一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了一种新型感受态细胞(简称C-competent?cell)的制备方法及其转化步骤，制备过程包括大肠杆菌培养，离心收集细菌，缓冲洗液1重悬细菌后收集细菌，缓冲洗液2重悬细菌后收集细菌，分装，备用。制备方法中缓冲洗液1为包含以下成分的水溶液：氯化镁(10mM-1M)，氯化钾(10mM-1M)，氯化钙(10mM-1M)，葡萄糖(0.1-5％)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(10mM-100mM)，pH值为6.5，缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液：氯化钙(10mM-1M)，氯化钠(10mM-1M)，氯化铁(10mM-1M)，DMSO(5-30％)pH值为7.0。转化过程包括在冰上解冻C-competent?cell，至解冻1／3时加入待转入质粒DNA，混匀，转化克隆涂板培养。
【专利说明】一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种新型感受态细胞的制备方法及其转化步骤。
【背景技术】
[0002]感受态细胞是指经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞，可以将外源DNA分子引入其中，使之获得新的遗传性状。感受态细胞转化效率直接影响前后试验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。目前，感受态的感受效率最关键的是需要冷藏，刚制备的感受态细胞其感受效果最好，但是随着时间的延长感受效果会逐渐下降。而且转化过程十分繁琐，需要热激反应、长时间培养以及一系列的增长步骤，大大降低了实验效率。因此研究一种增加冻融耐性、转化效率高、操作简单实用及能长期保存的感受态细胞及相对应的高效转化方法，对分子生物学的研究有很大帮助。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种新型感受态细胞(以下称C-competent cell)的制备方法及其转化步骤。
[0004]本发明所述C-competent cell在制备过程中采用氯化物混合物洗漆,增加了细胞的通透性，在转化过程中无需要热激反应，无需长时间培养，无需增长的步骤。
[0005]本发明所述C-competent cell的转化过程仅需lmin,只需要将DNA和感受态细胞混合即可。简单的操作过程适合于自动化。
[0006]本发明所述C-competent cell具有很高的转化效率，转化效率高达108_109cfu /Ug质粒DNA。
[0007]本发明所述C-competent cell增加了冻融耐性且具有现制的、消毒的、随时可用等特点。
[0008]本发明所述的C-competent cell的制备过程通过下列步骤实现的:
[0009]I)将大肠杆菌DH5 α保存液涂布在无抗生素LB平板上，37°C过夜培养；挑取单克隆细菌至10ml LB培养基37°C振荡过夜；按1% (v / v)比例接种至100ml LB培养基中。
[0010]2) 37°C剧烈振荡培养基，使其在600nm OD值为0.4-0.6。
[0011]3)预冷培养基，4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌。
[0012]4)用缓冲洗液I重悬细菌，冰上孵育数分钟；4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌。
[0013]5)用缓冲洗液2重悬细菌，冰上孵育数分钟；4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，IOOul /管分装，_80°C、贮存备用。
[0014]其中缓冲洗液I为包含以下成分的水溶液:氯化镁(IOmM-1M,优选为:50mM)，氯化钾(lOmM-lM，优选为:20mM)，氯化钙(10mM-lM，优选为IOOmM)，葡萄糖(0.1_5%，优选为1% )，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(IOmM-1OOmM,优选为20mM)，调pH至6.5。[0015]缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液:氯化钙(IOmM-1M,优选为30mM)，氯化钠(IOmM-1M,优选为 50mM)，氯化铁(IOmM-1M,优选为 30mM)，DMSO(5_30%，优选为 10% )，调pH 至 7.0。
[0016]本发明所述的C-competent cell的转化过程通过下列步骤实现的:
[0017]I)从-80。°C取出 I 管 C-competent cell 置于冰上。
[0018]2)约I / 3C-competent cell解冻时加入1-5 μ I待转入质粒DNA,其中质粒DNA体积不应超过C-competent cell体积的5%,轻轻混合几秒钟,混合过程中注意避免C-competent cell在室温放置时间过长。
[0019]本发明提供的C-competent cell转化效率高、增加冻融耐性，该感受态细胞的转化过程操作简便，重复性好、效率高，能满足分子生物学实验要求，是一项实用有效的技术，具有较高的应用价值。
【具体实施方式】
[0020]以下通过实施例对本发明作进一步阐述。
[0021]实施例1:本发明所述C-competent cell的转化时间及转化效率检测。
[0022]本实施例中所用的材料和试剂如下:
[0023]材料:pUC18质 粒、受体菌DH5 α
[0024]试剂:LB液体培养基:蛋白栋10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，硫酸镁2.4克，蒸馏水定容至1000ml，PH7.0,121°C灭菌20min。
[0025]缓冲洗液I为包含以下成分的水溶液:50mM氯化镁，20mM氯化钾，IOOmM氯化钙，1%葡萄糖，20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，调节pH至PH6.5。
[0026]缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液:30mM氯化钙，50mM氯化钠，30mM氯化铁，10% DMS0，调节至 PH7.0。
[0027]本发明所述C-competent cell的制备过程如下:
[0028]将大肠杆菌DH5 α保存液涂布在无抗生素LB平板上，37°C过夜培养；挑取单克隆细菌至10ml LB培养基37°C振荡过夜；按1% (v / v)比例接种至100ml LB培养基中，37°C剧烈振荡培养基，使其在600nm OD值为0.4-0.6 ;预冷培养基，4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，用缓冲洗液I重悬细菌，冰上孵育3分钟；4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，用缓冲洗液2重悬细菌，冰上孵育3分钟；4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，IOOul /管分装，_80°C、贮存备用。
