无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用。本发明提供的无乳链球菌BibA重组蛋白，是具有如序列2所示的蛋白序列，同时，还提供了该蛋白的编码基因及制备方法和应用。本发明的有益效果为：本发明以无乳链球菌为研究对象，从无乳链球菌DNA中克隆到BibA基因，完成了该基因序列的克隆及测序，并对其进行原核表达与免疫保护性的研究，获得特异性高、有免疫保护力的疫苗研制候选抗原，为无乳链球菌病的预防奠定基础。本发明的优点在于克隆到了无乳链球菌BibA基因，构建了BibA重组表达质粒，获得了BibA重组蛋白，经westernblot检测结果显示BibA重组蛋白具有较好的反应原性，动物（小鼠）实验证明该重组蛋白具有一定的保护性。
【专利说明】无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域中的无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]无乳链球菌是一种人畜共患病原菌，可感染人、奶牛、兔、罗非鱼、牛蛙等多种脊椎动物，人体医学上将无乳链球菌称为B群链球菌(GBS)。GBS能使带菌孕妇引发早产、晚期流产、胎儿发育不良、胎膜早破、子宫内膜炎、泌尿道感染等；无乳链球菌在奶牛上可引起奶牛的急性、亚急性和慢性乳房炎。
[0003]目前无乳链球菌可分为10个血清型，临床研究表明，该菌存在耐药性逐年增强的趋势，所以疫苗预防该病成为科研工作者的首要目标。但目前研制无乳链球菌常规疫苗存在许多技术难点:1)无乳链球菌菌体灭活疫苗免疫保护效果有差异；2)血清型众多，不同血清型菌株之间交叉保护性差；3)目前已知的保护性抗原较少。因此，筛选和获得无乳链球菌的候选免疫蛋白成为研制奶牛乳房炎高效疫苗的关键技术问题。目前尚无关于无乳链球菌BibA蛋白用于疫苗候选蛋白的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了可作为无乳链球菌基因工程疫苗候选蛋白的无乳链球菌BibA重组蛋白。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:无乳链球菌BibA重组蛋白，具有如序列2所不的蛋白序列。
[0006]本发明的第二个目的是提供了上述无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因。
[0007]进一步的，上述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因，是如下a)或b)的基因:
a)其核苷酸序列是序列表中的序列I;
b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述无乳链球菌BibA重组蛋白的DNA分子。
[0008]本发明的第三个目的，是提供了含有上述无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因的重组表达质粒，所述重组表达质粒为pCold? I DNA-BibA0
[0009]本发明的第四个目的，是提供了含有上述重组表达质粒的工程菌，所述工程菌为pCold? 1-BibA/BL21(DE3)。
[0010]上述一种无乳链球菌BibA重组蛋白的制备方法，包括有以下步骤:
O获得如上所述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因；
2)将步骤I)得到的无乳链球菌BibA重组蛋白克隆入表达载体pCold?I DNA中，得到pCold? 1-BibA重组质粒；
3)将步骤2)得到的pCold?1-BibA重组质粒导入宿主细胞疋coli BL21-DE3 ；
4)诱导表达得到无乳链球菌BibA重组蛋白。[0011]本发明的第五个目的，是提供了上述无乳链球菌BibA重组蛋白作为基因工程疫苗研制过程中的候选蛋白的应用。
[0012]具体操作步骤为:
(1)设计引物:
设计的BibA基因的表达引物对为:
上游引物 BibAl: 5’ -CGCGGA7TCTCGGATTCAATTCCTCAT-3’ (斜体下划线为汉.Η I 酶切位点)，
下游引物 BibA2: 5’ -CGGMTTCTGCATAATATCCAGGTGTAGGC-S'(斜体下划线为 &oR I酶切位点)；
(2)BibA基因的扩增与获得:
以提取的无乳链球菌基因组DNA为模板进行BibA基因的PCR扩增，反应体系为 50.0μ L:DNA 模板 6.0μ L，上下游引物各 1.0μ L , Premix Ex Taq 25.0 μ L，ddH2017.0μ L ;PCR 反应条件为:95°C 预变性 5 min、95°C 变性 I min、64°C 复性 I min、72°C 延伸 Imin,反应30个循环；72°C延伸10 min ；
(3)重组表达质粒的构建:将目的基因以“T-A”连接的原理克隆入载体T-VectorPMD20，转化到E.coli DH5 α感受态细胞中，并进行阳性重组质粒双酶切和测序鉴定，将测序正确的阳性重组质粒pMD20-T-BibA和表达载体pCold? I DNA用汉.Η I和&oR I分别双酶切，纯化酶切产物，T4 DNA连接酶4°C过夜连接，将连接物转化入疋co/i BL21 (DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取单个菌落，接种于含6mL LB/AMP液体培养基的IOmL离心管中，37°C振荡200rpm/min培养12 h，提取质粒，经I和&oR I双酶切和测序鉴定为阳性的为阳性重组表达质粒pCold? 1-BibA ；
