一种热激转录因子及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了一种热激转录因子、编码所述热激转录因子的核苷酸序列以及它们在提高植物耐热性中的应用。所述热激转录因子的过表达可以明显地提高转基因植物的耐热性，而不会给植物带来生长延迟和矮化的不良影响，因此，它在提高植物耐热性的应用上具有独特的优势。
【专利说明】一种热激转录因子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，具体涉及植物热激转录因子及其应用。
【背景技术】
[0002]通过高温预处理，植物可以获得一定的耐热性。作为一类重要的分子伴侣，热激蛋白(heat shock proteins,Hsps)的积累在这一过程中发挥着关键的作用。热激蛋白编码基因的表达在转录水平受热激转录因子(heat shock transcription factors, Hsfs)调控，后者通过结合在热激蛋白基因启动子区域内特异的热激原件(heat shock element, HSE)上，进一步激活其表达(Vierling等，1991 ;Sun等,2002)。
[0003]Hsf基因首先从酵母中克隆，之后在果蝇、哺乳动物中也相继得以克隆(Wul995;Morimotol998 ;Sch6ffl等，1998 ;Nover等，2001)。热激转录因子主要包括以下几个重要的结构域:DNA 结合域(DNA binding domain, DBD)、寡聚域(oligomerization domain, 0D)、核定位信号(nuclea r localization signal,NLS)和转录激活域(activator domain, AD)(Damberger 等，1994 ;Harrison 等，1994 ;Vuister 等，1994 ;Wul995 ;Nover 等，1996 ;Schultheiss 等，1996)。
[0004]与酵母、果蝇、哺乳动物只有I个Hsf不同，植物拥有多个，且根据上述重要的结构元件，将其分为A，B, C三类(请参见图1)。大量研究表明，只有A类Hsf自身拥有转录激活功能，可以独立地完成基因表达的调控。而大量的B类和C类成员，本身没有转录激活功能。番茄中的HsfBl是一类共激活子，与A类Hsf协同作用(Bharti等，2004)。拟南芥BI是 A 类成员的抑制子(Czarnecka-Verner 等，2000 ；Czarnecka-Verner 等，2004)。
[0005]番茄中，HsfAla是诱导耐热性的主要调节者(Mishra等，2002)，而HsfA2是I个严格受热激诱导的Hsf，而且它在热胁迫和恢复循环中具有较高的激活潜力，并且能连续积累，因此，HsfA2被认为是耐热性细胞中的I个统治性的Hsf，它不但能激活Hsp的转录，还可以激活抗坏血酸过氧化物酶Apx基因(Apx2)的表达(Scharf等，1998a, b ;Morimoto2002 ;Busch等，2005)。过表达LpHsfAla的番爺表现出较好的热耐受性Mishra等,2002);过表达AtHsfA2不仅可以提闻转基因拟南介耐热和盐胁迫的能力，还可以促进根系愈伤的形成(Nishizawa et al，2006)。过量表达0sHsfA2e可以明显提高转基因拟南芥植株对热和过氢化氢的耐受性(Yokotani等，2008)。过量表达HsfA类基因，如AtHsfA2和0sHsfA2e，均可以提高转基因植物在逆境下的耐受性，然而伴随着耐热和耐盐性的提高，植株表现出了生长延迟、矮化的现象。
[0006]因此，在转基因植物的抗性研究尤其是抗热性和耐盐性研究中非常需要获得在保证耐热性的同时能够防止生长延迟、矮化等现象发生的热激转录因子。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种在保证耐热性的同时还能够防止生长延迟、矮化等现象发生的热激转录因子。本发明的目的是通过如下技术方案来实现的。[0008]1、一种热激转录因子，其中，所述热激转录因子与SEQ N0.2具有至少50%，例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
[0009]2、一种热激转录因子，其中，所述热激转录因子由与SEQ N0.1具有至少50%例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的核苷酸序列编码。
[0010]3、一种核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ N0.1具有至少50%，例如60%、70%、80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
[0011]4、用于克隆如技术方案I或2所述的转录因子或技术方案3所述的核苷酸序列的引物，所述引物选自由SEQ N0.3至SEQ N0.11组成的组。
[0012]5、由技术方案4所述的引物克隆得到的产物，优选的是，所述产物从百合植物中克隆得到。
