转基因水稻pa110-15品系特异性pcr检测引物及定性检测方法和试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了转基因水稻PA110-15品系特异性PCR定性检测引物及定性检测方法和试剂盒。本发明首先提供了转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系中插入载体基因和侧翼水稻序列的连接区序列，其碱基序列为SEQ?ID?No.2所示。本发明进一步提供了转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR检测引物以及定性检测方法。特异性验证实验表明，本发明所建立的转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性定性PCR检测方法具有高度的特异性。
【专利说明】转基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测引物及定性检测方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因水稻品系的特异性PCR检测引物及检测试剂盒，尤其涉及转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR定性检测引物、定性检测方法及检测试剂盒，属于转基因水稻品系检测领域。
【背景技术】
[0002]随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题也引起人们极大的关注，已有30多个国家相继实施转基因产品标识制度，包括中国。转基因标识制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。
[0003]目前，已有部分专利和文献报道了转基因植物的品系特异性检测方法。例如:张大兵等人于2006年建立了转基因M0N863玉米的品系特异性检测方法；谢家建等人建立了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号等一系列品系特异性检测方法；卢长明等人于2007年建立了一系列转基因油菜的品系特异性检测方法。但是，目前为止，尚未发现任何关于转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测引物；
[0005]本发明的目的之二是建立转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR定性检测方法；
[0006]本发明的目的之三是提供转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR定性检测试剂盒。
[0007]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]本发明根据转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系中插入的目的基因为LRP基因(SEQ ID N0.1)通过H1-TAIL PCR获得外源插入基因5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，所获得的含有LRP基因的外源插入载体及其两侧5’端和3’端侧翼水稻序列的连接区核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0009]本发明进一步根据插入基因载体和3’端旁侧序列的连接区序列设计9对转化体特异性定性检测引物，这9对转化体引物分别为:核苷酸序列为SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示的引物对I ;核苷酸序列为SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对2 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示引物对3 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.9和SEQ IDN0.10所示的引物对4 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物对5 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物对6 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物对7 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对8 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.20所示的引物对9。本发明应用常规的PCR反应条件，分别采用9对转化体引物进行PCR扩增，设置2个重复；从扩增结果可见，这9对转化体引物均能特异性地从转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15阳性材料样品中扩增出预期片段，但是用引物对8 (SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18)所示的引物扩增的条带(159bp)最为清晰，扩增效率较高，且引物二聚体较少。
[0010]本发明的目的之二是提供一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测方法，该方法包括:(1)提取待检测水稻样品的DNA ;(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.2所示核苷酸为靶基因设计特异性引物对，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的特异性条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系。
[0011]其中，所述的特异性引物对选自以下9对引物中的任意一对:核苷酸序列为SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对I ;核苷酸序列为SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对2 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示引物对3 ;核苷酸序列为SEQID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物对4 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物对5 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物对6 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物对7 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQID N0.18所示的引物对8 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.20所示的引物对9。
