一株高耐受性拜氏梭菌及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一株高耐受性拜氏梭菌Clostridium?beijerinckii?M17?CCTCC?NO：M?2013425及其在生产丁醇中的应用。该菌株通过常温等离子体诱变和筛选获得，对未脱毒木质纤维酸解糖液中的毒素物质具有高度耐受性，在酚浓度高达2.0g/L的发酵液中，能非常好地发酵生产丁醇，其总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.9g/L和7.9g/L，即使酚浓度高达2.4g/L，本发明菌株仍具有可观的产丁醇能力，说明本发明菌株拜氏梭菌M17不仅对甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且对其中的毒素抑制物，尤其是酚类化合物具有高度耐受性，是一种适合利用甘蔗渣发酵产丁醇的优良菌种。
【专利说明】一株高耐受性拜氏梭菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株能利用未脱毒甘蔗渣酸解糖液发酵产丁醇的高耐受性拜氏梭菌及其应用，属于生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]丁醇是无色液体，有酒味，与乙醇/乙醚及其他多种有机溶剂混溶；已广泛应用于增塑剂等各种精细化学品的制造。丁醇具有能量密度大、可与汽油任意比混合、可直接用于内燃机、运输方便等优点；作为可再生的新型液体燃料受到越来越多的重视。
[0003]随着化石能源的日益枯竭和价格飞涨，利用可再生的木质纤维质原料(如秸杆、甘鹿洛等)发酵生产丁醇，成为研究的重点和热点之一。Thaddeus Ezeji等(BioresourceTechnology.2008, 99: 5915-5922)利用拜氏梭菌突变株 BA101，以 XAD-4 resin 脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底物发酵，总溶剂产量为9.30 g/L ;但突变株BAlOl不能利用未脱毒的酸解糖液发酵产丁醇。庞浩等(生物技术，2011，21(5)，79-82)报道拜氏梭菌13-2株对甘蔗渣水解液具有较高的发酵效率，在0.5%硫酸用量条件下，它的丁醇发酵量最高可达到4.5g /L0中国专利ZL 201110020102.6报道:通过粒子束诱变育种得到的拜氏梭菌iflostridium beijerinckii) IB4对酹类化合物具有较高的抗逆性,其能以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 10.3g/L和 7.1 g/L ;同时，以未脱毒的甘蔗渣酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 10.6 g/L和 7.3 g/L。然而,郭亭等(J Ind Microbiol Biotechnol., 2012,39(3)，401-407)研究发现，当玉米芯和甘蔗渣酸解糖液中的酚类化合物的浓度提升到1.5g/L以上时,拜氏梭菌{Clostridium bei jerinckii) IB4基本不生长。
[0004]甘蔗渣是一种重要的可再生木质纤维原料，利用蔗渣生产丁醇，不仅节约资源，还促进制糖产业节能减排，产业升级。但是，甘蔗渣等原料经稀酸处理后，会产生有机酸、糠醛、酚类等抑制物，这些抑制物的去除成本较高、并对微生物生长有一定的抑制作用；Thaddeus Ezeji 等(Biotechnology & Bioengineering.2007, 97 (6): 1460-1469)研究发现有机酸、糠醛等抑制物不影响丁醇的发酵，而酚类抑制物对丁醇发酵有明显的抑制效果。基于此，甘蔗渣酸解糖液中的毒素抑制物(尤其是酚类化合物)严重抑制产丁醇梭菌的发酵性能；而菌种改良是提高菌株对抑制物的耐受性、发酵经济性的关键手段之一。
【发明内容】
[0005]为了解决上述存在的问题，本发明通过诱导突变和筛选的方法获取一株不仅对甘蔗渣酸解糖液具有高效利用率，且对其中的毒素抑制物(尤其是酚类化合物)具有高度耐受性的突变菌株。
[0006]本发明的目的在于提供一株新菌种:拜氏梭菌iClos tridium beijerincki?)M17。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述菌株在丁醇生产中的应用。[0008]本发明所采取的技术方案是:
申请人:将菌株保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2013年9月14日收到 申请人:提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC NO:M 2013425，提议的分类命名为知clostridium beijerinckiim17，已于2013年9月23日鉴定保藏的菌株是存活的。
[0009]一种生产丁醇的方法，其特征在于:包括以下步骤:
1)平板培养:将拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) Ml7接种至平板培养基上,进行厌氧培养，培养温度33~37 °C，培养时间12~24 h，使菌种活化；
2)种子培养:将平板培养活化的拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) M17接种到种子培养基中，100 mL的厌氧瓶装液量40~60mL，充氮气3~5min，培养温度33~37 °C,培养时间12~24h ；
3)发酵产丁醇:将种子培养后的拜氏梭菌ijOlostridiumbeijerinckii) M17菌液接种到发酵培养基中，接种量按5~15%的体积百分比，充氮气3~5min，发酵温度33~37°C，发酵培养时间为70~90 h，即可发酵产出丁醇。
[0010]进一步的，步聚I)所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分:碳源0.3%~1%、氮源0.5%~1%、无机盐0.5%~0.8%、琼脂1.5%~2%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中的至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中的至少一种。
[0011]进一步的，步聚2)所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分:碳源0.5%~1%、氮源0.5%~1%、无机盐0.5%~0.8%、其余为水；其中，碳源选自淀粉、葡萄糖中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种。
[0012]进一步的，步聚3)所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分:碳源3%~6%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.1%~0.2%、生长因子0.05%~0.1%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、酵母粉中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种；生长因子选自对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中至少一种。
[0013]本发明的有益效果是:
本发明菌株拜氏梭菌beijerinckii M17对未脱毒木质纤维酸解糖液中的毒素物质具有高度耐受性，在酚浓度高达2.0 g/L的发酵液中，能非常好地发酵生产丁醇，其总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 10.9 g/L和7.9 g/L，即使酚浓度高达2.4 g/L，本发明菌株仍具有可观的产丁醇能力，说明本发明菌株拜氏梭菌M17对毒素物质耐受性强、溶剂产量和丁醇产量高、重复性好，是一种适合利用甘蔗渣发酵产丁醇的优良菌种。
