一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。根据Pi-ta和Pi-b基因抗、感等位基因的差异，开展了分子标记引物的改良、PCR反应组分的摸索以及循环参数的优化，建立了能同时鉴定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法。与单个基因的标记检测方法相比，本发明能够对水稻种质资源或育种群体中Pi-ta和Pi-b的抗、感基因型进行同步鉴定和选择，从而提高稻瘟病抗性基因的聚合育种效率，加速抗病品种的选育。
【专利说明】—种鉴定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域，专用于含P1-ta与P1-b抗性基因水稻资源的鉴定和聚合育种研究。
二、【背景技术】
[0002]稻痕病是由子囊菌(Magnaporthegrisea)引起的一种水稻真菌病害,其危害面积和程度之大已经对水稻高产、稳产造成了严重的阻碍。据统计，全球每年因稻瘟病损失的水稻产量约占总产量的10%~15%，足以供应6000万人I年的口粮(郑钊等，分子植物育种，2009，7(3):385-392)，而我国的稻瘟病危害也相当严重，自上世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，年损失稻谷达数亿公斤(董继新等，农业生物技术学报，2000，8 (I):99-102.)。实践证明，培育抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效的方法。但由于稻瘟病菌变异性强，很多抗性品种种植几年就会丧失抗性(沈瑛等，植物病理学报，1993, 23 (4): 309-313)。因此,利用分子标记辅助选择(Marker-assistedSelection,MAS)技术将多个具有不同抗谱的稻瘟病抗病基因聚合到同一个品种中，是培育具有持久抗瘟性品种的有效措施(HittalmaniS, etal.，TheorApplGenet, 2000，100(7): 1121-1128)。
[0003]随着分子生物学技术的迅速发展，迄今已有50多个主效抗稻瘟病基因被精细定位，其中 24 个基因被克隆(ZhaiC, etal., NewPhytologist, 2011, 189 (I): 1-14; HayashiN, etal., PlantJ, 2010, 64(3):498-510;OkuyamaY, etal., PlantJ, 2011, 66 (3):467-479; YuanB,etal., TheorAppl Genet,2011,122 (5):1017-1028;TakahashiA, etal., BMCPlantBiolog
I,2010, 10:175)。P1-ta和P1-b是最早被克隆的两个主效稻瘟病抗性基因。其中，Pi_ta是目前研究最广泛的稻瘟病抗性基因，该基因起源于籼稻，位于水稻第12染色体着丝点附近区域。P1-ta与无毒基因AVR-Pita直接互作，并遵循基因对基因假说(BryanGT，etal.，PlantCell, 2000，12(11):2033-2046)。Pi_b基因来源于水稻品种“BL1”，位于水稻第2染色体长臂近末端区域，与RFLP标记RZ123，C379，C2782B连锁，该基因对日本大多数稻瘟病菌生理小种具有抗性并受环境因素(如温度、光照等)的诱导和调控(WangZX，etal.，PlantJ, 1999，19(1):55-64)。
[0004]为提高含稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b水稻资源鉴定和品种选育效率，许多研究者进行了大量的尝试，并相继开发了上述两个基因的抗、感位点的功能标记，用于稻瘟病抗性种质资源的筛选、鉴定。李进斌等利用特异性功能标记分析了云南地方稻种中抗性基因P1-ta和P1-b的等位性变异和分布(李进斌等，中国水稻科学，2012，26(5):593-599)；刘华招和时克等利用同样的分子标记分别对黑龙江水稻主推品种和我国主栽品种进行了P1-ta和P1-b基因型的鉴 定和分析(刘华招等，东北农业大学学报，2011，42 (41): 27-31;时克等，植物遗传资源学报，2009，10 (I): 21-26)。这些研究侧重于利用标记分析Pi_ta和P1-b抗性基因在不同水稻品种中的分布，很少涉及对上述标记进行检测方法的优化，同时对抗性基因P1-ta和P1-b进行基因型鉴定的分子标记方法目前尚未见报道。与单一基因分子标记的PCR方法相比，多重PCR在一次反应中就可对多个目标基因的等位性进行检测，具有效率高、成本低等优点，因而在品种资源鉴定和标记辅助育种中有着广阔的应用前景(MaW, etal., Euphytica, 2003, 134(I):51-60;NakamuraT, etal., Genome, 2002, 45(6):1150-1156)。
[0005]为实现对稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b基因型的快速鉴定，本发明通过标记引物的改良、PCR反应组分的摸索以及循环参数的优化，构建了稻瘟病两个抗性基因分子标记的多重PCR反应体系。由于体系内引物之间不存在相互抑制、互补和错配，因而能在同一 PCR体系中能对水稻品种中P1-ta和P1-b两个基因进行同步筛选和鉴定，通过多次试验反复验证，结果非常准确、稳定。因此，作为一种高效的分子标记方法，本发明不仅能有效鉴定水稻品种资源中稻瘟病的抗、感基因型，同时也能应用于P1-ta和P1-b抗性基因的聚合育种，加速稻瘟病抗性水稻品种的培育。
三、
【发明内容】