[0012]本发明进一步提供了一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测方法，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ; (2)以提取的DNA为模板，以SEQID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出159bp的目的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出159bp的目的条带，则待检测的水稻样品不是转闻赖氣酸储减蛋白基因水稻PA110-15品系
[0013]其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。
[0014]PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测结果的特异性灵敏度均有一定的影响；本发明考察了 PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测的特异性和灵敏度的影响，实验结果发现在引物终浓度为0.2 μ M、退火温度为58°C时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。
[0015]本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立:反应体系的总体积为25.0 μ L，其中，10 XPCR缓冲液2.5 μ L, 25mmol/L氯化镁溶液1.5 μ L，dNTPs混合溶液(各
2.5mmol/L) 2 μ L，0.2 μ mol/L 上游引物 0.5 μ L, 0.2 μ mol/L 下游引物 0.5 μ L, 0.025U/ μ LTaq酶1.5yL，25mg/L DNA模板2.0 μ L，余量为双蒸水。
[0016]所述的PCR扩增条件优选为:94°C变性5min ;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共进行35次循环；72°C延伸2min。
[0017]本发明进一步的目的是提供一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测试剂盒，包括:10 XPCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，PCR定性检测引物对，Taq酶和双蒸水；其中，所述PCR定性检测引物对选自以下9对引物中的任意一对:核苷酸序列为SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对I ;核苷酸序列为SEQ IDN0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对2 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示引物对3 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物对4 ;核苷酸序列为SEQ IDN0.11和SEQ ID N0.12所示的引物对5 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物对6 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物对7 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对8 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.19和SEQ IDN0.20所示的引物对9。
[0018]优选为核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对8。
[0019]采用本发明建立的品系特异性PCR定性检测方法对转基因水稻科丰6号、科丰8号、克螟稻、M12、TT51以及其它的转基因植物和非转基因植物材料进行了定性检测，定性PCR扩增结果表明，仅在转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15阳性材料基因组中扩增得到了目的片段大小的条带，在其它转基因水稻和其它转基因植物以及常规水稻明恢63等基因组中没有扩增得到预期目的片段；实验结果表明，本发明所建立的转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性定性PCR检测方法特异性强。【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1目的基因上下游H1-TAIL PCR第二轮和第三轮扩增产物；M:1kp plus DNAmarker ;1、2分别为:目的基因下游H1-TAIL PCR第二轮和第三轮扩增产物；3、4分别为:目的基因上游H1-TAIL PCR第二轮和第三轮扩增产物。
[0021]图2测序结果分析。
[0022]图3引物与分离出的Gtl基因序列上设计的引物长片段扩增结果；M:lkp plusDNA marker ；1:空白对照；2:阴性对照；3:PA110-15样品。
[0023]图4长片段扩增产物的测序结果分析。
[0024]图5Gtl基因上游H1-TAIL PCR第二轮和第三轮扩增结果；M:1kp plus DNAmarker ;1、2分别为:Gtl基因上游H1-TAIL PCR第二轮和第三轮扩增产物。
[0025]图6测序结果及与第一步拼接结果。
[0026]图7完整整合结构及侧翼序列的示意图。
[0027]图83’端旁侧序列9对转化体特异性引物筛选结果；引M:1OObp marker ;1:空白对照；2、3:阴性对照；4、5:PA110-15样品。
[0028]图9引物浓度为0.1 μ Μ/L的扩增结果；M:100bp Marker ；1:阴性对照；2:阳性样品 a -MV ；b:56°C ；c:58°C ；d:60°C ；e:62°C。
[0029]图10引物浓度为0.2 μ M/L的扩增结果；M:100bp Marker ；1:阴性对照；2:阳性样品 a -MV ；b:56°C ；c:58°C ；d:60°C ；e:62°C。
[0030]图11引物浓度为0.4 μ M/L的扩增结果；M:100bp Marker ；1:阴性对照；2:阳性样品 a -MV ；b:56°C ；c:58°C ；d:60°C ；e:62°C。[0031]图12引物浓度为0.8 μ M/L的扩增结果；M:100bp Marker ；1:阴性对照；2:阳性样品 a -MV ；b:56°C ；c:58°C ；d:60°C ；e:62°C。
[0032]图13特异性验证结果；M:100bp marker ；1:空白对照；2:阴性对照；3:PA110_15样品；4-13:分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8、样品9、样品10。
[0033]实施例1转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15外源插入基因的侧翼序列的获取
[0034]转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15外源插入目的基因为LRP基因，其碱基序列为SEQ ID N0.1所示。
[0035]通过H1-TAIL PCR获得整合结构(外源插入基因侧翼序列)
