优化nadph消耗性生物合成途径的微生物菌株的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及优化的微生物菌株，用于具有NADPH消耗性生物合成途径的分子的生物转化生产。本发明的菌株可以用于NADPH消耗性生物转化方法。所述菌株的特征在于一种或多种NADPH氧化活性受到限制。
【专利说明】优化NADPH消耗性生物合成途径的微生物菌株
[0001]本申请是申请号为200480031980.6的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/FR2004/002848的中国国家阶段申请。
【技术领域】
[0002]NADP (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)以它的还原形式NADPH参与细胞内涉及具有脱氢酶和还原酶活性的酶的氧化还原反应。
[0003]本发明涉及优化的微生物菌株，以便通过生物转化以NADPH消耗生物合成途径生产物质。根据本发明的菌株可用于NADPH消耗生物转化工艺。根据本发明定义的菌株可以是原核的或者真核的。优选的实施方案中，原核菌株是大肠杆菌菌株。进一步的实施方案中，真核菌株是酵母菌株，具体而言是酿酒酵母。
[0004]本发明还涉及通过使根据本发明优化的菌株的生长在适当的培养基中而进行生物转化来制备物质的方法，优化的菌株也包含对制备这种物质必需的遗传元件。【背景技术】
[0005]生物转化方法已经发展到可以大量而低成本地生产所需物质，同时可以有效的使用工业和农业上的副产品。
[0006]下面是用活体内生物转化生成所需物质的两种主要方法:
[0007]I)发酵，微生物通过发酵从简单碳源产生一种物质(例如，W00102547，描述了谷氨酸棒杆菌在葡萄糖存在下发酵生成赖氨酸)。
[0008]2)微生物通过生物转换将给定共底物转换成感兴趣物质(例如，W00012745，描述了 R-哌啶衍生物的生成，和W00068397，描述了塔格糖的生成)。共底物不被同化，区别于用于单独生成生物转换必需的生物物质和NADPH的碳源。
[0009]生物转化方法的改进涉及各种因素，如温度、氧化、培养基成分、恢复方法等等。也可以修饰微生物以增加感兴趣物质的生成和/或排出。
[0010]发酵方法中，例如可以通过改变基因调控或通过修饰基因以改变参与的酶的特征，或者通过优化辅因子的再生来改进生物合成途径。
[0011 ] 生物转换方法中重点放在减少副产物的形成和优化参与生物转换步骤的辅因子的再生上。
[0012]在参与生物转化的辅因子中，NADPH对下列物质的生成尤其重要，氨基酸(例如精氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸)、维生素(例如泛酸盐、维生素K1、生育酚)、芳香物(例如W09401564)、多元醇(例如木糖醇)、多胺(例如亚精胺)、羟基酯(例如4-氯-3-羟基丁酸乙酯)和其它高附加值的物质。
【发明内容】
[0013]本发明涉及利用具有NADPH消耗性生物合成途径生产物质的优化微生物菌株。
[0014]不去尝试优化每个生物转化中微生物的NADPH/NADP+比率，
【发明者】选择产生改进的微生物，以获得不同的NADPH/NADP+比率，改进的微生物随后用于进行NADPH消耗性生物转化。
[0015]根据本发明，微生物菌株是表示同物种的一系列微生物，包括该物种的至少一种微生物。因而所描述的菌株的特征适用于该种类的所有微生物。同样地，所描述的任何一个微生物菌株的特征也适用于整个微生物系列。
[0016]根据本发明优化的微生物包括细菌、酵母和丝状霉菌，具体而言细菌和酵母属于下列物种:曲霉属、芽孢杆菌属、短杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、埃希氏菌属、葡萄糖杆菌属、青霉菌属、毕赤酵母属、假单胞菌属、红球菌属、酵母菌属、链霉菌属、黄单胞菌属、假丝酵母属物种。
[0017]下面描述了大肠杆菌和酿酒酵母的NADPH/NADP+比率优化原则。同一原则同样适用于所有在有氧条件下生长的微生物。
[0018]NADPH/NADP+比率优化的原则在于限制参与NADPH氧化的酶活性，和/或促进还原NADP+的酶活性。参与NADPH氧化的酶活性被还原反应限制，具体而言，通过将那些活性，尤其是如醌氧化还原酶和/或可溶性转氢酶的活性灭活而限制。通过调整经过磷酸戊糖循环的碳流量和/或改进 至少一种酶的辅因子专一性增强利于NADP+还原的酶活性，从而使其对NADP的利用优先于其惯用辅因子NAD。
