一种定量检测ggpps1基因的实时荧光定量pcr 检测试剂盒、检测方法及应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种检测肝癌样本肝组织GGPPS1荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括以下成分：特异性引物、荧光定量PCR反应液。本发明还公开了一种检测肝组织GGPPS1荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测肝组织GGPPS1的表达量，检测结果可以作为临床肝癌早期或进展期的诊断标准，本发明操作简便、快速、结果稳定、灵敏度高且特异性强。
【专利说明】—种定量检测GGPPS1基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒、检测方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测领域，更具体的说，是涉及与肝癌的肝组织mRNA表达改变的相关检测技术。为一种通过对组织或细胞提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以准确定量检测标本中GGPPSl mRNA的表达量的试剂盒。
【背景技术】[0002]GGPPSl基因即香叶基香叶基二憐酸合成酶(geranylgeranyl diphosphatesynthase 1，GGPPS1)基因。在蛋白质异戊二烯化修饰过程中起到关键作用，GGPPSl的底物GGPP是小G蛋白发生香叶基化的重要前体。香叶基化是蛋白质的翻译后修饰之一，一般发生在蛋白质C末端保守的半胱氨酸。发生香叶基化的蛋白质包括Ras和Ras相关的小G蛋白如Rho，Rab，Rac，以及三聚体G蛋白的Y亚基，这些受调控的蛋白质都是信号传递通路中重要的分子开关调节蛋白。GGPPSl是甲羟戊酸代谢途径的中间产物，作为催化酶合成GGPP，进而对Ras蛋白家族进行异戊二烯化修饰，针对法尼基转移酶和香叶基转移酶等的抑制物在抗肿瘤药物中已有大量。研究有研究报道，以GGPPSl为药物靶点对于成骨细胞分化与骨骼构建有改善作用(Weivoda and Hohl 2011)，也有研究阐述了 GGPPSl可作为香烟烟雾引发的肺部疾病的治疗靶点(Shen，Gonget al.2011)。
[0003]肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内居男性最常见恶性肿瘤的第五位，居女性第八位，其死亡率居全世界常见恶性肿瘤死亡率第三位仅次于胃癌和肺癌，能够达到五年存活率的比例相当低【I】。全世界每年大约43.7万人被确诊为HCC，其中50%发生在中国，居全球首位。
[0004]在慢性乙肝、丙肝病毒感染，慢性酒精中毒导致的肝癌中，肝硬化是必经阶段。临床研究发现在肝硬化病例中，RAS蛋白表达量有明显的增加【2】。92.7%肝硬化病人中MAPK通路中的RAF、MEK、ERK的表达都明显上调。在肝脏特异性I3DGF-C转基因小鼠模型中，TOGF通过激活RAS活性调节MAPK信号通路促进肝星形细胞的活化和增殖【3】，最终诱发了肝硬化，导致肝癌的形成【4】。还有研究表明RAS介导的MAPK信号通路调控肝硬化过程中肝细胞表皮的间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的过程。RAS蛋白在肝硬化和肝癌中发挥着重要的作用，一方面调节HSC细胞的增殖与活力，一方面调节肝细胞的增殖，同时通过旁分泌机制调节HSC细胞和肝细胞之间的相互作用，促进肝硬化到肝癌的转化，调控肝癌的发生。GGPPSl作为Ras蛋白家族香叶基化修饰的关键分子，通过调节肝星形细胞的活化与增殖并对肝硬化的形成有促进作用，最终调节肝癌的发生发展。另外研究发现，GGPPSl在部分肝切除造成的肝脏再生过程中被Egr-1转录激活，通过促进RAS发生香叶基化修饰进而活化ERK通路，促进肝细胞的增殖。研究还发现在吸烟导致的肺炎、非小细胞型肺癌中【5】和II型糖尿病发生中，GGPPSl也能通过促进RAS的香叶基化修饰，激活MAPK信号通路调节肺癌的形成及胰岛素抵抗的产生【6】。结合RAS在肝硬化与肝癌中的作用，做出推测，GGPPSl可能通过RAS/MAPK信号通路调节肝星型细胞的活性和肝细胞的增殖调控肝硬化到肝癌的转化，GGPPSl可以作为肝癌早期或进展期的分子检测指标。通过搜集临床肝癌病人肝脏癌组织、癌旁组织、正常组织进行GGPPSl的检测分析，研究结果表明:在肝癌病人肝组织样本中，在癌组织中GGPPSl表达量明显高于正常组织及癌旁组织，GGPPSl的表达还与肝癌的临床分期、病人年龄、肿瘤大小有关。