[0006]技术问题:本发明针对稻瘟病抗性种质筛选和聚合育种中，利用单一 PCR的方法对P1-ta和P1-b基因型进行区分其试验流程较为烦琐，费时费工的状况，通过分析标记引物、PCR反应组分和循环参数对多重PCR体系的影响，构建了稻瘟病抗病基因P1-ta和Pi_b的多重PCR方法。通过在一次PCR反应对稻瘟病基因P1-ta和Pi_b不同基因型进行快速、准确的扩增，以达到抗性资源鉴定和标记聚合育种，是本发明的宗旨。[0007]技术方案:
[0008]本发明“一种鉴定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法”，其特征在于:
[0009]利用PCR反应体系I中，
[0010]抗病等位基因P1-ta特异性引物:
[0011]正向P1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0012]反向P1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0013]抗病等位基因P1-b特异性引物:
[0014]正向P1-b-F 序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
[0015]反向P1-b-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’
[0016]和PCR反应体系II中，
[0017]感病等位基因p1-ta特异性引物:
[0018]正向p1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3’
[0019]反向p1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0020]感病等位基因p1-b特异性引物:
[0021 ]正向 p1-b-F 序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’
[0022]反向p1-b-R 序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’
[0023]鉴定水稻稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法为:
[0024](I)水稻植株基因组 DNA 的提取(SDS 法)，参照 DellaportaSL, etal.，PlantMolBiolRep, 1983，1 (1):19221.)；
[0025](2)将稻瘟病抗病等位基因P1-ta特异性引物与P1-b特异性引物加入PCR反应体系I中，同时将感病等位基因P1-ta特异性引物与p1-b特异性引物加入PCR反应体系II中，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；
[0026](3) PCR反应体系I和II中20 μ LPCR反应体系包括=IOng/μ L的DNA2.0 μ L，含25mmol/LMgCl2 的 10XPCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L, 5U/ μ L 的 Taq0.5 μ L,ddH2013.1 μ L和 4pmol/y L 的引物2.0μ L:其中体系 I 中为引物 P1-ta-F、P1-ta-R、P1-b_F和 P1-b-R 各 0.5 μ L，体系 II 中为引物 p1-ta-F, p1-ta-R, p1-b-F 和 p1-b-R 各 0.5 μ L。
[0027](4) PCR体系I和II中的反应程序包括:95°C预变性3min ;然后94°C变性lmin，55°C复性lmin，72°C延伸lmin，6个循环;再进行94°C变性lmin，55°C复性50s，72°C延伸30s, 32个循环，最后72°C延伸6min，10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；(5)反应产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像；如果体系I所用两对引物能同时扩增出1，042bp和365bp两条特征条带，即为含Pi_ta和P1-b基因的纯合体；如果体系II所用两对引物能同时扩增出1，042bp和803bp两条特征条带，即为含P1-ta与p1-b基因的纯合体；如果体系I和体系II分别扩增出1，042bp和803bp的特征条带，则为含P1-ta与p1-b基因的纯合个体；如果体系I和体系II分别扩增出365bp和l，042bp，则为含p1-ta与P1-b基因的纯合个体。
[0028]有益效果
[0029]本发明提供的“一种鉴定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法”，具有以下优点:(I)本发明方法中的分子标记是根据基因的变异位点设计的功能性标记，能直接反映植株的表型，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定；
[0030](2)本发明方法中的分子标记均为PCR标记，不涉及DNA测序、限制性内切酶等的使用，不存在操作烦琐，费用昂贵等弊端，更为高效、快捷；
[0031](3)本发明提供的多重PCR方法能够实现对含稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的品种资源进行快速、准确的鉴定。由于水稻稻瘟病抗性基因资源相对较多，很难根据其表型进行有效区分，通过本发明提供的分子标记方法能够对大量稻瘟病抗性资源进行检测，直接判定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b是否存在，而不需要通过大量、复杂的遗传试验设计来对其基因来源进行分析；