[0014]本发明菌株拜氏梭菌CViosirii/iw? beijerinckii M17对甘鹿洛酸解糖液具有高效的利用率，且对其中的毒素抑制物(尤其是酚类化合物)具有高度的耐受性，这不仅有利于丁醇的生产，还有利于资源的节约，促进制糖产业的节能减排，促进产业升级。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为拜氏梭菌的等离子体诱变存活率曲线。【具体实施方式】
[0016]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0017]实施例1
一、等离子体诱变原始拜氏梭菌株
拜氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下:
将拜氏梭菌NCMB 8052原始菌株活化培养，培养温度33~37°C，50ml肖特厌氧瓶装液量为15~20ml，充氮气3min，培养时间12~18 h，得到生长旺盛的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD6tltl=0.1~1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10~240s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知，180s是最佳的诱变辐照时间。
[0018]二、筛选诱变后的目的拜氏梭菌株 (I)培养基配方(％为质量百分比):
1.甘蔗渣酸解糖 液平板培养基:酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%,琼脂1.5%，刃天青0.02%,甘蔗渣酸解糖液25% (v/v)，其余为水，pH 6。
[0019]2.种子培养基:酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠
0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%,其余为水，pH 6。
[0020]3.摇瓶发酵初筛培养基:葡萄糖3%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%,磷酸氢二钾0.05%,氯化钠0.001%,七水合硫酸镁0.02%,七水合硫酸亚铁0.001%, 一水合硫酸锰
0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH 6.6ο
[0021]5.摇瓶发酵复筛培养基:甘蔗渣酸解糖液3%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%,氯化钠0.001%,七水合硫酸镁0.02%,七水合硫酸亚铁0.001%, 一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH 6.6ο
[0022](2)筛选步骤:
1、甘蔗渣酸解糖液平板培养基培养
将诱变后的载片置于装有I~2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于甘蔗渣酸解糖液平板培养基上，33~37°C厌氧培养12~36h，挑选出透明圈和菌落较大的菌落50株，分别编号Ml~M50，将其分别用种子培养基进行扩大培养，并保种。
[0023]2、摇瓶发酵初筛
将初筛的扩大培养后的50株菌落和原始菌株接种到摇瓶发酵初筛培养基中，接种量10% (v/v), 100 mL肖特厌氧瓶装液量50 mL，发酵温度35°C，发酵时间72 h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量，结果显示菌株M17、M39和M48可发酵产出较高的丁醇产量，如表I所示。[0024]表1各菌株的总溶剂产量和丁醇产量
【权利要求】
1.一株拜氏梭菌，其分类命名为CVo1Siribeijerinckii M17,已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号:CCTCC NO:M 2013425。
2.权利要求1所述的Clostridiumbeijerinckii M17在生产丁醇中的应用。
3.—种生产丁醇的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)平板培养:将拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) Ml7接种至平板培养基上,进行厌氧培养，培养温度33~37 °C，培养时间12~24 h，使菌种活化； 2)种子培养:将平板培养活化的拜氏梭菌{Clostridiumbeijerinckii) M17接种到种子培养基中，100 mL的厌氧瓶装液量40~60mL，充氮气3~5min，培养温度33~37 °C,培养时间12~24h ； 3)发酵产丁醇:将种子培养后的拜氏梭菌ijOlostridiumbeijerinckii) M17菌液接种到发酵培养基中，接种量按5~15%的体积百分比，充氮气3~5min，发酵温度33~37°C，发酵培养时间为70~90 h，即可发酵产出丁醇。
4.根据权利要求3所述的一种生产丁醇的方法，其特征在于:步聚I)所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分:碳源0.3%~1%、氮源0.5%~1%、无机盐0.5%~0.8%、琼脂1.5%~2%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、淀粉、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中的至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中的至少一种。
5.根据权利要求3 所述的一种生产丁醇的方法，其特征在于:步聚2)所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分:碳源0.5%~1%、氮源0.5%~1%、无机盐0.5%~0.8%、其余为水；其中，碳源选自淀粉、葡萄糖中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母粉、玉米浆中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种。
6.根据权利要求3所述的一种生产丁醇的方法，其特征在于:步聚3)所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分:碳源3%~6%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.1%~0.2%、生长因子0.05%~0.1%、其余为水；其中，碳源选自葡萄糖、木糖、甘蔗渣酸解糖液、玉米芯酸解糖液中至少一种；氮源选自乙酸铵、氯化铵、酵母粉中至少一种；无机盐选自钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中至少一种；生长因子选自对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中至少一种。
【文档编号】C12P7/16GK103898010SQ201410086648
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】郭亭, 张九花, 梁达奉, 蚁细苗, 柳颖, 常国炜, 曾练强, 李雨虹 申请人:广州甘蔗糖业研究所