[0013]6、一种载体,所述载体包含如技术方案3所述的核苷酸序列。
[0014]7、如技术方案6所述的载体,其中,所述载体为质粒载体或者表达载体。
[0015]8、一种 宿主细胞，所述宿主细胞包含如技术方案3所述的核苷酸序列。
[0016]9、一种克隆如技术方案I或2所述的热激转录因子或技术方案3所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用如技术方案4所述的引物进行克隆。
[0017]10、如技术方案I或2所述的热激转录因子或者如技术方案3所述的核苷酸序列在提高植物耐热性的同时防止植株矮化或生产延迟中的应用。
[0018]本发明所提供的热激转录因子的过量表达明显提高拟南芥耐热性状，没有提高其耐盐性。更重要的是，过量表达不会造成转基因植株生长的延迟和矮化，这将使百合热激转录因子(Hsf)编码基因LlHsfA2在改善植物耐热性状的应用上具有独特的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1显示了热激转录因子结构与分类。从N端到C端分别是DBD:DNA结合域；0D:寡聚域；NLS:核定位信号；AD:转录激活域和NES:核输出信号。
[0020]图2显示了 LlHsfA2氨基酸多序列比对、DNA结合域三维结构和分子进化分析。其中，A:LlHsfA2 (百合)，AtHsfA2 (拟南芥)，LpHsfA2 (蕃茄)和0sHsfA2 (水稻)的多序列比对，DBD: DNA结合域；OD:寡聚域；NLS:核定位信号；NES:核输出信号。阴影背景下划实线序列:AD-1 (转录激活域-1);阴影背景下划虚线序列:AD-2(转录激活域
的DNA结合域三维结构图，α代表α螺旋；β代表β折叠；Τ代表转角。C:LlHsfA2和已知的HsfA2的DNA结合域序列的进化树分析。黑点标注为LlHsfA2。
[0021]图3显示了 LlHsfA2的表达模式。其中，A:LlHsfA2在热(37°C )，ImM过氧化氢(H2O2)和IOOmM氯化钠(NaCl)处理下的表达情况；B:37°C下，LlHsfA2在根(R)，茎(B)和Rf (L)中的表达情况。C(Control);对照；H:37°C热激处理I小时；C:37°C下，LlHsfA2在百合‘白天堂’和‘元帅’中的表达情况。
[0022]图4显不了绿色灭光蛋白亚细胞定位(A:绿色灭光蛋白对照；B:绿色灭光蛋白融合 LlHsfA2)。
[0023]图5显示了转LlHsfA2拟南芥生长情况。A:幼苗期野生型和3个独立的转基因株系(2-5、4-7和7-6) ；B:生育期野生型和3个独立的转基因株系。[0024]图6显示了转LlHsf A2拟南芥分子和生理水平检测。野生型和3个独立的转基因株系(2-5、4-7 和 7-6)。其中，A:百合 LlHsfA2，和拟南芥 AtHsplOl，AtHsp25 及 AtApx2 的表达情况；B:拟南芥Apx酶活性；C:拟南芥AsA含量。
[0025]图7显示了转LlHsfA2的3个株系(2_5、4_7和7_6)和野生型拟南芥耐热性测定。其中，A:未高温处理的野生型和转基因拟南芥幼苗；B:经45°C高温处理Ih的野生型和转基因拟南芥幼苗。
【具体实施方式】
[0026]本发明在第一方面提供了一种热激转录因子，其中，所述热激转录因子与SEQN0.2 具有至少 50 %，例如 60 %、70%、80 %、90 %、91 %、92 %、95 %、97%、98 %、99% 或100%的同一性。在一些实施方式中，所述热激转录因子可以由与SEQ N0.1具有至少50%例如 60%,70%,80%,90%, 91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一性的核苷酸
序列编码。
[0027]本发明在第二方面提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ N0.1具有至少50%，例如 60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一性。
[0028]本发明在第三方面提供了用于克隆上述热激转录因子或上述核苷酸序列的引物，所述引物选自由SEQ N0.3至SEQ N0.11组成的组。所述引物对可以用于克隆如上所述的热激转录因子或者其核苷酸序列，或者可以用于对所述热激转录因子进行检测。
[0029]本发明在第四方面提供如上所述的引物对克隆得到的产物。在一些实施方式中，所述产物从百合植物中克隆得到。所述产物可以是所述引物对直接克隆得到的产物，例如单链或者双链的DNA，或者可以是间接产物，例如由所述直接产物翻译得到的氨基酸序列。
[0030]本发明在第五方面提供了一种载体，所述载体如上所述的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述载体可以为质粒载体。在另外一些实施方式中，所述载体可以为表达载体。