[0032](4)本发明提供的多重PCR方法能有效用于稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的聚合育种。传统育种的做法，首先是利用含P1-ta和P1-b基因的水稻品种与推广品种进行杂交，然后在分离群体中利用人工接种的方法进行抗病性鉴定，这样的选育方法不仅受植株生长发育阶段的影响，而且耗时、耗力、耗成本。而利用与P1-ta和P1-b基因直接相关的分子标记所构建的多重PCR方法对植株DNA进行检测，可以在苗期鉴定出含P1-ta和Pi_b双基因的目标单株，这样不仅节约育种成本，而且大大提高了稻瘟病抗性品种的选择效率；
[0033](5)与现有单一基因分子标记的PCR方法相比，本发明提供的多重PCR方法通过两个反应体系、一次PCR扩增就可以检测P1-ta和P1-b两个基因的不同基因型。因此不存在操作烦琐，费用昂贵等弊端，更为高效、快捷。
四、【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1抗病等位基因P1-ta和P1-b多重PCR的验证
[0035] (M =DNA分子量标准，100-2，OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因对照品种嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b感病等位基因对照品种丽江新团黑谷；3-12:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因品种南粳44、南粳45、武运粳7号、武运粳8号、武运粳21、武粳15、武香粳14、常农粳5号、盐稻9号、扬粳805)
[0036]图2感病等位基因p1-ta和p1-b多重PCR的验证
[0037](M =DNA分子量标准，100-2，OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因对照品种嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b感病等位基因对照品种丽江新团黑谷；3~12:含pi_ta和pi_b感病等位基因品种徐稻3号、徐稻4号、徐稻6号、镇稻88、淮稻5号、淮稻9号、连粳4号、连粳5号、连粳6号、连粳7号)
[0038]图3抗病等位基因P1-ta和P1-b多重PCR对育种品系基因型的检测
[0039](M =DNA分子量标准，100-2，OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因对照品种嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b感病等位基因对照品种丽江新团黑谷；，3~24:部分检测品系)
[0040]图4感病等位基因p1-ta和p1-b多重PCR对育种品系基因型的检测
[0041](M =DNA分子量标准，100-2, OOObp ；1:含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因对照品种嘉33 ；2:含p1-ta和p1-b 感病等位基因对照品种丽江新团黑谷；3~24:部分检测品系)
五、【具体实施方式】
[0042]为充分公开本发明“一种鉴定稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b的多重PCR方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下:
[0043](I)稻瘟病抗性基因P1-ta和P1-b多重PCR方法的构建
[0044]I)分子标记引物的改良
[0045]根据已知P1-ta和P1-b基因抗、感位点功能标记的引物序列，并对其进行改良。由于5’端序列与扩增产物的特异性无关的原则，调整5’端第I个碱基的序列，避免引物间互补配对；同时GC含量也随之变化，使在同一 PCR体系中能够扩增的四条引物具有相同的退火温度。通过梯度PCR对引物的退火温度进行摸索，明确能够扩增的最适退火温度。
[0046]PCR反应体系I中(退火温度55 °C )，
[0047]抗病等位基因P1-ta特异性引物:
[0048]正向P1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0049]反向P1-ta-R 序列:5，-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0050]抗病等位基因P1-b特异性引物:
[0051 ]正向 P1-b-F 序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
[0052]反向P1-b-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’
[0053]PCR反应体系II中(退火温度55 °C )，
[0054]感病等位基因p1-ta特异性引物:
[0055]正向p1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3’
[0056]反向p1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0057]感病等位基因p1-b特异性引物:
[0058]正向p1-b-F 序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’
