一种具有免疫负调控作用的基因工程蛋白及其制备方法与应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明属于分子免疫学【技术领域】，具体为一种具有免疫负调控作用的基因工程蛋白CPL及其制备方法与应用。本发明首先提供一种CPL基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明还提供上述基因所编码的融合蛋白CPL，其氨基酸序列SEQIDNO：2所示。本发明还提供前述融合蛋白CPL的制备方法和免疫调控效果（免疫抑制）以及用途。本发明提供的基因工程蛋白可以有效阻止T细胞活化，具有显著免疫抑制作用，可用于制备免疫抑制剂。本发明为研发防治自身免疫疾病，抗移植排斥及超敏反应的药物开辟广阔前景。
【专利说明】一种具有免疫负调控作用的基因工程蛋白及其制备方法与应用
【技术领域】
[000 1]本发明属于分子免疫学【技术领域】，具体涉及一种具有免疫负调控作用的基因工程蛋白CPL及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]免疫反应过度激活引起的疾病在临床上非常普遍，包括类风湿性关节炎，红斑狼疮等自身免疫病和器官移植急性排斥等。对机体非正常的免疫应答的调控研究一直以来都是免疫学主要任务之一。免疫应答过激的主要机制在于体内病理性淋巴细胞的激活，使T细胞攻击自体组织或移植组织，同时产生抗体，造成移植物排斥或炎症反应。早期临床上主要应用糖皮质激素和钙调磷酸酶抑制剂等副作用较大的免疫抑制药物进行治疗
传统的免疫抑制药物如糖皮质激素，烷化剂和抗代谢药物，如临床常用的FK506和Ciclosporin A等虽然有效,但特异性仍不够理想。开发更安全,特异性更好的免疫抑制剂一直是免疫学的重要研究方向。新的药物要求能在抑制对异体器官排斥的同时，并不降低病原菌和肿瘤的正常免疫应答。由于在一个完整免疫应答的过程中，T细胞的激活需经历:T细胞表面的T细胞受体与抗原递呈细胞表面的MHC多肽复合物结合的第一信号；抗原递呈细胞表面的B7与T细胞表面的CD28分子结合的共刺激信号；除此之外，T细胞活化增殖分化还需要IL - 2等细胞因子的帮助，称为第三信号。因此新一代的免疫抑制剂可特异性作用于淋巴细胞活化的这几个信号传导通路中，阻断T细胞活化信号，诱导免疫无反应性或无能。
[0003]本发明所涉及蛋白，具有两个功能结构域，能在有效抑制共刺激信号的同时，传导免疫负调控信号，特异性的高效抑制T细胞活化。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种具有高效免疫负调控作用的基因工程蛋白CPL及其制备方法与应用。
[0005]本发明提供的具有高效免疫负调控作用的新型基因工程蛋白，其成分具有两个功能结构域，分别为结构域P和结构域C，并在两个功能结构域之间引入了柔性铰链区，以使两个结构域能分别正确折叠，记为CPL。该基因工程蛋白也称为免疫负调控分子，
本发明首先提供一种基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，命名为CPL基因。
[0006]本发明还提供一种重组载体，它包含前述CPL基因。其中，所述的重组载体是重组pet28a 质粒。
[0007]本发明还提供一种基因工程重组的可表达CPL蛋白质的原核和真核细胞(菌株及细胞株)，即重组菌，它包含所述的重组基因及其重组载体。所述重组菌可以为大肠埃希氏杆菌。[0008]本发明还提供前述基因编码的蛋白质，命名为CPL分子(即融合蛋白或基因工程蛋白)。其中，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0009]本发明还提供前述融合蛋白的制备方法。
[0010]1.取所述的重组菌，以1: l(Tl: 100的接种量转接于LB培养基中；200rpm/min培养至0D600为0.2~1.0之间；
I1.加入终浓度为0.1~1.0mmol的IPTG为诱导剂，温度为3(T40°C，诱导培养2~24h ；
II1.收集菌体，破壁，分离纯化，得到目的蛋白。
[0011]上述方法中，优选参数为:所述的重组菌以1:25-1:50的接种量转接于LB培养基中，培养至0D600为0.4~0.6之间；诱导剂终浓度为:0.2^0.5mmol，诱导温度3(T40°C，诱导时间2~6h。