[0005]鉴于目前临床肝癌的检测确诊指标较少，精准度不是特别高，因此需要辅助的分子标记来鉴别肝癌的发生发展，GGPPSl在肝硬化至肝癌的发生发展过程中起重要作用，其表达也随着病程的进展而表达量增加。为临床上肝癌的早期及进展期确诊提供新的分子标记，为临床癌症的诊治争取时间和空间。
[0006]参考文献:
1.Espey DK, Wu XC, Swan J, et al.Annual report to the nation onthe status of cancer, 197 5—2004， featuring cancer in American Indiansand Alaska Natives.Cancer 2007;110:2119-52.2.曹晓蕾，Ras基因在肝癌中表达的意义.南通医学院学报21(2001) 2.3.K.Breitkopfj C.Roeyenj 1.Sawitzaj L.Wickertj J.Floegej A.M.Gressnerj Expression patterns of PDGF-Aj -B，-C and -D and the PDGF—receptorsalpha and beta in activated rat hepatic stellate cells (HSC).Cytokine 31(2005) 349-357.4.J.S.Campbell, S.D.Hughes, D.G.Gilbertson, T.E.Palmer, M.S.HoldrenjA.C.Haranj M.M.0dell, R.L.Bauer, H.P.Renj H.S.Haugen, Μ.M.Yehj N.FaustojPlatelet-derived growth factor C induces liver fibrosis,steatosis, andhepatocellular carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA 102 (2005) 3389-3394.5.N.Shenj T.Gong, J.D.Wang, F.L Mengj L Qiao, R.L Yang, B.Xuej F.Y.Pan, X.J.Zhou, H.Q.Chen, W.Ningj C.J.Li, Cigarette smoke-1nduced pulmonaryinflammatory responses are mediated by EGR-1/GGPPS/MAPK signaling.Am JPathol 178 (2011) 110-118.6.N.Shenj X.Yuj F.Y.Pan, X.Gaoj B.Xuej C.J.Li，An early responsetranscription factor, Egr-1j enhances insulin resistance in type 2 diabeteswith chronic hyperinsulinism.J Biol Chem (2011)。
【发明内容】
[0007]本发明的目的首先是提供一种定量检测GGPPSl基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒。
[0008]其次，本发明还要提供一种定量检测GGPPSl基因的实时荧光定量PCR方法及在肝癌早期诊断及进展期确诊中应用。
[0009]为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下:
本发明首先提供一种定量检测GGPPSl基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其包括:
(1)用于总RNA提取的试剂=Trizol提取液，氯仿，异丙醇，DEPC溶液，无水乙醇；
(2)用于将mRNA反转录为cDNA模板的试剂:1)无RNA酶的超纯水；
2)反转录反应液5XPrimeScript RT Master Mix,由 PrimeScript RTase、RNaseInhibitor>Random 6 mers、01igo dT Primer、dNTP Mixture 以及含 Mg2+的反应 Buffer 组成；
(3)用于Real Time PCR反应的试剂:
1)SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus )；
2)ROX染料；
3)超纯水；
4)GGPPSl的引物:其上游序列如SEQ ID NO:1所示，即5’ -CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3’ ；其下游序列如 SEQ ID NO:2 所示，即5’ -CGTCGGAGTTTTGAG TTGTCT-3’ ；