[0059]反向p1-b-R 序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’
[0060]2)多重PCR反应体系中反应组分和PCR扩增过程中循环参数的优化
[0061 ] 按照引物、dNTP,DNA聚合酶等用量配制多重PCR体系，进行PCR扩增和电泳检测。结合抗、感等位基因对照材料(含P1-ta和P1-b抗病等位基因对照品种嘉33和含p1-ta和p1-b感病等位基因对照品种丽江新团黑谷)扩增的结果，从引物用量、退火温度、延伸时间和循环数等方面对体系进行调试优化。在体系调试和优化中，主要调整引物浓度相对比例和延伸时间。实验中先加入等浓度的引物量，根据扩增结果再进行调整，增大弱扩增的引物
用量，
[0062]减少强扩增的引物用量；在优化延伸时间时，弱扩增适当延长。最终，在多重PCR反应体系中，使标记引物在含目标基因的对照材料中扩增出清晰的特异条带，而在不含目标基因的对照材料中无特异条带出现。
[0063]PCR 反应体系 I 和 II 中 20 μ LPCR 反应体系包括:10ng/ μ L 的 DNA2.0 μ L，4pmol/μ L 的引物 2.Ομ L:其中体系 I 中引物 P1-ta-F、P1-ta-R, Pi_b_F 和 Pi_b_R 各 0.5 μ L，体系 II 中引物 p1-ta-F、p1-ta-R、p1-b-F 和 pi_b_R 各 0.5 μ L,含 25mmol/LMgCl2 的10XPCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L, 5U/ μ L 的 Taq0.5 μ L 和 ddH2013.1 μ L ；
[0064]PCR体系I和II中的反应程序包括:95°C预变性3min ;然后94°C变性lmin，55°C复性lmin，72°C延伸lmin，6个循环;再进行94°C变性lmin，55°C复性50s，72°C延伸30s, 32个循环，最后72°C延伸6min，10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；
[0065](2)多重PCR扩增试验中所用水稻材料
[0066]验证抗病等位基因P1-ta和P1-b的多重PCR体系(简称体系I)时选用的品种:南粳44 (早熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所)，南粳45 (迟熟中粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所)，武运粳7号(早熟晚粳品种，江苏常州武进稻麦育种场)，武运粳8号(迟熟中粳品种，江苏常州武进稻麦育种场)，武运粳21 (中熟中粳品种，江苏常州武进稻麦育种场)，武粳15 (迟熟中粳品种，江苏省常州市武进稻麦育种场)，武香粳14 (早熟晚粳品种，江苏常州武进稻麦育种场)，常农粳5号(早熟晚粳稻品种，江苏常熟农业科学研究所)，盐稻9号(迟熟中粳品种，江苏沿海地区农业科学研究院)、扬粳805 (迟熟中粳品种，江苏里下河地区农业科学研究院)。
[0067] 验证感病等位基因p1-ta与p1-b的多重PCR体系(简称体系II)时选用的品种:徐稻3号(中熟中粳稻品种，江苏徐淮地区徐州农业科学研究所)，徐稻4号(中熟中粳稻品种，江苏徐淮地区徐州农业科学研究所)，徐稻6号(迟熟中粳稻品种，江苏徐淮地区徐州农业科学研究所)，镇稻88 (中熟中粳品种，江苏镇江丘陵地区农业科学研究所)，淮稻5号(迟熟中粳稻品种，江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所)，淮稻9号(迟熟中粳稻品种，江苏省徐淮地区淮阴农业科学研究所)，连粳4号(中熟中粳稻品种，江苏连云港市农业科学院)、连粳5号(中熟中粳稻品种，江苏连云港市农业科学院)、连粳6号(中熟中粳稻品种，江苏连云港市农业科学院)、连粳7号(中熟中粳稻品种，江苏连云港市农业科学院)。
[0068]对照材料?嘉33(中熟晚粳品种，浙江嘉兴市农业科学研究院)和丽江新团黑谷(云南粳型地方品种)。
[0069]以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为:王才林等，中国稻米，2007，13(2):33-34;仲维功等，江苏农业科学，2011，3:82-83;吴昊等，南京农业大学学报，2007，30 (4):6_10;王晓东等，江苏农业科学，2000，1:16-18;戚莉红等，安徽农学通报，2008，10:123-128;屠美英等，江苏农业科学，2006，6:32-35;邵建国等，上海农业科学，2006，6:40-41;苏月红等，江苏农业科学，2008，5:80-10 ;王爱民等，2005，12:103-104;刘强等，现代农业科技，2010，4:50-51;吴玉玲等，北方水稻，2008，3:153;曾庆连，现代农业科技，2008，2:142;胡春明等，江西农业学报，2008，20(11):47-49;胥益锋等，安徽农学通报，2012，4:25-29;姚丽鸣等，中国农技推广，2008，2:19-20;李健等，江苏农业科学，2013，6:64-65;殷春渊等，作物学报，2010，36 (8):1342-1354;季仁达等，中国稻米，2010，16 (6): 63-64;秦德荣等，安徽农学通报，2012，9:65-66;朱根华等，上海农业科技，2008，2:34;凌忠专等，中国农业科学，2001，34(1): 116-119。
[0070](3)多重PCR体系的验证
[0071]I)水稻品种基因组DNA的提取