(4)重组表达质粒pCoId?1-BibA在宿主细胞万.coli BL21(DE3)中的表达:
取pCold? 1-BibA/BL21(DE3)工程菌接种于LB液体培养基中，于37°C振荡培养至OD6qci 达到 0.5 时，分别加入 IPTG 至终浓度为 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8mmol/L及1.0m mol/L，在其它条件不变的前提下，分别在16°C、28°C、32°C、37°C和42°C等不同温度诱导表达；同样以 IPTG 终浓度为 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8m mol/L及1.0m mol/L进行诱导表达；收集诱导后I h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及过夜表达菌液，最后通过SDS-PAG E鉴定表达产物，来确定该重组蛋白的最佳表达条件与表达产物的可溶性；
(5)Western blot 方法检测:
根据上述(4)确定的最佳诱导条件，将不含阳性重组表达质粒的万BL21(DE3)菌体蛋白和含有阳性重组表达质粒pCold? 1-BibA的工程菌pCold? 1-BibA/BL21(DE3)进行SDS-PAGE电泳，然后转移至硝酸纤维膜上，用小鼠抗6个组氨酸单抗作为一抗、辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG为二抗，进行Western blot分析；
(6)重组蛋白的纯化与复性:
根据上述(4)确定的最佳表达条件，诱导表达IL含阳性表达质粒pCold? 1- BibA的工程菌菌液，4°C 5000 g离心10min，弃上清，沉淀用细胞裂解液重悬，超声破碎后，4°C，13000g离心10min，收集沉淀。采用包涵体纯化试剂盒纯化重组BibA蛋白，并经SDS-PAGE分析。将纯化的蛋白溶液加入透析袋中，透析袋在放入10倍体积的5mol/L尿素中4°C透析6_8h，换用2.5mol/L尿素4°C透析6-8h，再用PBS在4°C透析过夜，采用BCA法测定蛋白浓度；
(7)对BibA进行免疫效果的初步研究:
将60只健康昆明小鼠随机分为3组，分别为BibA重组蛋白免疫组(20只)、佐剂对照组(20只)和感染对照组(20只);BibA重组蛋白免疫组的处理方式为:BibA重组蛋白和弗氏完全佐剂按I: I乳化后，每只小鼠免疫注射0.2mL,然后用BibA重组蛋白和弗氏不完全佐剂按1:1乳化后，在首次免疫7d和14d后每只小鼠再各免疫注射0.2 mL ;佐剂对照组的处理方式为:用PBS代替抗原与弗氏佐剂乳化进行免疫注射，免疫方法和免疫剂量与BibA重组蛋白免疫组类似；感染对照组用PBS代替免疫原进行免疫注射；各组均进行3次免疫注射，每周I次，第3次免疫后I周攻击感染，每只小鼠经腹腔注射无乳链球菌进行感染，观察小鼠发病情况，并计算保护率。
[0013]本发明的有益效果为:
本发明以无乳链球菌为研究对象，从无乳链球菌DNA中克隆到BibA基因，完成了该基因的克隆及测序，并对其进行原核表达与免疫保护性的研究，获得特异性高、有免疫保护力的疫苗研制候选抗原，为无乳链球菌病的预防奠定基础。本发明的优点在于克隆到了无乳链球菌BibA基因，构建的重组表达质粒pCold? 1-BibA在宿主细胞疋coli BL21-DE3中诱导表达成功，western blot检测结果显示BibA重组蛋白具有较好的反应原性,动物(小鼠)实验证明该重组蛋白具有一定的保护性。
[0014]本发明的技术原理为:
设计能扩增出无乳链球菌BibA基因的引物，预期扩增片段为1185bp，而且上下游引物分别带有及I和I酶切位点；以提取的无乳链球菌基因组DNA为模板进行BibA基因的PCR扩增，将目的基因以“T-A”连接的原理克隆入载体T-Vector pMD20,形成重组质粒pMD20-T-BibA ;用 I 和&oR I 分别双酶切 pMD20_T/BibA 和表达载体 pCold? I DNA,将BibA基因亚克隆入pCold? I DNA载体，形成重组表达质粒pCo Id? 1-BibA0重组表达质粒pCold? 1-BibA转化入疋coli BL21(DE3)中获得重组工程菌，接种LB液体培养基，于37°C振荡培养至OD6tltl达到0.5时，分别加入IPTG至终浓度为0.4m mol/L, 37 °C振荡诱导培养4h，收集菌体进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。可见约在40ku处出现I条新的蛋白带，与理论预测值相符。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为无乳链球菌BibA基因的PCR扩增产物。
[0016]其中，泳道M:DNA分子质量标准(DL2000);泳道1:PCR扩增产物。
[0017]图2为克隆载体T-Vector pMD20示意图。
