玉米c4型磷酸丙酮酸双激酶（ppdk）基因及其在小麦中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了玉米C4型磷酸丙酮酸双激酶（PPDK）的基因及其在小麦中的应用，本发明提供的新型PPDK基因可在小麦中稳定表达与遗传，光合效率较受体材料明显提高，为利用C4型高光效基因改良C3作物的光合效能，选育产量水平大幅度提高的高光效转基因小麦品种提供了重要的基因来源和亲本材料支撑。
【专利说明】玉米C4型磷酸丙酮酸双激酶(PPDK)基因及其在小麦中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及一种玉米C4型磷酸丙酮酸双激酶(PPDK)的基因及其在小麦中的应用。
【背景技术】
[0002]小麦是我国主要的粮食作物，其生产能力及供需状况始终关系到我国国民经济发展和粮食安全等重大战略问题。从世界范围来看，世界粮食生产状况始终与各国政治、经济发展状况紧密联系，粮食生产量和储备量一有下降，国际粮价就大幅攀升，恐慌情绪就大势蔓延，对各国的政治经济形势造成重大影响；从国内来看，随着我国人口的增长，工业化和城镇化的快速发展，对粮食的需求将持续加大。同时，由于我国粮食作物种植面积不可能大幅度恢复增长，因此要保障我国粮食安全，唯一的出路是持续提高单产，这就要求在小麦、水稻等主要粮食作物的产量性状遗传改良方面获得跨越性的进展。
[0003]光合作用是一切绿色植物物质生产的基础，据估计，植物地上部干物质的90%来自于光合作用。因此，提高作物产量的关键是提高光能利用效率，从而提高单位面积的产量。而要大幅度提高光能利用率和实现超高产，必须采取合理株型(外在光合效率)和高光效(内在光合效率)相结合的技术路线。目前小麦、水稻等农作物单产水平的提高，主要是由于品种产量潜力遗传改良和生产条件改善的结果，而产量潜力的遗传改良主要是通过形态性状的改良和杂种优势等途径来实现的，在现有小麦、水稻等农作物品种产量水平已相对较高，且都已具有良好的形态结构，叶面积指数和收获系数都已接近极限的情况下，再单纯依靠上述途径已很难实 现产量潜力的跨越式提高。在此背景下，国内外许多学者把目光纷纷投向光能利用效率的遗传改良研究，希望通过提高光合效率来实现生物学产量的大幅度提高，进而获得产量潜力改良的突破性进展。
[0004]根据光合作用途径的不同，植物可分为C3型，C4型和CAM (景天酸)型。C4和CAM植物是在逆境下经过长期驯化，从C3植物进化而来的。与小麦、水稻、大豆等C3植物相比，玉米、高粱、甘蔗等C4植物具有CO2浓缩机制，光补偿点高，CO2补偿点低，光呼吸弱，特别在高温、干旱等逆境条件下具有明显的光合优势。由于C4植物具有高光合、高水分、高氮素利用效率以及高生物学产量，因此将C4途径引入C3植物以提高其光合效率和籽粒产量，一直是国内外生物学研究领域的重大科学命题。以前此方面的研究主要途径是同室筛选、细胞融合和远缘杂交等方法，但一直未获得突破性进展。近年来日趋成熟的转基因技术由于可以打破物种间的生殖隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农作物重要性状遗传改良瓶颈问题的主要技术途径。
[0005]目前将C4途径关键酶基因已有一些报道，但C4途径高光效关键基因导入C3作物后，其作用机理一直尚未明确。因此，以导入C4型高光效基因的C3作物为研究材料，深入研究〇4闻光效基因的导入对受:体材料相关代谢途径广生的影响，揭不C4途径关键基因在C3作物中的作用机理，可为利用C4途径关键基因改良C3作物的光合效能与产量潜力提供坚实的理论基础。
[0006]PPDK催化CO2初级受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的生成，该反应是C4代谢途径中的限速步骤(Usuda, 1984),是C4光合途径过程中另一个备受关注的酶。Ishimaru等(1998 )将玉米的PPdk转入拟南芥和马铃薯中，转基因植株的PPDK活性分别比对照提高4和5.4倍。Sheriff等(1998)将景天酸科植物ppdk转入烟草，转基因烟草的每个蒴果中的种子数比野生型多，蒴果也更重。Ku等(2000)将玉米的ppdk转入水稻，转基因水稻田间表现为30-35%。Fukayama等(2001)将ppdk导入水稻后,ppdk的表达有40%的植株高于原种40倍以上，达到了玉米的1/2水平。以上研究均已成功地将ppdk转入烟草、马铃薯、拟南芥和水稻等C3植物中，但这些转基因植株的光合生理特性都没有明显的变化。季本华等(2004)发现喷施NaHSO3和ATP可以增加转基因植株光合速率，其机理可能是:转C4基因水稻中PPDK激活Pyr生成PEP是耗能反应,需要ATP的参与,详细机制还有待进一步的深入研究。因此，克隆新的，具有良好功能的C4型ppdk基因对于改良C3植物的光合效能具有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因，在本发明的另一方面，还涉及一种能够提高小麦光合作用的磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0008]本发明一方面涉及一种磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列为SEQIDN0.1，或者与SEQIDN0.1具有95%以上同源性的基因序列。
