧敲除公猪肌纤维直径比对照组肌纤维明显大；[0029]图8所示是本发明中大量生产MSTN+猪的方法的示意图。
【具体实施方式】
[0030] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]本发明的主旨在于提供一种生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法，其利用目前最高效简便的基因修饰技术TALEN技术，结合体细胞克隆技术获得MSTN双侧基因敲除的双肌性状克隆猪，并可应用双肌猪的规模化生产。
[0032]更为具体的讲，参阅图1，本发明的工艺包括:利用TALEN技术，设计构建能高效敲除肌生成抑制素基因的质粒和编码TALENs的信使核糖核酸；通过电转染法转染猪胎儿成纤维细胞，磁珠分选阳性细胞作为供体细胞，化学辅助去核方法去核后进行体细胞核移植；经胚胎移植确定妊娠后26-36天取出胎儿建立胎儿成纤维细胞后进行基因测序，以MSTN双侧基因敲除胎儿细胞作为供体细胞再次体细胞核移植，胚胎移植；足月分娩后免疫组化及形态学观察，确定为双肌性状克隆猪；获得MSTN双侧敲除的双肌性状克隆公猪，取精液对发情母猪进行人工受精，获得大量双肌猪。
[0033]体细胞克隆获得的胎儿建立成纤维细胞后进行基因测序，10种体细胞体株的MSTN基因发生突变，其中3株细胞为MSTN基因双侧突变具体为F1、F2、19_3，7株细胞为MSTN基因单侧基因突变具体为F3、F5、F9、18-2、18-3、19-1、19-4，突变部位的碱基序列如图2所示。对获得的10个阳性突变胎儿细胞系永久冷冻保存并提供未来大量克隆基因突变猪。
[0034]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0036]实施例1:TALEN的构建
[0037]针对MSTN基因特异位点的TALENs设计和构建由韩国ToolGen公司完成(NCBI基因编号:399534 ;基因组序列号:NC_010457.3)。经生物信息学方法分析和在酵母中的DNA切割能力比较，最终确定了 I对TALENs，作用靶位点位于MSTN基因第一外显子特定序列(表 I)。
[0038]TALEN是由一个TAL复制域和一个核酸内切酶的切割域(Fok I )构成。Fok I的切割域形成RR或DAS的异质二聚体，可以打靶MSTN基因突变exonl位点。TALENs由ToolGen公司构建。424TAL效应子阵列质粒构建由一共84个TAL效应子质粒构成，其中包括64个三单元模块质粒，16个二单元模块质粒和4个多单元模块质粒排列成NN、HD、NI和NG的所有可能组合。RVD模块的建立采用GenScript技术。为了避免不良反应，本发明排除了人类罕见的密码子和有限的最大序列鉴别不同的RVDs81%。每84个质粒由适当的引物进行PCR扩增，根据6个TAL效应子阵列的位置由BsaI消化。PCR扩增子在以卡那霉素抗药性选择标记的主链载体扩增亚克隆。8个FokI表达质粒含有氨苄西林抗药性基因、CMV启动子、一个HA附加表位、核定位信号、AvrBs3的η端135个氨基酸,其中一个中心四个RVD半复制和sharkeyFokl切割域(DAS或RR) 32。
[0039]表1 TALEN-MSTN对应的DNA结合位点
[0040]
【权利要求】
1.一种敲除MSTN双侧基因的TALENs基因表达盒，其特征在于，包含SEQ.N0.1~2所示的核酸序列。
2.权利要求1所述TALENs基因表达盒在生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪中的应用。
3.一种敲除MSTN双侧基因的TALENs质粒，其特征在于，包含用以切割MSTN基因特异位点而形成上述基因表达盒的TALENs质粒。
4.根据权利要求3所述的TALENs质粒，其特征在于，与所述质粒相应的NCBI基因编号为399534 ;基因组序列号为NC_010457.3。
5.根据权利要求3或4所述的TALENs质粒，其特征在于，所述质粒的作用靶位点位于MSTN基因第一外显子特定序列，该特定序列如SEQ.N0.3所示。
6.权利要求3或4所述TALENs质粒在生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪中的应用。
7.利用权利要求1至2中任一项所述TALENs基因表达盒或权利要求3至4中任一项所述的TALENs质 粒构建的MSTN基因敲除阳性细胞系。
8.权利要求7所述MSTN基因敲除阳性细胞系在生产双肌性状体细胞克隆猪中的应用。
9.一种生产MSTN双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)提供权利要求3至4中任一项所述的TALENs质粒，其作用靶位点位于MSTN基因第一外显子的特定序列，该特定序列如SEQ.N0.3所示； (2)提供猪胎儿成纤维细胞，并通过电转染法以所述质粒转染猪胎儿成纤维细胞，再分选出其中的阳性细胞作为供体细胞，且利用化学辅助去核方法去核后进行体细胞核移植； (3)经胚胎移植确定妊娠后26-36天取出胎儿建立胎儿成纤维细胞后进行基因测序； (4)以步骤(2)所获MSTN双侧基因敲除胎儿细胞作为供体细胞再次体细胞核移植，实现胚胎移植； (4)足月分娩后免疫组化及形态学观察，确定为双肌性状克隆猪； (5)利用步骤(4)所获MSTN双侧敲除的双肌性状克隆公猪，取精液对发情母猪进行人工受精，进而批量生产双肌猪。
【文档编号】C12N15/63GK103952424SQ201410168615
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】尹熙俊, 金奭中, 金进秀, 康锦丹 申请人:尹熙俊