[0036]第一步:在目的基因LRP上设计上下游嵌套引物
[0037]LRP-Sp-1TGGTCCTGGAACCATCAAGAAGATC
[0038]LRP-Sp-2ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTGCTGGACCTTCTGGAGGCTCTGTT
[0039]LRP-Sp-3CCAAGGGTGATGCTCTCTTCAAGGC
[0040]LRP-ApICAGCCTTGAAGAGAGCATCACCCTT
[0041]LRP-Ap2ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTGAGTTTCCCAACAGAGCCTCCAGAAGLRP-Ap3GCAAAGCAGCACCACCAACTATGCT
[0042]图1为目的基因上下游H1-TAIL PCR第二轮和第三轮扩增产物。测序结果分析见图2。
[0043]第二步:用两种方法
[0044]①根据获得的3’端水稻基因组序列在GenBank上获得与其相连的5’水稻基因组序列，然后设计引物与分离出的Gtl基因序列上设计的引物进行长片段扩增。
[0045]RICE-5，-F: TCAGTGCATCTGCTGTGGCTGGTAG
[0046]Gtl-R: TGCTGTCATCTTAGCTTTTCCATGCAAC
[0047]扩增结果见图3 ;测序结果分析见图4。
[0048]②根据第一步获得的Gtl序列，设计上游H1-TAIL PCR嵌套引物
[0049]Gt1-ApITGGGTTGCCTACACCATGATTAACTT
[0050]Gtl-Ap2ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTAATTGTTTGAACTGCACGGCACCTT[0051 ] Gtl-Ap3TGCTGTCATCTTAGCTTTTCCATGCAAC
[0052]扩增结果见图5 ;测序结果及与第一步拼接结果见图6。
[0053]第三步:用普通PCR获得5’，3’端更多水稻基因组序列
[0054]完整整合结构及侧翼序列的示意图见图7，完整整合结构及侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0055]实验例I转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性定性检测特异性引物的筛选和扩增条件的优化
[0056]一、转化体特异性检测方法的建立
[0057]根据3’端旁侧序列设计9对转化体特异性引物。扩增外源插入载体和水稻基因组的连接区序列，扩增产物的大小均不小于lOObp。
[0058]共设置9对引物，引物序列分别为:[0059]引物1:目的片段长度为276bp
[0060]F:TTCGCTCATGTGTTGAGCATAT(SEQ ID N0.3)
[0061]R:GAGATTTGATTTGGCTGATCTAGG(SEQ ID N0.4)
[0062]引物2:目的片段长度为314bp
[0063]F:TTCGCTCATGTGTTGAGCATAT(SEQ ID N0.5)
[0064]R:GTTAAATGTCAACAGCCATCTGC(SEQ ID N0.6)
[0065]引物3:目的片段长度为328bp
[0066]F:TTCGCTCATGTGTTGAGCATAT(SEQ ID N0.7)
[0067]R:ATCGTTTGGTTCCTGTTAAATGTC(SEQ ID N0.8)
[0068]引物4:目的片段长度为138bp
[0069]F:TTCAGTACATTAAAAACGTCCGC(SEQ ID N0.9)
[0070]R:GAGATTTGATTTGGCTGATCTAGG(SEQ ID N0.10)
[0071]引物5:目的片段长度为176bp
[0072]F:TTCAGTACATTAAAAACGTCCGC(SEQ ID N0.11)
[0073]R:GTTAAATGTCAACAGCCATCTGC(SEQ ID N0.12)
[0074]引物6:目的片段长度为190bp
[0075]F:TTCAGTACATTAAAAACGTCCGC(SEQ ID N0.13)
[0076]R:ATCGTTTGGTTCCTGTTAAATGTC(SEQ ID N0.14)
[0077]引物7:目的片段长度为121bp
[0078]F:GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC(SEQ ID N0.15)
[0079]R:GAGATTTGATTTGGCTGATCTAGG(SEQ ID N0.16)
[0080]引物8:目的片段长度为159bp
[0081]F:GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC(SEQ ID N0.17)
[0082]R:GTTAAATGTCAACAGCCATCTGC(SEQ ID N0.18)
[0083]引物9:目的片段长度为173bp
[0084]F:GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC(SEQ ID N0.19)
[0085]R:ATCGTTTGGTTCCTGTTAAATGTC(SEQ ID N0.20)
[0086]引物筛选的结果见图8。从筛选结果可见:在阳性材料中均得到预期大小条带，而阴性对照中未得到，初步验证了获得的3’端侧翼序列的正确性，后续可用长片段PCR方法验证整合结构的正确性并建立转化体特异性检测方法。[0087]由图8的扩增结果可见，引物8扩增效率较高，且引物二聚体较少。因此，本发明优选采用SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示引物作为检测转基因水稻PAl 10-15品系特异性PCR检测引物。
[0088]2.PCR反应体系和条件优化
[0089]调整优化PCR反应体系中引物的终浓度，设置0.1 μ M、0.2 μ M、0.4 μ M、0.8 μ M等4个浓度梯度，并以54°C、56°C、58°C、60°C、62°C为退火温度进行PCR反应的扩增，结果表明，在所设的不同引物浓度和不同退火温度条件下都能扩增出预期大小的片段，但在引物终浓度为0.2 μ M、退火温度为58°C时效果最好(图9:引物浓度为0.ΙμΜ/L，图10:引物浓度为0.2 μ M/L,图11:引物浓度为0.4yM/L,图12:引物浓度为0.8yM/L)0[0090]实验例2转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性检测体系及反应程序的建立
[0091]一、植物基因组DNA的提取与检测
[0092]I植物DNA提取
[0093]1.1CTAB提取缓冲液的配制
[0094]600mL 水中加入 81.7g NaCl 和 20g CTAB,充分溶解后加入 lmol/LTris-HCl(ρΗ7.5)溶液 IOOmL, 0.5mol/L EDTA (ρΗ8.0)溶液 IOOmL,最后用 HCl 或 NaOH 溶液调 pH 至8.0，加水定容至1000mL。高温高压(103.4kPa/121°C )条件下灭菌20min后使用。
[0095]1.2提取方法
[0096]a.1OOmg样品，充分研磨成粉末后转移至2ml离心管中；
[0097]b.1ml预热至65 °C的CTAB提取缓冲液,充分混合、悬浮试样，并轻柔混合。
