一种用于改变牛乳过敏原蛋白免疫特性的脉冲电场加工方法
【专利摘要】一种用于改变牛乳过敏原蛋白免疫特性的脉冲电场加工方法，按以下步骤：（1）制备蛋白溶液：用20mM，pH6.8的磷酸盐缓冲液将β-乳球蛋白稀释成0.2mg/ml的均匀蛋白溶液；（2）将步骤（1）的β-乳球蛋溶液进行高压脉冲处理，条件为高压脉冲电场强度为13.33kV/cm，脉冲个数为80，样品收到的总电脉冲处理时间为3200μs。本发明通过脉冲电场可以用于改变牛乳过敏原蛋白的结构，以获取特殊的或期望达到的功能性，对其一级结构和过敏原性的影响，本发明方法简单，操作方便。
【专利说明】—种用于改变牛乳过敏原蛋白免疫特性的脉冲电场加工方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及物理加工领域，特别涉及一种通过非热加工技术改变牛乳过敏原β-乳球蛋白抗原性和过敏原性方法。
【背景技术】
[0002]牛乳具有丰富的营养物质及高的营养价值，是婴幼儿的主要食物蛋白来源。其中，β_乳球蛋白是乳清中最主要的蛋白质之一，其含量占乳清蛋白的50%。但是，β-乳球蛋白具有耐酸和耐蛋白酶水解等特性，消化后仍有完整的β_乳球蛋白及其肽段残存于人体内，容易引起过敏反应。因此，对β_乳球蛋白进行加工处理以达到降低其致敏性具有重要意义。
[0003]牛乳是人们摄入蛋白的主要来源。鲜奶及乳制品必须经过加工才能食用。目前用于改变牛乳过敏原蛋白β_乳球蛋白的加工方法包括生物加工、化学加工、物理加工等技术。其中，生物加工是利用基因工程技术改变过敏蛋白的基因序列；化学加工则通过酶改性和糖基化等方式改变过敏原蛋白的结构，从而达到改变其致敏性的目的。然而这些技术均存在一定的局限性:β_乳球蛋白主要是以构象性表位为主，难以通过序列变化大幅度改变构象性表位；而β_乳球蛋白具有耐酶解特性，导致酶改性的效果不佳，且糖基化过程中产生的中间产物，会引起人们对食物安全性的考量。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是建立一种用于改变牛乳过敏原蛋白免疫特性的脉冲电场加工方法，处理。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现。
[0006](I)制备蛋白溶液:用20mM，pH6.8的磷酸盐缓冲液将β -乳球蛋白稀释成0.2mg/ml的均匀蛋白溶液。
[0007](2)将步骤(I)的β -乳球蛋溶液进行高压脉冲处理，条件为高压脉冲电场强度为13.33kV/cm，脉冲个数为80，样品收到的总电脉冲处理时间为3200 μ S。
[0008]本发明通过SDS-PAGE电泳分析其分子量的变化，并采用竞争抑制性ELISA可以判断出过敏蛋白的抗原性和过敏原性变化。
[0009]本发明通过脉冲电场可以用于改变牛乳过敏原蛋白的结构，以获取特殊的或期望达到的功能性，对其一级结构和过敏原性的影响，本发明方法简单，操作方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为电场强度为13.33kV/cm条件下，不同脉冲处理个数对β-乳球蛋白IgE结合能力的影响。
[0011 ] 图2为脉冲个数为80条件下，不同电场强度对β -乳球蛋白IgE结合能力的影响。【具体实施方式】
[0012]本发明通过以下实施例进一步说明，但本发明并不受其限制。
[0013]实施例1。
[0014]1、高压脉冲技术处理β -乳球蛋白，具体实施过程包括如下步骤。
[0015]I)配制缓冲液:称取3.51 g磷酸氢二钠，1.59 g磷酸二氢钠，超纯水溶解并定容至I L，配制成20 mM, pH 6.8的磷酸盐缓冲液。
[0016]2)制备蛋白溶液:用20 mM,pH6.8的磷酸盐缓冲液将β -乳球蛋白稀释成0.2 mg/ml的均匀蛋白溶液。
[0017]3)高压脉冲处理:所用高压脉冲的电场强度连续可调，双极性方波，脉冲宽度为40 μ S，脉冲频率为1kHz，设定电场强度为13.33kV/cm，改变样液经过处理腔的流速，使样品接受处理的脉冲个数分别为40、80、120、160个；设定脉冲个数为80，然后改变电场强度为 6.67、10、13，33、16，67kV/cm。
[0018]2、SDS-PAGE分析高压脉冲处理后的β -乳球蛋白。