5)内参基因18SrRNA的引物:其上游序列如SEQ ID NO:3所示，即 5’ -GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3’ ；其下游序列如 SEQ ID NO:4 所示，即5’ -AGCTTATGACCCGCACTTAC-3’ ；
本发明还提供一种GGPPSl荧光定量PCR的检测方法，其由以下步骤构成:
(1)样品总RNA的提取:取30mg组织或者细胞,悬浮于Iml的Trizol中，用组织匀衆器匀浆I左右分钟，室温静置5分钟；向匀浆中加入0.2ml氯仿，震荡15秒，静置2分钟；静置液在4°C，12000rpm，离心10分钟，取上清；向上清中加等体积的异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置20分钟沉淀RNA ;然后在4°C，12000rpm,离心10分钟，弃上清；向沉淀中加入1ml冰水预冷后的用DEPC的水溶液稀释至75%的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀，然后在4°C，12000rpm，离心5分钟，弃去上清，晾干；晾干后的沉淀溶于50 μ I的DEPC水溶液中即得RNA提取液；用DEPC的水溶液对RNA提取液稀释50-60倍后分光光度计测定浓度；
(2)样品cDNA模板的制备，即将提取的RNA反转录为cDNA:根据分光光度计测得的RNA的浓度乘以稀释倍数，计算出原RNA浓度。计算20 μ I体系中总RNA为I μ g时所需原RNA溶液的体积，将计算后各样品所需体积相应加入八连管各孔；向各孔加入反转录反应液 5 X PrimeScript RT Master Mix 4 μ I (包含 PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应 Buffer (含有 Mg+));向各孔加双蒸水至20μ I体积；将加好样品的八连管放入反转录仪，反转录条件设置为37°C，30min(反转录时间)，85°C，15s (反转录酶失活时间)进行反转录，制得cDNA样品。
[0010](3) GGPPSl前体的扩增，即以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增:向96孔板待测孔中加入 10 μ I 体积的SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus ) ( 2X)、
0.5μ I的GGPPSl上游引物、0.5μ I的GGPPSl下游引物、0.4 μ I的ROX染料、7.6 μ I的双蒸水、I μ I的样品cDNA模板，然后混匀，再短甩离心将壁上液体甩下；样品的对照孔中加入:10μ I 体积的SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus ) ( 2Χ)、0.5μ I 的内参基因18S rRNA上游引物、0.5μ I的内参基因18S rRNA下游引物、0.4 μ I的ROX染料、7.6μ1的双蒸水、I y I的样品cDNA I旲板,然后混勾；最后将加好样品和对照反应体系的96孔板放入荧光定量PCR仪中，设置荧光定量PCR扩增条件为:95°C Imin预变性；接40个循环即950C 15S、58°C 15s、72°C 30s。
[0011](4)荧光定量PCR结果分析此处样品是肝癌病人肝组织的癌组织和离癌组织的正常组织，2个样品成组存在的。PCR之后分析2个组织中GGPPSl的相对表达量，18S rRNA是一种管家基因，在所有样品中18S rRNA的表达量相对相等的情况下排除了由于样品本身浓度不同造成的GGPPSl表达量的差异。通过2-Λ ACt法计算GGPPSl在癌组织、正常组织的表达量，并计算两者的比值(表示该分子在病人机体内的动态差异)。高于I的病人定位高水平表达，低于I的病人定为低水平表达，通过该比值诊断肝癌发展进程。
[0012]本发明所述的一种GGPPSl荧光定量PCR的检测方法，所述的被检测对象可以是组织，也可以是细胞。被检测组织可以是来自肝癌病人肝组织中癌组织、癌旁组织、及远离癌巢的正常组织。
[0013]本发明所述的检测试剂盒可以用于肝癌病人肝脏组织中GGPPSl的检测，检测结果可以用于肝癌的早期诊断和肝癌进展期的确定。
[0014]本发明的检测试剂盒为一种通过对组织或细胞提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以准确定量检测标本中GGPPSl mRNA的表达量的试剂盒。结果显示，GGPPSl在癌组织中的表达量明显高于正常组织及癌旁组织。
[0015]本发明方法是通过检测肝组织中GGPPSl mRNA的表达变化量，预警肝组织的癌变是否发生及肝癌的发生发展情况。因GGPPSl在肝癌病人肝组织中高表达，随着病情进展表达量增加，所以，如果GGPPSl检测结果显示表达量增加，则肝脏发生病变并有癌变的可能，为肝癌的确诊及诊治过程提供重要信息。