[0018]图3为克隆载体T-Vector pMD20克隆位点示意图。
[0019]图4为阳性克隆质粒pMD20-T_BibA的鉴定结果。
[0020]其中，泳道M:DNA分子质量标准(DL2000);泳道1:T_Vector pMD20空载体；泳道2-3:阳性重组质粒pMD20-BibA的双酶切鉴定结果。
[0021]图5为表达载体pCold? I DNA结构图谱。
[0022]图6为表达载体pCo Id? I DNA目的基因插入位点不意图。[0023]其中方框部分为目的基因BibA插入位点。
[0024]图7为阳性重组表达质粒pCold?- BibA的鉴定结果。
[0025]其中，泳道M:DNA分子质量标准(DL2000);泳道1-2:阳性重组质粒pCold? 1-BibA的双酶切鉴定j}dt3:pColdTM I DNA空载体。
[0026]图8为重组表达质粒诱导表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结果。
[0027]其中，泳道M:蛋白质分子质量标准；泳道1:不含阳性表达质粒pCold? 1- BibA的菌体蛋白；泳道2-6:含阳性表达质粒pCold? 1- BibA且IPTG终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8m mol/L 及 1.0m mol/L 诱导 4h 的菌体蛋白。
[0028]图9为重组蛋白的Western blot分析结果。
[0029]其中，泳道M: 蛋白质分子质量标准；泳道1:不含阳性表达质粒pCold? 1- BibA的菌体蛋白；泳道2:含阳性表达质粒pCold? 1- BibA的菌体蛋白。
【具体实施方式】
[0030]实施例1:
试剂来源:
T-Vector pMD20:TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，商品号3270。
[0031]pCold? I DNA =TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，商品号3361。
[0032]1、引物设计:
设计一对引物，为了方便下一步进行亚克隆，故上下游的5’端分别引入限制性酶切位
占.上游引物为:5’ -CGC^H^TCGGATTCAATTCCTCAT-3’(斜体下划线为BawR I酶切位点)；
下游引物为:5’ -CGGMTTCTGCATAATATCCAGGTGTAGGC-S'(斜体下划线为 &oR I 酶切位点)，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0033]2、BibA基因的扩增与获得:
用细菌基因组DNA提取试剂盒提取无乳链球菌分离株的基因组DNA，以此为模板进行BibA基因的PCR扩增；反应体系为50.0μ L:DNA模板6.0 μ L，上下游引物各1.0 μ L，PremixEx Taq 25.0μ L,ddH20 17.0 μ L ;PCR反应条件为:95°C预变性 5 min;95°C变性 I min,64°C复性I min、72°C延伸I min反应30个循环；72°C延伸10 min ;PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，结果出现与预期大小相符的片段，PCR扩增结果如图1所示。
[0034]3、BibA基因克隆载体的制备:
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，用TaKaRa胶回收试剂盒回收目的基因片段，按载体T-Vector pMD20说明书将目的基因的PCR产物与T-Vector pMD20载体连接，克隆载体T-Vector pMD20示意图如图2所示，克隆载体T-Vector pMD20克隆位点示意图如图3所示，连接产物转化入疋coli DH5 α感受态细胞，接种于含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37°C过夜培养，挑选白色菌落，接种到含有Amp的LB液体培养基中，37°C振荡过夜培养，提取质粒并进行及I和&oR I双酶切鉴定，筛选出阳性重组质粒pMD20-T-BibA，阳性克隆质粒pMD20-T-BibA的鉴定结果如图4所示，并由北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证。[0035]4、BibA基因表达载体的亚克隆:
将测序正确的pMD20-T-BibA和表达载体pCold? I DNA分别用汉.Η I和&oR I进行双酶切，再分别回收BibA基因片段及pCold? I DNA线性载体，然后用T4 DNA连接酶4°C过夜连接，表达载体pCo Id? I DNA结构图谱如图5所示，表达载体pCo Id? I DNA目的基因插入位点示意图如图6所示。将连接产物转化入万.co7iBL21 (DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取单个菌落，接种于含6mL LB/AMP液体培养基的IOmL离心管中，37°C振荡200rpm/min培养12 h，提取质粒，经汉I和I双酶切和测序鉴定为阳性的为阳性重组表达质粒pCold? 1-BibA，阳性重组表达质粒pCold? 1-BibA的鉴定结果如图7所