[0072]水稻品种基因组DNA 的提取(SDS 法)，参照 DellaportaSL, etal., PlantMolBiolReP, 1983，1 (1): 19221。具体步骤为:取水稻苗期叶片，在_20°C预冷的研钵中用液氮研磨并装Al.5mL 离心管；加入 600uL 提取液(20%SDS，lMTris-HCl，0.5MEDTA，5MNaCl，65°C 预热)，摇匀，65°C温浴30min，中间振荡3~4次；加入1/4体积5MKAC，摇匀后置冰上30min ;加入氯仿-异戊醇(24:1) 300~400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min ；8000~1000Orpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400uL左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戍醇(24:1),摇床上充分振荡,80~90rpm, 30min ；8000rpm离心15分钟，转移上清(400uL左右)至新的离心管；加入2倍体积_20°C预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000rpm离心6min ;弃无水乙醇，加入4°C 70%乙醇，放置lOmin，弃上清，超净工作台上风干Ih ;加入100~200uLTE，-20°C保存。
[0073]2)多重PCR扩增和检测
[0074]PCR反应体系I中，
[0075]抗病等位基因P1-ta特异性引物:
[0076]正向P1-ta-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0077]反向P1-ta-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0078]抗病等位基因P1-b特异性引物:
[0079]正向P1-b-F 序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
[0080]反向P1-b-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’
[0081]PCR反应体系II中，
[0082]感病等位基因p1-ta特异性引物:
[0083]正向p1-ta-F 序列:5，-AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3，
[0084]反向p1-ta-R 序列:5，-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’
[0085]感病等位基因p1-b特异性引物:
[0086]正向p1-b-F 序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’
[0087]反向p1-b-R 序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’
[0088]将稻痕病抗病等位基因P1-ta与Pi_b两对分子标记引物加入PCR反应体系I中，同时将感病等位基因p1-ta与p1-b两对分子标记引物加入PCR反应体系II中，对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增。PCR反应体系I和II中20 μ LPCR反应体系包括:IOng/μ L 的 DNA2.Ομ L，4pmol/y L 的引物 2.0 μ L:其中体系 I 中引物 P1-ta-F、P1-ta-R,P1-b-F 和 P1-b-R 各 0.5μ L，体系 II 中引物 p1-ta-F、p1-ta-R、p1-b-F 和 pi_b_R各 0.5 μ L，含 25臟01/11%(:12的 10XPCRBuffer2.0 μ L，2.5mmol/L 的 dNTP0.4 μ L，5U/μ L 的 Taq0.5 μ L和ddH2013.1 μ L ；PCR体系I和II中的反应程序包括:95°C预变性3min ;然后94°C变性lmin，55°C 复性 lmin，72°C延伸 lmin，6 个循环;再进行 94°C变性 lmin，55°C复性 50s, 72°C延伸30s，32个循环，最后72°C延伸6min，10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；反应产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像。
[0089]3)抗病等位基因P1-ta和P1-b多重PCR体系(体系I)的验证
[0090]以P1-ta和P1-b抗病等位基因已知的10个水稻品种南粳44、南粳45、武运粳7号、武运粳8号、武运粳21、武粳15、武香粳14、常农粳5号、盐稻9号和扬粳805的DNA为模板，利用P1-ta与P1-b抗病等位基因标记对其相应的基因位点进行PCR扩增和电泳。多重PCR体系I检测品种中，南粳44、南粳45等10份材料同时扩增出与含P1-ta和Pi_b抗病等位基因对照品种嘉33相同的两条特征条带1042bp和365bp ;而含pi_ta和pi_b感病等位基因对照品种丽江新团黑谷则无相应的目的条带(图1)，这表明这些品种都含有抗病等位基因P1-ta和P1-b。
[0091]4)感病等位基因p1-ta与p1-b多重PCR体系(体系II)的验证[0092]以P1-ta和P1-b感病等位基因已知的10个水稻品种徐稻3号、徐稻4号、徐稻6号、镇稻88、淮稻5号、淮稻9号、连粳4号、连粳5号、连粳6号和连粳7号的DNA为模板，利用p1-ta与p1-b感病等位基因标记对其相应的基因位点进行PCR扩增和电泳。多重PCR体系II检测的品种中，徐稻3号、徐稻4号等10份材料，同时扩增出与含p1-ta和p1-b感病等位基因对照品种丽江新团黑谷相同的两条特异条带1042bp和803bp ;而含Pi_ta和Pi_b抗病等位基因对照品种嘉33则未扩增出相应的目的条带(图2)，这表明这些品种都含有感病等位基因p1-ta与p1-b。