[0016]本发明具有如下的有益效果:
本发明的临床意义是跟踪检测肝脏癌变的发生和病理演变过程中GGPPSl mRNA表达量的变化，预警肝癌发生发展趋势。本发明的试剂盒与临床上其它癌症标志物，以及影像学检查有显著不同。本发明可以在基因转录的产物mRNA水平检测GGPPSl基因异常表达，在影像学尚未发现占位性癌病灶之前，未形成肿瘤之前，能够及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床肝癌病患一个真正的早期诊断及确诊。这样才有可能实施癌症的早期筛查、早期预防、早期治疗、有可能从根源上彻底根治肝癌恶疾。
[0017]此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时本发明的检测方法操作方便简单，能在医院普遍使用和推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为肝癌病人肝组织样本中高表达的GGPPSl。显示34组癌组织(tumor tissues(TT))样本中GGPPSl相对正常组织(tumor-free (TF))表达量通过实时定量PCR测量后的对数倍性变化图，在肝癌组织中GGPPSl表达量明显高于癌旁组织。
[0019]图2为临床肝癌病人肝脏组织GGPPSl的mRNA表达水平与肿瘤体积大小相关性的结果分析图。
[0020]图3为免疫组化实验分析临床肝癌病人肝组织中GGPPSl表达水平与病理特征相
关性结果。
[0021]【具体实施方式】:
实施例1:
1.材料(1)用于总RNA提取的试剂:
1)Trizol 提取液 Iml ；
2)氯仿0.2ml ；
3)异丙醇；
4)1%DEPC 溶液；
5)75%冷乙醇Iml (100%无水乙醇:DEPC溶液=3:1);
(2)用于将mRNA反转录为cDNA模板的试剂:
1)无RNA酶的超纯水；
2)反转录反应液5XPrimeScript RT Master Mix 4 μ I(由 PrimeScript RTase>RNaseInhibitor>Random 6 mers、01igo dT Primer、dNTP Mixture 以及含 Mg2+的反应 Buffer 组成)；购自 TAKARA 公司(Code N0.RR036A)
(3)用于RealTime PCR反应的试剂:
1)SYBRPremix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus )(2Χ)10μ I ;购自 TAKARA 公司(CodeN0.RR820A)
2)ROX Reference II (50X ) 0.4 μ I ;购自 TAKARA 公司(Code N0.RR820A)
3)超纯水；
4)GGPPSl的引物(10 μ Μ)上游及下游各0.5 μ I:
其上游序列如SEQ ID NO:1所示，即5’-CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3’;其下游序列如SEQ ID NO:2 所示，即 5’ -CGTCGGAGTTTTGAGTTGTCT-3’ ；
5)内参基因18SrRNA的引物(10 μ Μ)上游及下游各0.5 μ 1:
其上游序列如SEQ ID NO: 3所示，即5’-GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3’;其下游序列如SEQID NO:4 所示，即 5’ -AGCTTATGACCCGCACTTAC-3’ ；
(4)荧光定量PCR由Mx3005P荧光定量PCR仪完成
2.引物的设计:
根据引物设计软件，遵守实时荧光定量引物设计原则，使用Primer Express 2.0软件分析GGPPSl及18S rRNA设计所需引物，并由Genecore (上海基康)公司合成:
1)GGPPSl的引物:其上游序列如SEQ ID NO:1所示，即5’ -CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3’ ；其下游序列如 SEQ ID NO:2 所示，即5’ -CGTCGGAGTTTTGAGTTGTCT-3’ ；
2)内参基因18SrRNA的引物:其上游序列如SEQ ID NO:3所示，即 5’ -GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3’ ；其下游序列如 SEQ ID NO:4 所示，即5’ -AGCTTATGACCCGCACTTAC-3’ ；