/Jn ο
[0036]5、重组表达质粒pCo Id? 1-BibA在厶co7iBL21 (DE3)中的表达:
取pCold? 1-BibA/BL21(DE3)重组工程菌接种LB液体培养基，于37°C振荡培养至OD6qci 达到 0.5 时，分别加入 IPTG 至终浓度为 0.2m mol/L,0.4m mol/L,0.6m mol/L,0.8mmol/L及1.0m mol/L，在其它条件不变的前提下，分别在16°C、28°C、32°C、37°C和42°C等不同温度诱导表达；同样以 IPTG终浓度为 0.2m mol/L、0.4m mol/L、0.6m mol/L、0.8m mol/L及1.0m mol/L进行诱导表达；收集诱导后I h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及过夜表达菌液,最后通过SDS-PAGE鉴定表达产物，来确定该重组蛋白的最佳表达条件与表达产物的可溶性，重组表达质粒诱导表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结果如图8所示，由试验结果显示诱导表达的最佳条件是=IPTG诱导终浓度为0.4m mol/L, 37°C振荡诱导培养4h，且表达产物以包涵体为主。
[0037]6> Western blot 方法检测:
根据上述确定的最佳诱导条件，将不含阳性表达质粒万.COli^ll (DE3)的菌体蛋白和含有阳性表达质粒pCo Id? 1- BibA的工程菌pCold? 1-BibA/BL21(DE3)进行SDS-PAGE电泳，然后转移至硝酸纤维膜上，用小鼠抗6个组氨酸单抗作为一抗、辣根过氧化物酶羊抗小鼠IgG为二抗,进行Western blot分析,重组蛋白的Western blot分析结果如图9所
/Jn ο
[0038]7、重组蛋白的纯化与复性:
根据上述确定的最佳表达条件，诱导表达IL pCold? 1- BibA/BL21(DE3)工程菌菌液，4°C 5000 g离心10min，弃上清，沉淀用细胞裂解液重悬，超声破碎后，4°C，13000g离心IOmin,收集沉淀。采用包涵体纯化试剂盒纯化重组BibA蛋白，并经SDS-PAGE分析，将纯化的蛋白溶液加入透析袋中，透析袋在放入10倍体积的5mol/L尿素中4°C透析6-8h，换用
2.5mol/L尿素4°C透析6-8h，再用PBS在4°C透析过夜，采用BCA法测定蛋白浓度。试验结果显示纯化复性的蛋白浓度为120μ g/mL。
[0039]8、对BibA进行免疫诊断的初步研究:
将60只健康昆明小鼠随机分为3组，分别为BibA重组蛋白免疫组(20只)、佐剂对照组(20只)和感染对照组(20只)。BibA重组蛋白免疫组的处理方式为:BibA重组蛋白(120μ g/mL)和弗氏完全佐剂按1:1乳化后，每只小鼠免疫注射0.2mL,然后用BibA重组蛋白(120 μ g/mL)和弗氏不完全佐剂按1:1乳化后，在首次免疫7d和14d后每只小鼠再各免疫注射0.2 mL。佐剂对照组的处理方式为:与用PBS代替抗原与弗氏佐剂乳化进行免疫注射，免疫方法和免疫剂量与BibA重组蛋白免疫组类似。感染对照组用PBS代替免疫原进行免疫注射。各组均进行3次免疫注射，每周I次，第3次免疫后I周攻击感染，每只小鼠经腹腔注射无乳链球菌进行感染，观察小鼠发病情况，计算保护率。结果发现佐剂对照组和感染对照组的小鼠在无乳链球菌感染24h内出现精神不振、蜷缩发抖等症状，48h内全部死亡。而免疫对照组在无乳链球菌感染后也一度出现精神不振、蜷缩发抖等症状，但比其它两组临床症状轻微，72h内共死亡8只，其余全部存活，而且精神状态慢慢恢复，保护率为60%。
[0040]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.无乳链球菌BibA重组蛋白，其特征在于，具有如序列2所示的蛋白序列。
2.无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因，其特征在于:是如下a)或b)的基因: a)其核苷酸序列是序列表中的序列I; b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述无乳链球菌BibA重组蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因的重组表达质粒，所述重组表达质粒为pCold? 1-BibA0
5.含有权利要求4所述重组表达质粒的工程菌，所述工程菌为pCold?1-BibA/BL21(DE3)。
6.根据权利要求1所述的无乳链球菌BibA重组蛋白作为基因工程疫苗研制过程中的候选蛋白的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103910786SQ201410121035
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】王旭荣, 李建喜, 杨志强, 王学智, 常瑞祥, 王磊, 张景艳, 秦哲, 孔晓军, 孟嘉仁 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所