[0019]根据本发明优化的菌株通过分子生物学方法获得。那些本领域的技术人员知道用于改变微生物遗传特性的方案。这些方法都有据可查，并且是技术人员容易操作的(Sambrook et al.,1989Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold SpringHarbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)。
[0020]用于限制酶活性的方法包括用适当的方法改变表达它的基因，例如通过引起相关基因的编码部分的突变，或者改变启动子区域，具体而言就是用一个减少基因表达的序列来替换它。
[0021]用于灭活酶的方法包括用适当的方式灭活相关基因表达的产物，或者抑制相关基因的表达，或者删除至少相关基因的一部分以阻止其表达(例如，删除其表达所必需的部分或全部启动子区域)，或者导致表达产物失去它的功能(例如，删除相关基因的编码部分)。
[0022]优选地，删除基因包括去除那个基因，而且如果需要，选择一个便于鉴别的标记基因代替它，分离和提纯根据本发明优化的菌株。
[0023]大肠杆菌基因的灭活优选通过同源重组实现(Datsenko K.A., WannerB.L.(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:6640-6645)。方案的原理简要叙述如下:将线性片段导入细胞，所述线性片段在活体内获得，包括两个旁侧基因区域和定位于这两个区域之间的至少一个选择基因(通常是抗生素抗性基因)。这个片段因此含有灭活基因。随后通过在选择性培养基上铺板来选择发生了重组事件并整合有导入片段的细胞。然后选择经历了双重重组事件的细胞，该细胞中灭活基因替代了野生基因。为了加速双重重组的检出，这个方案可以用阳性和阴性选择系统进行改进。
[0024]酿酒酵母基因的灭活也是优选通过同源重组进行(Baudin et al., Nucl.AcidsRes.21,3329-3330,1993 ；ffach et al., YeastlO,1793-1808,1994 ；Brachmann et al.,Yeast.14:115-32,1998)。
[0025]促进酶活性的方法包括通过适当的方式稳定相关基因表达的产物，例如通过减小它对变构效应物的灵敏性，或者通过增强基因的表达以增加产生的酶量。
[0026]基因的超表达可以通过在原位用强启动子或诱导型启动子替换基因的启动子来实现。作为替代方案，将复制的质粒(单拷贝或多拷贝)导入细胞，其中超表达的基因由适当的启动子控制。在大肠杆菌修饰的情况下，例如，可以用启动子Plac-o、Ptrc-o和ptac_o三种删除了乳糖操纵子(IacO)而构成的强细菌启动子。在酿酒酵母修饰的情况下，例如，可以用启动子 PPgk、Padhl、Pgal1、Pgal 10。
[0027]本方法可用于改变酶的辅因子专一性，以使它对NADP的利用优先于NAD，包括改变使那种酶表达的基因序列(Bocanegra, J.A.Scrutton, N.S.；Perham, R.N.(1993)Creation of an NADP—dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex byprotein engineering.Biochemistry32:2737-2740)。
[0028]根据发明优化的菌株，即有增强的NADP+还原能力的菌株，通过一种或多种NADPH氧化酶活性的衰减或失活来表现其特征，NADPH氧化酶活性具体而言是醌氧化还原酶和/或可溶性转氢酶的活性。
[0029]下面列出了一些NADPH氧化酶活性和基因的非限制性的实例:
[0030]
【权利要求】
1.生长于有氧条件下的大肠杆菌菌株，其特征在于，通过删除以下基因的组使得其一种或多种NADPH氧化活性受到限制并且还进行了促进一种或多种其NADP+-还原酶活性的修饰: #udhA、qor 和 pgi ;或者
?udhA、qor、pfkA 和 pfkB。
【文档编号】C12R1/19GK103952335SQ201410119033
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2004年11月5日 优先权日:2003年11月6日
【发明者】格旺埃勒·贝斯泰尔－科尔, 塞德里克·布瓦萨尔, 米歇尔·沙托, 邦雅曼·冈萨雷斯, 菲利普·苏卡耶, 雷纳·菲格, 奥利维耶·津克 申请人:代谢探索者公司