荧光定量PCR引物设计的原则:1)引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的3 O O- 4 O O b P区域内。2)产物不能形成二级结构。3)引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。4)G+C含量在40%-60%之间，45%-55%最佳。5)碱基要随机分布，尽量均匀。6)引物自身不能有连续4个碱基的互补。7)引物之间不能有连续4个碱基的互补。8)引物5’端可以修饰。9)3’端不可以修饰，而且要避开AT，GC丰富的区域，避开T/C，A/G连续结构(2-3个)。10)引物3’端要避开密码子的第3位。11)引物整体设计自由能分布5 ‘端大于3 ‘端,且3 ‘端自由能最好小于9KJ/mol。12)荧光定量产物长度在80-150bp最好，最长不超过300bp。13)引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。14)引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。15)查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16) TM值在58-62度之间。
[0022]3.临床34例肝癌病人肝组织样本均为2005年I月至2012年8月间发病并确诊的，样本由南京鼓楼医院肝胆外科提供，此前所有病人均为进行任何治疗。女性为7例，阳性为6例；男性为27例，阳性为23例。32例并发肝硬化、27例并发慢性肝炎、其余未并发肝硬化或肝癌；另外经国际抗癌联盟数据判定在这34样本中15例病人处于肝癌I期，6例病人处于肝癌II期，13病人处于肝癌III期，6例病人处于肝癌IV期，3例病人处于V期，I例病人处于VI期。来自肝癌病人肝脏的两种肝组织为肝组织临床手术切除后立即获取的:癌组织部分、正常肝组织即远离癌组织且距离大于5cm的部分。
[0023]4.临床70例肝癌病人肝组织样本均为2005年I月至2012年8月间发病并确诊的，样本由南京鼓楼医院肝胆外科提供，所有病人此前均为进行任何治疗。男性为62例，女性为8例，平均年龄为54.09岁。60例进行药物疗法，10例进行原位肝移植。肿瘤平均大小为7.59 X 5.88 cm，42例并发肝硬化、9例并发慢性肝炎、其余19例未并发肝硬化或肝炎；另外经国际抗癌联盟数据判定在这70样本中15例病人处于肝癌I期，19例病人处于肝癌II期，24病人处于肝癌III期，12例病人处于肝癌IV期；61例肝癌组织为高分化阶段，6例处于中分化，3例处于低分化。来自肝癌病人肝脏的两种肝组织为肝组织临床手术或检查切除后立即获取的:癌组织部分、正常肝组织即远离癌组织且距离大于5cm的部分。
[0024]实施例2:检测来自34例肝癌病人的2种肝组织样本，分别对组织:
(1)样品RNA的提取:取30mg组织标本，悬浮于Iml的Trizol中，用组织匀浆器匀浆I左右分钟，室温静置5分钟；向匀浆中加入0.2ml氯仿，震荡15秒，静置2分钟；静置液在4°C，12000rpm,离心10分钟，取上清；向上清中加等体积的异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置20分钟沉淀RNA ;然后在4°C，12000rpm，离心10分钟，弃上清；向沉淀中加入Iml冰水预冷后的用DEPC的水溶液稀释至75%的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀，然后在4°C，12000rpm,离心5分钟，弃去上清，晾干；晾干后的沉淀溶于50 μ I的DEPC水溶液中即得RNA提取液；用DEPC的水溶液对RNA提取液稀释50-60倍后分光光度计测定浓度；
(2)样品cDNA的制备，将提取的RNA的反转录为cDNA:根据分光光度计测得的RNA的浓度乘以稀释倍数，计算出原RNA浓度。计算20 μ I体系中总RNA为Iyg时所需原RNA溶液的体积，将计算后各样品所需体积相应加入八连管各孔；向各孔加入反转录反应液 5 X PrimeScript RT Master Mix 4 μ I (包含 PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应 Buffer (含有 Mg+));向各孔加无酶水至20 μ I体积；将加好样品的八连管放入反转录仪,反转录条件设置为37°C,30min(反转录时间)，85°C，15s (反转录酶失活时间)进行反转录，制得GGPPSl的cDNA样品。
[0025](3) GGPPSl前体的扩增，即以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增:向96孔板待测孔中加入 10 μ I 体积的SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus ) ( 2X)、