[0019]采用SDS-PAGE电泳检测高压脉冲处理前后β _乳球蛋白分子量的变化，将脉冲处理后的β -乳球蛋白样液与等量的上样缓冲液相混匀，100°c水浴煮沸5min，取20uL进行12%的SDS-PAGE电泳。具体实施过程包括如下步骤。
[0020]I)制备 12% 分离胶:1.2 mL 40% 凝胶贮液、1.5 mL 1.5M pH8.8 Tris-HCl,40 uL10% SDS,32 uL10% AP,400 uL 1% TEMED及1.03 mL超纯水，混匀后移入制胶槽内。然后
用超纯水封口。
[0021]2)制备4%浓缩胶:分离胶凝固后，吸干上方超纯水，加入150uL的40%凝胶贮液、375 uL 的 0.5M Ph6.8 Tris-HCl,15 uL 10% 的 SDS、12 uL10% 的 AP、150 uL 1% 的 TEMED 及800 uL超纯水，混匀后加入槽内，立即插入梳子。
[0022]3)上样以及电泳:将预先准备好的样品加入上样孔，同时加入Marker为对照。设定浓缩胶和分离胶的电流条件分别为6 mA和12 mA,时间分别为20 min和1.0 h。
[0023]4)固定与染色:电泳结束将凝胶置于考马斯亮蓝染液中，时间为30min。
[0024]5)脱色:将凝胶移入脱色液中进行脱色，蛋白条带清晰即可停止。
[0025]6)凝胶成像:使用SQ-GS800光密度扫描仪进行成像。
[0026]3、乳球蛋白抗原性和过敏原性变化的分析。
[0027]以高压脉冲处理后的β -乳球蛋白溶液作为分析样品，通过竞争抑制性ELISA检测其抗原性和过敏原性的变化。未处理蛋白作为对照，可以判断出该过敏蛋白抗原性和过敏原性的改变，具体实施过程包括如下步骤。
[0028]I)构建牛乳过敏患者血清池:选定11位符合既定条件的牛乳过敏患者的血清混合制备而成。这些患者的血清符合以下条件:对牛乳过敏呈阳性；总的IgE水平均>100 IU/mL ;特异性IgE水平均>1 IU/mL。
[0029]2)抗原包被:将高压脉冲处理的β -乳球蛋白溶液稀释至2.5 μ g /mL，在一块酶标板上分别包被上100 μ L，以未处理的β -乳球蛋白溶液为对照。4°C过夜后PBST洗板三次，每次5min。
[0030]3)明胶封阻:每孔加入250 μ L 3%明胶，37°C封阻lh。洗板三次。[0031]4) 一抗反应:另准备一块酶标板以同样的方式进行封阻，洗涤之后，每孔加入1:20稀释度的人血清100 μ L，37°C反应Ih。反应时间结束后，每孔吸取100 μ L转移至第一块板内，37 °C孵育Ih，PBST洗板三次。
[0032]5)二抗反应:每孔加入1:5000稀释度的生物素标记羊抗人IgE 二抗100 μ L，37°C反应lh。PBST洗板。
[0033]6)亲和素反应:每孔加入1:60稀释的HRP-链霉素标记的亲和素100 μ L,37°C反应，洗板。7) OPD显色和检测:每孔加入IOOyL现配制的OPD显色液，37°C避光反应15min，反应结束后每孔50 μ L加入2Μ H2SO4终止液，在490nm处用酶标仪测定OD值
8)结果的计算'IgE结合能力(%) = (1-B/B。)X 100%，B0:无竞争蛋白时的OD值；B:各加工条件下竞争蛋白对应的OD值。
[0034]经120脉冲处理后β -乳球蛋白的条带略微降低；经160脉冲处理后β -乳球蛋白的条带降低较明显；当电场强度达到16.67kV/cm时，β -乳球蛋白的条带条带含量轻微降低。其抗原性和过敏原性变化如附图1所示。在不同脉冲处理条件下，牛乳β_乳球蛋白的抗原性和过敏原性随着脉冲个数的增加先增大后减小，在不同场强处理条件下，其抗原性和过敏原性则出现上升趋势。
【权利要求】
1.一种用于改变牛乳过敏原蛋白免疫特性的脉冲电场加工方法，其特征是按以下步骤: (1)制备蛋白溶液:用20mM, pH6.8的磷酸盐缓冲液将β _乳球蛋白稀释成0.2mg/ml的均匀蛋白溶液； (2)将步骤(I)的β-乳球蛋溶液进行高压脉冲处理，条件为高压脉冲电场强度为.13.33kV/cm，脉冲个数为80，样品收到的总电脉冲处理时间为3200 μ S。
【文档编号】A23J3/04GK103918871SQ201410148142
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】陈红兵, 李欣, 白雨鑫, 高金燕, 何圣发, 杨安树, 吴志华, 佟平 申请人:南昌大学