[0012]研究表明，上述融合蛋白CPL分子，具有高效免疫负调控作用，可以用于制备一种高效免疫抑制剂。具体地说，该融合蛋白可抑制CD28与B7分子结合，进而抑制T细胞活化。另外，该融合蛋 白通过与CD279结合产生免疫负调控信号，进而起到免疫抑制作用。
[0013]本发明还提供一种新型免疫抑制剂，其有效成分为前述蛋白质。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1结构域P和结构域C以及新型基因工程蛋白全长编码基因的PCR。
[0015]图2新型基因工程蛋白原核表达载体阳性转化子的PCR鉴定。
[0016]图3 SDS-PAGE分析新型基因工程蛋白N1-NTA亲和柱纯化产物。
[0017]图4 Western Blot鉴定新型基因工程融合蛋白。
[0018]图5混合淋巴反应结果。
[0019]图6 ConA转化实验结果。
【具体实施方式】
[0020]合成如下引物用于克隆:
1)结构域P第一外显子克隆引物
DomainP-Ul: 5’ -TCTCTCGAGAAAAGATTATTCACAGTGACAGT-3> (SEQ ID NO: 3)
XhoI
DomainP -Dl: 5’ -TAAGGTCTCACTTTGACTTTCAGAGT-3，(SEQ ID NO: 4)
BcoSlI
2)结构域P第二外显子+第三外显子克隆引物
DomainP-U2: 5’ -TATGGTCTCAAAAGCTTCCTACAGGAAAATAAA-3> (SEQ ID NO: 5)
Ecol31I
DomainP-D2: 5’ -ATAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGAGTTGGATGGGT
NotI
CCTGGGTTCCATCTGACTTTGAAGGTCAATGC-3’ (SEQ ID NO: 6)
3)全长蛋白克隆引物 Comp-Ul:5’ -AGCCATATGTTATTCACAGTGACAG-3，(SEQ ID NO: 7)
NdeIComp-Dl:5’ -ATAGGATCCACCGCCAGTTGGATGGGTCCTGGGTT~3y (SEQ ID NO: 8)
BamHI
Comp~U2:5，-ATAGGATCCATGCATGTTGCTCAACC-3y (SEQ ID NO: 9)
BamHI
Comp~D2:5’ -ATAGCGGCCGCTTAATCAGAATCTGGAC-3’ (SEQ ID NO: 10)
NotI
1.目的片段的获得
1.1结构域P外显子的PCR
第一外显子PCR，按如下体系加样
【权利要求】
1.一种基因，称为CPL基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.一种基因工程重组表达载体，其特征在于:该重组表达载体包含权利要求1所述的基因。
3.一种基因工程表达蛋白质，称为CPL蛋白或CPL分子，其特征在于:由权利要求1所述基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
4.一种基因工程重组的可表达CPL蛋白质的原核或真核细胞，即重组菌，其特征在于包含所述的重组基因及其相关的载体。
5.一种如权利要求3所述蛋白质的制备方法，其特征在于具体步骤如下: I.取权利要求4所述的重组菌，以1:l0-l: 100的接种量转接于LB培养基中，200rpm/min培养至0D600为0.2~1.0之间； II.加入终浓度为0.1-1.0mmol的IPTG为诱导剂，温度为30-40°C，诱导培养2~24h ； III.收集菌体，破壁，根据分子量、PI和亲和特性分离纯化并得到目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述重组菌以1:25-1:50的接种量转接于LB培养基中，培养至0D600为0.4~0.6之间；加入的诱导剂的终浓度为:0.2^0.5mmol,诱导温度30-40°C，诱导时间2~6h。
7.如权利要求4所述的蛋白质在制备免疫抑制剂中的应用。
8.一种免疫抑制剂，其特征在于:有效成分为权利要求3所述的蛋白质。
【文档编号】C12N15/62GK103923934SQ201410107482
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月22日 优先权日:2014年3月22日
【发明者】朱乃硕, 王丽莎 申请人:复旦大学