0.5μ I的GGPPSl上游引物、0.5μ I的GGPPSl下游引物、0.4 μ I的ROX染料、7.6 μ I的双蒸水、I μ I的样品cDNA模板，然后混匀，再短甩离心将壁上液体甩下；样品的对照孔中加入:10 μ I 体积的SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus )( 2Χ)、0.5μ I 的内参基因18S rRNA上游引物、0.5μ I的内参基因18S rRNA下游引物、0.4 μ I的ROX染料、7.6μ1的双蒸水、I y I的样品cDNA I旲板，然后混勾；最后将加好样品和对照反应体系的96孔板放入Mx3005P荧光定量PCR仪中，设置荧光定量PCR扩增条件为:95°C Imin预变性；接40个循环即 95°C 15S、58°C 15s、72°C 30s。
[0026](4)荧光定量PCR结果分析
此处样品是肝癌病人肝组织的癌组织和离癌组织的正常组织，2个样品成组存在的。PCR之后分析2个组织中GGPPSl的相对表达量，18S rRNA是一种管家基因，在所有样品中18S rRNA的表达量相对相等的情况下排除了由于样品本身浓度不同造成的GGPPSl表达量的差异。通过2-Λ ACt法计算GGPPSl在癌组织、正常组织的表达量，并计算两者的比值(表示该分子在病人机体内的动态差异)。高于I的病人定位高水平表达，低于I的病人定为低水平表达，通过该比值诊断肝癌发展进程。
[0027](5)结果:在34组肝癌病人肝组织样本中癌组织中GGPPSl相对于正常组织表达量之比大于I (阳性)的为29例，高表达率为85.29%。GGPPSl mRNA的平均相关性在癌组织中相对于正常组 织为5.69 (如图1);34份样本中GGPPSl在肝癌组织中的mRNA表达水平与肿瘤体积的相关性分析结果(如图2)，阳性有23例，阳性率为67.65%，且随着癌组织体积的增大，表达水平与体积大小二者相关性呈上升趋势。
[0028](6)结论=GGPPSl在肝脏癌组织的异常高表达在临床诊断方面具有临床意义。
[0029]实施例3:肝癌组织中GGPPSl表达与临床病理特征相关性分析
为检测肝癌组织中GGPPSl的表达与临床病理特征的相关性，对临床70例肝癌病人的肝组织进行免疫组化实验，实验结果显示肝癌组织中GGPPSl的表达与病理因素有很大的相关性(如图3)，GGPPSl的表达与TNM分期(p=0.0059)，肿瘤大小(p=0.0041)，血管入侵(p=0.0009)，早期复发(p=0.0065)，总复发率(p=0.0444)等因素的相关性具有统计学意义。因此可以得出结论:肝癌病人肝组织的GGPPSl有更高的表达，并且与肝癌的临床分期、血管入侵、早期复发及复发有更大的关系。
【权利要求】
1.一种定量检测GGPPSl基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其中包括: (1)用于总RNA提取的试剂=Trizol提取液，氯仿，异丙醇，DEPC溶液，无水乙醇； (2)用于将mRNA反转录为cDNA模板的试剂: 1)无RNA酶的超纯水； 2)反转录反应液5XPrimeScript RT Master Mix,由 PrimeScript RTase、RNaseInhibitor>Random 6 mers、01igo dT Primer、dNTP Mixture 以及含 Mg2+的反应 Buffer 组成； (3)用于RealTime PCR反应的试剂:
1)SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus )； 2)ROX染料； 3)超纯水； 4)GGPPSl的引物:其上游序列如SEQ ID NO:1所示，即5’ -CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3’ ；其下游序列如 SEQ ID NO:2 所示，即5’ -CGTCGGAGTTTTGAGTTGTCT-3’ ； 5)内参基因18SrRNA的引物:其上游序列如SEQ ID NO:3所示，即 5’-GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3’ ；其下游序列如 SEQ ID NO:4 所示，即5’ -AGCTTATGACCCGCACTTAC-3’。