[0093](4)多重PCR体系在育种中的应用
[0094]利用已建立的多重PCR体系，对自主选育的336份高世代稳定育种品系进行抗病等位基因P1-ta和P1-b以及感病等位基因p1-ta与p1-b的检测。结果显示,336份供试材料中，有112个品系在体系I中能同时扩增出与对照嘉33相同的1042bp和365bp两条抗病等位基因特征条带，占供试材料的33.33%，说明这些品系均含有抗病等位基因P1-ta和P1-b ；10份材料在体系II中检测到与对照丽江新团黑谷相同的1042bp和803bp两条感病等位基因特征条带，占总数的2.98%，说明这些品系含有感病等位基因p1-ta和p1-b ;有7个品系在体系I和体系II分别扩增出1042bp和803bp的特征条带，占总数的2.08%,说明这些品系含有抗病等位基因P1-ta和感病等位基因p1-b ；207个品系在体系I和体系II分别扩增出365bp和1042bp的特征条带，占总数的61.61%，说明这些品系含有感病等位基因p1-ta和抗病等位基因P1-b (图3、图4)。从以上分析可以看出，高世代育种品系中聚合2个抗稻瘟病基因的品系比例较少，抗性基因P1-b的分布频率明显高于抗性基因P1-ta的分布频率，这也同时说明通过传统育种的方法进行抗稻瘟病基因聚合的效率较低(表1)。
[0095]表1.稻瘟病基因P1-ta和P1-b不同基因型在336份粳稻新品系中的分布
[0096]
【权利要求】
1.一种鉴定稻瘟病抗性基因/和的多重PCR方法，其特征在于: 利用PCR反应体系I中， 抗病等位基因朽-h特异性引物:
正向 P1-1a-F 序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
反向 P1-1a-R 序列:5’ -CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’ 抗病等位基因特异性引物: 正向序列:5’ -GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3’
反向 /7Z-A-R 序列:5’ -TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3’ 和PCR反应体系II中， 感病等位基因特异性引物: 正向序列:5’ -AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3’ 反向序列:5’ -CTA CCAACAAGTTCATCAAA-3’ 感病等位基因特异性引物: 正向序列:5’ -TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3’ 反向序列:5’ -TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3’ 同时扩增水稻品种的基因组DNA，如果体系I所用两对引物能同时扩增出1，042 bp和365 bp两条特征条带，即为含/和/7Z-A基因的纯合体；如果体系II所用两对引物能同时扩增出1，042 bp和803 bp两条特征条带，即为含与p1-b基因的纯合体；如果体系I和体系II分别扩增出1，042 bp和803 bp的特征条带，则为含与/7^基因的纯合个体；如果体系I和体系II分别扩增出365 bp和1，042 bp，则为含p1-1a与Pi_b基因的纯合个体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: (1)水稻植株基因组DNA的提取； (2)将权利要求1所述的稻瘟病抗病等位基因特异性引物与特异性引物加入PCR反应体系I中，同时将权利要求1所述的感病等位基因特异性引物与特异性引物加入PCR反应体系II中，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增； (3)PCR反应体系I和II中20 μ L PCR反应体系包括:10 ng/μ L的DNA 2.0 μ L，含 25 mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer 2.0 μ L,2.5 mmol/L 的 dNTP 0.4 μ L,5 U/μ L的Τεφ.5 μ L，ddH20 13.1 μ L和4 pmol/ μ L的引物2.0 μ L:其中体系I中为引物/"1-1a-FJ1-1aUi1-F和各 0.5 μ L,体系 II 中为引物pi-ta-F、pi-b-F和 p1-b-从各 0.5 μ L ； (4)PCR反应体系I和II中的程序包括:95°C预变性3min ;然后94°C变性I min, 55°C复性I min，72°C延伸I min，6个循环；再进行94°C变性I min，55°C复性50 s，72°C延伸.30 8，32个循环，最后721:延伸6 min，10°C冷却10 min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应; (5)反应产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像。
【文档编号】C12Q1/68GK103937890SQ201410152098
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】姚姝, 陈涛, 王才林, 刘燕清, 张亚东, 朱镇, 赵庆勇, 周丽慧, 赵凌, 于新, 赵春芳 申请人:江苏省农业科学院