[0029]本发明所述的C-competent cell的转化过程如下:
[0030]I)从-80°C取出 I 管 C-competent cell 置于冰上。
[0031]2)约 I / 3C-competent cell 解冻时加入 1-5 μ I 待转入 IOng pUC18,,其中 IOngpUC18体积不应超过C-competent cell体积的5%,轻轻混合5秒钟,混合过程中注意避免C-competent cell在室温放置时间过长。
[0032]本发明所述C-competent cell的转化效率检测过程如下:
[0033]从-80 V冰箱中取出冻存的C-competent cell置于冰上，解冻后加入IOngpUC18,轻轻摇匀,将转化克隆转移到含抗生素Amp的LB平板上。记时,确定该C-competentcell转化所用的时间。当液体被培养基吸收后，倒置平板，37°C培养12-16h。同时做两个对照。对照组1:以同体积的无菌水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组在常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌水代替DNA溶液，但涂板时只取5ul转化克隆涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。待菌落长出后，分别在20min、40min、80min、160min时对菌落计数,计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。
[0034]实施例2普通感受态细胞制备方法转化及转化效率检测
[0035]本实施例中所用的材料和试剂如下:
[0036]材料:pUC18质粒、受体菌DH5 α
[0037]试剂:LB液体培养基:蛋白栋10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，硫酸镁2.4克，蒸馏水定容至 1000ml，PH7.0，121°C灭菌 20min、0.1mol / L CaCl2 (含 15%甘油)
[0038]普通感受态细胞(氯化钙法制备)制备过程如下(步骤参考分子生物学实验手册，作为C-competent cell的对比):
[0039]将大肠杆菌DH5ci保存液涂布在无抗生素LB平板上，37°C过夜培养；挑取单克隆细菌至5ml LB培养基37°C振荡过夜；按1% (v / v)比例接种至100ml LB培养基中，剧烈振荡2~3h，OD值约为0.6 ;4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，用40ml冰预冷的
0.1mol / L氯化钙溶液重悬细菌，冰上孵育30min ;4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，4ml冰预冷的0.1mol / L氯化钙溶液(含15%甘油)重悬细菌，冰浴15~60min，IOOul /管分装，_80°C、贮存备用。
[0040]普通感受态细胞转化效率检测过程如下:
[0041]从_80°C冰箱 中取出冻存的普通感受态细胞，冰上解冻后加入IOng pUC18，轻轻摇匀，冰上放置30min，42°C放置90s热激，快速置冰浴，保持2min。每管加1000ul LB培养基，37°C恒温摇床上培养lh。将转化后菌液于8000r / min离心lmin，倒掉上部分，留IOOul左右菌液，将菌液转移到含抗生素Amp的LB平板上。记时，确定该感受态细胞转化所用的时间。当液体被培养基吸收后，倒置平板，37。°C培养12-16h。同时做两个对照。对照组1:以同体积的无菌水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组在常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌水代替DNA溶液，但涂板时只取5ul菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。待菌落长出后，菌落计数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。转化时间结果如下:
[0042]
【权利要求】
1.新型感受态细胞(简称c-competentcell)的制备过程,步骤包括大肠杆菌培养,离心收集细菌，先后用两种溶液重悬细菌后收集细菌，分装，备用。
2.权利要求1的制备过程，其中两次重选细菌所用溶液分别为缓冲洗液1、缓冲洗液2，缓冲洗液I为包含以下成分的水溶液:氯化镁(IOmM-1M)，氯化钾(IOmM-1M)，氯化钙(IOmM-1M)，葡萄糖(0.1-5%)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(IOmM-1OOmM)，调PH值至6.5 ;缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液:氯化钙(IOmM-1M)，氯化钠(IOmM-1M)，氯化铁(IOmM-1M)，DMSO (5-30 % )，调 PH 值至 7.0。
3.权利要求1的制备过程，具体过程为: 将大肠杆菌DH5 α保存液涂布在无抗生素LB平板上，37°C过夜培养；挑取单克隆细菌至IOml LB培养基37°C振荡过夜；按1% (v / v)比例接种至100ml LB培养基中，37°C剧烈振荡培养基，使其在600nm OD值为0.4-0.6 ;预冷培养基，4°C、4000f/min离心IOmin收集细菌，用缓冲洗液I重悬细菌，冰上孵育3分钟；4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，用缓冲洗液2重悬细菌，冰上孵育3分钟；4°C、4000r / min离心IOmin收集细菌，IOOul /管分装，_80°C、贮存备用。 其中两次重悬细菌所用溶液分别为: 缓冲洗液I为包含以下成分的水溶液:50mM氯化镁，20mM氯化钾，IOOmM氯化钙，I %葡萄糖，20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，调pH至PH6.5 ； 缓冲洗液2为包含以下成分的水溶液:30mM氯化钙，50mM氯化钠，30mM氯化铁，10%DMS0，调 pH 至 PH7.0。
4.按照权利要 求1-3的方法制备的新型感受态细胞(C-competentcell)。
5.按权利要求1一3的方法制备的C-competentcell的转化过程,步骤包括在冰上解冻C-competent cell,至解冻I / 3时加入待转入质粒DNA,混匀,转化克隆涂板培养。
6.权利要求5的转化过程,其具体转化克隆为转入质粒DNA的C-competentcell。
7.权利要求5的转化过程，其具体步骤为: a)从-80°C取出I管C-competentcell置于冰上。 b)约I/ 3C-competent cell解冻时加入1-5 μ I待转入质粒DNA,其中质粒DNA体积不应超过感受态细胞体积 的5%，轻轻混合5秒钟，混合过程中注意避免C-competent cell在室温放置时间过长。
8.权利要求5-7的转化方法，其中大肠杆菌为大肠杆菌DH5a。
【文档编号】C12R1/19GK103805548SQ201410085753
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】不公告发明人 申请人:康盈创新生物技术(北京)有限公司