[0009]本发明另一方面还涉及一种磷酸丙酮酸双激酶(proK)，所述的磷酸丙酮酸双激酶(PPDK)的氨基酸序列为SEQIDN0.1核苷酸序列所对应的氨基酸序列。
[0010]本发明另一方面还涉及一种载体，所述的载体含有上述磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因核苷酸序列。
[0011]在本发明的另一方面，本发明还涉及上述磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因、磷酸丙酮酸双激酶(proK)或者载体在提高小麦光合作用中的应用。
[0012]在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体通过基因枪介导法、农杆菌介导法或花粉管通道法导入小麦中。
[0013]本发明提供的新型ppdk基因可在小麦中稳定表达与遗传，光合效率较受体材料明显提高，为利用C4型高光效基因改良C3作物的光合效能，选育产量水平大幅度提高的高光效转基因小麦品种提供了重要的基因来源和亲本材料支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:表达载体p3301_ppdk载体构建示意图；
[0015]图2:不同光照强度下转基因小麦与未转化对照净光合速率的变化，其中:CK:未转化对照组；pk:转基因材料；
[0016]图3:开花期转基因小麦与对照组净光合速率日变化，其中:CK:未转化对照组；PK:转基因材料。
【具体实施方式】[0017]实施例1
[0018]实验用RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天为时代公司，MLV反转录试剂盒购自Promega公司，LA-TaqDNA聚合酶、pMD_19T克隆载体、大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5 α感受态细胞制备试剂盒均为TaKaRa公司产品，植物表达载体PC0MBIA3301为商购产品，限制性内切酶为MBI公司产品，氨苄青霉素为Amersco公司产品，其余试剂为进口或国产分析纯。
[0019]根据已报道的玉米丙酮酸磷酸二激酶(PI3DK)基因cDNA序列(GenBank登录号:BT054438)，运用Primer5.0软件设计一对特异性引物，5’端各加两个保护碱基。PK1:5’ - GCagatctTCGGCTCCCTCTCCCCTTGCTCCAT - 3，，含 Bgl II 酶切位点，PK2:5’ - GGttataaCACATCCACCAGCAGCAGGCAATCC - 3’，含Aan I酶切位点。引物由上海Sangon公司合成。玉米总RNA提取及cDNA合成参照Promega公司RNA提取试剂盒和MLV反转录试剂盒说明书进行。
[0020]以玉米总cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系:10_50ng/ul基因组模板；10 μ M 的 PKl 和 ΡΚ2 各 0.5μ I ;2.5μ IlOXReactionBufTer ；4μ IdNTPmix (2.5mM)；0.5 μ ILA - Taq酶，加水至25 μ I。反应程序:94°C预变性3min ;94°C变性45s，65°C复性30s，72°C延伸2.5min，30个循环；然后72°C延伸lOmin。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收Kit回收3kb目的片段，通过T/A克隆法连接到PMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5ci，涂平板过夜培养，挑取阳性克隆委托北京博尚生物公司测序，验证为正确的克隆命名为pMD19-ppdk,重组质粒pMD19 - ppdk由大连宝生物有限公司测序,序列测定结果表明合成片段长度为3004Bp，包括一个2916Bp长的开放阅读框，其核苷酸序列为SEQIDN0.1，其编码971个氨基酸残基的蛋白质(氨基酸序列为SEQIDN0.2)。将pMD19_ppdk和双元表达载体PC0MBIA3301分别用Bgl II和Aan I双酶切双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收3kb目的条带和表达载体片段，16°C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，经PCR和双酶切鉴定为正确的克隆命名为p3301-ppdk (图1)。
[0021]2、高光效ppdk基因导入周麦19及PCR鉴定