[0031]本发明在第六方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的核苷酸序列，所述宿主可以例如为大肠杆菌等。
[0032]本发明在第七方面提供了一种克隆如上所述的热激转录因子的方法，所述方法采用如上所述的引物进行克隆。
[0033]本发明在第八方面提供了如上所述的热激转录因子或者如上所述的核苷酸序列在改变植物耐热性上的应用。所述应用根据应用目的，例如可以通过将上述热激转录因子转入目标植物以使该热激转录因子过表达，或者根据需要使目标植物内的所述转录因子基因沉默。在一些优选的实施方式中，所述改变植物耐热性是提高植物耐热性。
[0034]下文将通过实施例对本发明进行进一步的说明。应当理解的是，这些实施例仅仅出于说明目的，不应被理解为是对本发明请求保护的范围的限制。
[0035]实施例
[0036]实验材料将从铁炮百合‘白天堂’(Liliumlongiflorum Thunb.var.scabrumMasamune, ‘White heaven’)小鳞茎上分化的小苗在MS培养基上生长30天，将其置于37°C处理I小时，取其叶片，用于RNA的提取。
[0037]基因克隆
[0038]米用Invitrogen Trizol reagent (货号:15596-026)进行总 RNA 提取，具体操作如下:
[0039]具体步骤
[0040]I)取新鲜叶片0.1g(克)放入1.5ml (毫升)离心管中，加入少量液氮。
[0041]2)待液氮即将挥发完时，用研杵快速将材料研成粉末，加入1mlTrizol，充分混匀。
[0042]3)室温放置3min (分钟)，加入200 μ I氯仿，剧烈震荡30s (秒)，室温放置5min。
[0043]4) 4°C，12，OOOg离心15min，将上清小心移入I个新的离心管中。
[0044]5)加入400 μ I异丙醇，室温放置IOmin, 12, 000离心10min0
[0045]6)弃上清，加入lml75%乙醇漂洗一次，放入超净台中吹干lOmin。
[0046]7)每个样品加入20 μ I DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的ddH20(双蒸水)，65°C助溶lOmin，之后可用于下步实验或保存于-20°C备用。
[0047]用Invitrogen Super Script II (货号:18064-014)对 I μ g RNA 进行逆转录反应，操作如下:
[0048]I)在200 μ I离心管中加入I μ 120 μ M引物，I μ IlOmM dNTP Mix (宝生物工程公司)，8 μ I 总 RNA。
[0049]2) 65°C保温5min，迅速转移止冰上2min。
[0050]3)依次加入下列成份，轻柔混匀。
[0051]
【权利要求】
1.一种热激转录因子，其中，所述热激转录因子与SEQ N0.2具有至少50%，例如60%、70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
2.一种热激转录因子，其中，所述热激转录因子由与SEQ N0.1具有至少50%例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的核苷酸序列编码。
3.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ N0.1具有至少50%，例如60 %、70 %、80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
4.用于克隆如权利要求1或2所述的转录因子或权利要求3所述的核苷酸序列的引物，所述引物选自由SEQ N0.3至SEQ N0.11组成的组。
5.由权利要求4所述的引物克隆得到的产物，优选的是，所述产物从百合植物中克隆得到。
6.一种载体,所述载体包含如权利要求3所述的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的载体，其中，所述载体为质粒载体或者表达载体。
8.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求3所述的核苷酸序列。
9.一种克隆如权利要求1或2所述的热激转录因子或权利要求3所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用如权利要求4所述的引物进行克隆。
10.如权利要求1或2所述的热激转录因子或者如权利要求3所述的核苷酸序列在提高植物耐热性的同时防 止植株矮化或生产延迟中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103923198SQ201410168600
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】辛海波, 张华 , 张华丽, 连青龙, 钟雄辉, 王涛, 宋利娜, 赵正楠, 董爱香, 义鸣放, 丛日晨 申请人:北京市园林科学研究院