2.一种用如权利要求1所述的一种定量检测GGPPSl基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒来定量检测GGPPSl基因的检测方法，包括以下步骤: (1)样品总RNA的提取:取30mg组织或者细胞,悬浮于Iml的Trizol中，用组织匀衆器匀浆I左右分钟，室温静置5分钟；向匀浆中加入0.2ml氯仿，震荡15秒，静置2分钟；静置液在4°C，12000rpm，离心10分钟，取上清；向上清中加等体积的异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置20分钟沉淀RNA ;然后在4°C，12000rpm,离心10分钟，弃上清；向沉淀中加入1ml冰水预冷后的用DEPC的水溶液稀释至75%的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀，然后在4°C，12000rpm，离心5分钟，弃去上清，晾干；晾干后的沉淀溶于50 μ I的DEPC水溶液中即得RNA提取液；用DEPC的水溶液对RNA提取液稀释50-60倍后分光光度计测定浓度； (2)样品cDNA模板的制备，即将提取的RNA反转录为cDNA:根据分光光度计测得的RNA的浓度乘以稀释倍数，计算出原RNA浓度；计算20 μ I体系中总RNA Slyg时所需原RNA溶液的体积，将计算后各样品所需体积相应加入八连管各孔；向各孔加入反转录反应液 5 X PrimeScript RT Master Mix 4 μ I (包含 PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应 Buffer (含有 Mg+));向各孔加双蒸水至20 μ I体积；将加好样品的八连管放入反转录仪，反转录条件设置为37°C，30min(反转录时间)，85°C, 15s (反转录酶失活时间)进行反转录,制得cDNA样品； (3)GGPPSl前体的扩增，即以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增:向96孔板待测孔中加入 10 μ I 体积的 SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus ) ( 2X)、.0.5μ I的GGPPSl上游引物、0.5μ I的GGPPSl下游引物、0.4μ I的ROX染料、7.6μ I的双蒸水、I μ I的样品cDNA模板，然后混匀，再短甩离心将壁上液体甩下；样品的对照孔中加入:10μ I 体积的SYBR Premix Ex Taq II (TLi RNaseH Plus ) ( 2Χ)、0.5μ I 的内参基因.18S rRNA上游引物、0.5μ I的内参基因18S rRNA下游引物、0.4 μ I的ROX染料、7.6μ1的双蒸水、I y I的样品cDNA I旲板,然后混勾；最后将加好样品和对照反应体系的96孔板放入荧光定量PCR仪中，设置荧光定量PCR扩增条件为:95°C Imin预变性；接40个循环即950C 15S、58°C 15s、72°C 30s ； 所述 GGPPSl 上游引物序列如 SEQ ID NO:1 所示，即 5’-CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3’ ；所述 GGPPSl 下游引物序列如 SEQ ID NO: 2 所示，即 5’ -CGTCGGAGTTTTGAGTTGTCT-3’ ；所述内参基因18S rRNA上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，即5’-GTCTGTGATGCCCTTAGATG-3’ ；所述内参基因 18S rRNA 下游引物序列如 SEQ ID N0:4 所示，即 5’ -AGCTTATGACCCGCACTTAC-3’ ； (4)荧光定量PCR结果分析:此处样品是肝癌病人肝组织的癌组织和离癌组织的正常组织，2个样品成组存在的；PCR之后分析2个组织中GGPPSl的相对表达量，18S rRNA是一种管家基因，在所有样品中18S rRNA的表达量相对相等的情况下排除了由于样品本身浓度不同造成的GGPPSl表达量的差异；通过2-Λ ACt法计算GGPPSl在癌组织、正常组织的表达量，并计算两者的比值(表示该分子在病人机体内的动态差异);高于I的病人定位高水平表达，低于I的病人定为低水平表达，通过该比值诊断肝癌发展进程。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述的组织为临床肝癌病人肝组织。
4.根据权利要求3中所述的检测方法，其特征在于:所述的肝癌病人肝组织选自肝癌病人肝脏癌组织、癌旁组织及远离癌巢的正常组织。
5.权利要求1所述的检测试剂盒在非疾病诊断目的的定量检测GGPPSl基因中的应用。
6.权利要求1所述的检测试剂盒在定量检测肝癌病人肝脏组织中GGPPSl基因中的应 用。
7.权利要求1所述的检测试剂盒在制备肝癌早期诊断检测套装中的应用。
8.权利要求1所述的检测试剂盒在制备确定肝癌进展期检测套装中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103937886SQ201410131579
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】薛斌, 李朝军, 刘佳, 黄旋 申请人:南京大学