[0022]以小麦品种周麦19的幼胚为受体材料。取开花后12-14d的穗中部、大小一致的未成熟种子，用70%的酒精表面消毒lmin,无菌水冲洗3次后用0.1%的HgC12消毒IOmin,无菌水冲洗3-4次。无菌条件下剥出幼胚(Imm左右)，于MS诱导培养基(MS+2mg/L2，4-D+0.4%琼脂+3%蔗糖，pH6.2)上暗培养4-5d后，置于高渗培养基(MS+2mg/L2，4-D+0.7%琼脂+甘露醇+3%蔗糖，pH5.8)上渗透处理4-6h，利用含有p3301-ppdk载体的基因枪微粒轰击后在高渗培养基上继续处理16h，转至愈伤诱导培养基。培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基(1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/LKT+0.4% 琼脂 +3% 蔗糖 +4%PPT，ρΗ6.2)，连续筛选 2代，每代2周，经过筛选的抗性苗转至生根培养基(1/2MS+0.2mg/LNAA+0.4%琼脂+3%蔗糖，pH6.5)中，至再生苗根系较健壮时，即可进行炼苗1-2天。生根、壮苗后移入花盆中，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株125株。
[0023]提取所有再生植株的基因组DNA,根据已克隆的ppdk基因序列设计了一对特异性弓丨物 AKL2:5’ -GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGT - 3’ 和 AKR25’ -ATGGTCTTGTTGCCCTCGCTCTT - 3’。扩增程序为:94°C 3min, 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 60s, 29个循环，72°C IOminPCR检测片段大小为938bp。利用该引物对再生植株进行PCR检测，以鉴定阳性植株。PCR反应体系为:10-50ng/ul基因组模板;10 μ M的AKL2和AKR2各0.5 μ I ;2.5 μ IlOXReactionBuffer ；4μ IdNTPmix (2.5mM) ；0.5μ ITaq 酶，加水至 25 μ I。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。有146株可以扩增出938bp的目的条带，鉴定为阳性植株。
[0024]3、转基因小麦光合生理特性分析
[0025]利用CIRAS-2型光合测定系统，分析不同光照强度下转基因小麦材料和未转化对照(周麦19)的净光合速率的变化。结果表明(图2)，随着光强增加转基因小麦及未转化对照旗叶的净光合速率均表现为逐渐增加，低光强(PPFD〈500 μ mol/m2/s)条件下材料间净光合速率差异不明显，当PPFD>500 μ mol/m2/s时，材料间的净光合速率开始出现差异，并且随着光强逐渐增加，材料间的的净光合速率差异表现为逐渐增加。转基因小麦与未转化对照相比，转基因小麦利用高光强的能力显著增，未转化对照周麦19的光饱和点为1465μπι01/m2/s,转基因株系光饱和点达到1505 μ mol/m2/s,明显高于对照。
[0026]转基因株系和对照在开花期的光合速率日变化结果表明(图3)，转基因材料在全天(6:00-18:00)光合速率均高于未转化对照。转基因株系和对照的日光合速率最大值均出现在10:00，分别达到23.1和22.1 μ molCC^n^s—1，转基因材料最大净光合速率明显高于对照。同时，转基因材料与对照在中午强光高温条件下均表现出了午休现象，但午休时转基因材料光合速率仍高于未转化对照。
[0027]以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
[0028]ApplicationProject
[0029]-------------------
[0030]<120>Title:玉米C4型磷酸丙酮酸双激酶(PI3DK)基因及其在小麦中的应用
【权利要求】
1.一种磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列为SEQIDN0.1，或者与SEQIDN0.1具有95%以上同源性的基因序列。
2.一种磷酸丙酮酸双激酶(proK)，所述的磷酸丙酮酸双激酶(ProK)的氨基酸序列为SEQIDN0.1核苷酸序列所对应的氨基酸序列，优选的，所述的核苷酸序列为SEQIDN0.2。
3.一种载体，所述的载体含有权利要求1所述的磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因核苷酸序列。
4.上述磷酸丙酮酸双激酶(ProK)基因、磷酸丙酮酸双激酶(ProK)或者载体在提高小麦光合作用中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的载体通过基因枪介导法、农杆菌介导法或花粉管通道法导入小 麦中。
【文档编号】C12N15/82GK103805616SQ201410064052
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】许为钢, 李艳, 齐学礼, 王会伟, 胡琳, 张磊 申请人:河南省农业科学院小麦研究所