[0098]c.65°C水浴40min,期间颠倒混匀数次；[0099]d.12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管,加入等体积酹、氯仿-异戍醇(24:1)，充分混合；
[0100]e.12000r/min离心lOmin。转移上清至一新离心管,加入等体积氯仿-异戍醇(24:1)，充分混合；
[0101]f.12000r/min离心IOmin,取上清,加入2/3体积异丙醇，1/10体积乙酸钠。-20°C放置2小时或更长时间；
[0102]g.12000r/min 离心 IOmin ；
[0103]h.弃上清，加入500 μ L，70%乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000r/min离心IOmin ；
[0104]1.弃上清，将离心管倒立于吸水纸吸干，并使乙醇充分挥发，干燥DNA。
[0105]g.加 100 μ I 水溶解 DNA ；
[0106]k.用重蒸馏水将DNA溶液浓度调制为IOOng/μ 1，储存于_20°C备用。
[0107]2DNA 检测
[0108]取3ul提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度和纯度。
[0109]二、转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性定性PCR检测体系及反应程序的建立
[0110]经过优化，转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系特异性定性PCR检测的体系见表1。
[0111]表1PAl 10-15水稻品系特异性定性PCR检测体系
[0112]
【权利要求】
1.转闻赖氣酸储减蛋白基因水稻PA110-15品系中插入载体基因和侧翼水稻序列的连接区核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。
2.权利要求1所述的连接区核苷酸作为靶基因检测转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PAl 10-15品系的应用。
3.转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PAl10-15品系特异性的PCR定性检测引物，其特征在于，选自以下9对引物中的任意一对:核苷酸序列为SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物对I ;核苷酸序列为SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的引物对2 ;核苷酸序列为SEQ IDN0.7和SEQ ID N0.8所示引物对3 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的引物对4 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的引物对5 ;核苷酸序列为SEQID N0.13和SEQ ID N0.14所示的引物对6 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.16所示的引物对7 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对8 ;核苷酸序列为SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.20所示的引物对9。
4.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测方法，其特征在于，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述的连接区核苷酸为靶基因设计特异性引物对，建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的目的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的目的条带，则待检测的水稻样品不是转闻赖氣酸储减蛋白基因水稻PA110-15品系。
5.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测方法，其特征在于，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求3所述的PCR检测引物建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出预期的目的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出预期的目的条带，则待检测的水稻样品不是转高赖氨酸储减蛋白基因水稻PA110-15品系。
6.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系特异性的PCR定性检测方法，其特征在于，包括:(I)提取待检测水稻样品的DNA ；(2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示的引物对建立PCR反应体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测的样品中扩增出159bp的目的条带，则待检测的水稻样品是转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15品系；如果从待检测的样品中未能扩增出159bp的目的条带，则待检测的水稻样品不是转闻赖氣酸储减蛋白基因水稻PA110-15品系。
7.按照权利要求4-6任何一项所述的PCR定性检测方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为:反应体系的总体积为25.0 μ L，其中，10 XPCR缓冲液2.5 μ L，25mmol/L氯化镁溶液1.5 μ L，dNTPs 混合溶液 2 μ L，0.2 μ mol/L 上游引物 0.5 μ L，0.2 μ mol/L 下游引物 0.5 μ L，0.025U/y L Taq 酶 1.5yL，25mg/L DNA 模板 2.0 μ L，余量为双蒸水。
8.按照权利要求4-6任何一项所述的PCR定性检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为:94°C，5min ；94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s, 35 个循环；94°C，2min。
9.一种转高赖氨酸储藏蛋白基因水稻PA110-15的品系特异性PCR定性检测试剂盒，包括:10XPCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，检测上下游引物对，Taq酶和双蒸水；其特征在于:所述检测上下游引物为权利要求3所述的PCR检测引物。
10.按照权利要求9所述的品系特异性PCR定性检测试剂盒，其特征在于:所述PCR检测引物的核苷酸序 列为SEQ ID N0.17和SEQ ID N0.18所示。
【文档编号】C12Q1/68GK103834646SQ201410081539
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】张秀杰, 梁利霞, 宛煜嵩, 涂巨民, 金芜军, 苗朝华, 李亮, 高进 申请人:中国农业科学院生物技术研究所