一种解脲脲原体14种血清型荧光定量pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种解脲脲原体14种血清型荧光定量PCR检测方法，该方法14种血清型均采用20微升反应体系，其中引物和探针的终浓度均为0.2微摩尔每升（uM），镁离子终浓度染料法为2毫摩尔每升（mM），探针法为3mM，染料法加10微升qPCRMasterMix，探针法加10微升定量PCRSuperMix-UDG。本发明首次实现了用分子生物学方法对解脲脲原体的14种血清型进行分型，解决了传统分型方法灵敏度低、重复性差的缺点，为今后在血清型水平进一步研究解脲脲原体的致病性打下了方法学基础，可广泛应用于临床。
【专利说明】—种解脲脲原体14种血清型荧光定量PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因领域，尤其涉及一种解脲脲原体14种血清型荧光定量PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)是人类泌尿生殖道中一种常见的共生型微生物，但同时也和各种疾病有关，如非淋球菌性尿道炎(宫颈炎)、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、新生儿脑膜炎、肺炎等。
[0003]Uu目前已知的有14种血清型，最近14种血清型又根据各种标准被划分为两个生物群，即微小脲原体(Ureaplasma parvum, UPA)包括血清型I, 3, 6, 14和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, UUR)包括其余 10 种血清型。
[0004]多年来人们一直在猜测Uu的致病性是否和某一特定的生物群或血清型有关，尽管很多研究报道UUR比UPA更具有致病性，但也有学者并不同意此观点。所以Uu不同的致病性很可能和不同血清型有关而不是生物群，推测某一类疾病和特定血清型之间的相关性就需要一种准确、可行的分型方法。
[0005]传统的基于抗体为基础的分型方法包括生长/代谢抑制试验、酶联免疫吸附试验、免疫印迹法等，抗血清不仅制备繁琐、难以商品化，并且敏感性和稳定性不够，特别是当同一标本中含有两种或以上血清型的时候，分辨能力和重复性都较差。
[0006]近年来以基因为基础的Uu分型方法中，引物和探针的设计大多是针对多条带抗原(multiple-band antigen MBA)基因5’末端序列的差异来来设计的，结合直接测序或限制性内切酶分析，这些试验能把UPA的4个血清型型分开，但只能把UUR的10个血清型分成若干个组。最近 Xiao 等(Xiao L, Glass J I, Paralanov V, et al.Detection andcharacterization of human Ureaplasma species and serovars by real-time PCR[J].JClin Microbiol, 2010，48 (8): 2715-2723.)用突光定量 PCR (Fluorescence QuantitativePCR, FQ-PCR)建立了一套Uu分群和分型的方法，成功把14种血清型分开且没有交叉反应。与传统PCR相比荧光定量PCR法具有能定量、更灵敏、快速并不容易被污染的特点，在基因表达水平分析、病原体的定性、定量检测等方面得到了广泛的应用。但由于Xiao等建立的方法检测14种血清型的PCR扩增条件各不相同，使得在实际操作中非常耗时与繁琐，因此很难在临床中广泛开展。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种解脲脲原体14种血清型荧光定量PCR检测方法，本发明在结合文献的基础上通过对Uul4种血清型基因组进行分析，重新设计部分引物和探针并优化实验条件，建立一套准确而又切实可行的Uul4种血清型荧光定量PCR检 [0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:[0009]蛋白酶K裂解液:取5.0ml KC1( lmol/L)、0.25ml MgCl2( lmol/L)、1.5ml Tris-HCl(lmol/L, PH8.0),Tween-20 (20%)混合即为裂解液，裂解液和蛋白酶K (200 μ g/ml)以50:2的体积混合后，即为DNA模板提取所用的蛋白酶K裂解液。
[0010]荧光定量PCR在罗氏Light Cycler480仪器上完成。其中血清型1、3、6、14、2、7、
8、9、13共9种用的是SYBR染料法，其余5种用Taqman探针法。
[0011]SYBR染料法和探针法所用的试剂盒分别为Promega GoTaq qPCR Master Mix和Invitrogen 定量 PCR SuperMix-UDG0
[0012]14种血清型均采用20微升反应体系，其中引物和探针的终浓度均为0.2微摩尔每升(uM)，镁离子终浓度染料法为2毫摩尔每升(mM)，探针法为3mM，染料法加10微升Promega GoTaq qPCR Master Mix,探针法加 10 微升 Invitrogen 定量 PCR SuperMix-UDG0
[0013]染料法PCR的条件都包括95°C 5分钟的预温，接着40个循环扩增，熔解曲线的条件为:95°C 5 秒(速率为 4.4°C/s)，65°C I 分钟(速率为 2.2°C/s)，97°C (速率为(X11°C/s)连续采集信号模式。最 后仪器冷却程序40°C 30秒。探针法的条件包括预温50°C和95°C各2分钟，接着扩增程序。最后仪器冷却程序40°C 30秒。其中血清型5、8为了提高特异性用了降落(Touch Down) PCR0详细PCR条件见下表。
[0014]
【权利要求】
1.一种解脲脲原体14种血清型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法包括: (1)14种血清型均釆用20微升反应体系，其中引物和探针的终浓度均为0.2微摩尔每升(uM)，镁离子终浓度染料法为2毫摩尔每升(mM)，探针法为3mM，染料法加10微升qPCRMaster Mix,探针法加10微升定量PCR SuperMix-UDG ;引物和标记探针如下: 血清型引物、探针序列(5’ 一3’)
【文档编号】C12Q1/04GK103966315SQ201410113941
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】谢鑫友, 张钧, 宋铁军, 黄珺 申请人:浙江大学