具有改良的氮利用和逆境耐性的植物的利记博彩app

具有改良的氮利用和逆境耐性的植物的利记博彩app【专利摘要】本发明涉及转基因植物，所述转基因植物具有增加的氮利用效率、逆境耐性或者这二者且用新的载体构建体转化，所述载体构建体包含调节植物中氮利用的核酸序列。在各种实施方案中，所述载体构建体包含选自如下一组的一或多个核酸序列：SEQ?ID?NO：2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或者38。本发明还涉及转化植物的分离的载体以及用于检测转化的植物的抗体。本发明还涉及在植物中表达核酸分子的方法，所述核酸分子相应于调节植物中的氮利用或者由氮条件调节的核酸序列。【专利说明】具有改良的氮利用和逆境耐性的植物[0001]本申请是申请日为2007年10月27日的申请号为200780048109.0标题为“具有改良的氮利用和逆境耐性的植物”的申请的分案申请_2]相关申请的交叉参考[0003]本申请要求2006年10月27日申请的美国申请系列号60/854，927的优先权，其全文引入本文做参考。发明领域[0004]本发明一般性涉及具有改良的氮利用和逆境耐性的植物，更特别涉及用改良逆境耐性和氮摄取、代谢或者这二者的基因转化的玉米植物。_5]发明背景[0006]植物在其营养生长和生殖生长阶段需要氮。氮通过土壤矿化、应用氮肥或者这二者而可为植物所利用。然而估计应用于农作物的50%-70%的氮从植物-土壤系统中丧失[Peoples,M.B.etal.,“MmimizingGaseousLossesofNitrogen,，，InNitrogenFertilizerintheEnvironment(Bacon,PE.,ed.)MarceIDekker,pp.565-606(1995)]。氮是最昂贵的植物营养素之一，氮肥不总是可以以合理成本获得且氮肥的过量应用可导致径流中的污染问题。玉米是通常需要氮肥以发挥其遗传潜力的农业重要植物的实例。[0007]发明概沭[0008]本发明涉及转基因植物，该植物具有增加的氮利用效率、逆境耐性或者这二种性质，其已经使用包括调节植物中氮利用的核酸序列的新载体构建体转化。本发明还涉及用以转化植物的分离的载体以及涉及用于检测转化的植物中感兴趣的核苷酸序列的表达的抗体。本发明还涉及在植物中表达相应于调节植物中氮利用的核酸序列的核酸分子的方法。[0009]特别地，用于转化植物的载体已经使用选自如下的核苷酸序列构建:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30,SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDN0:36和SEQIDNO:38以及其变体、片段和互补序列。这些载体包含5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核酸序列、DNA启动子序列和终止子序列是可操纵地连接的，以允许所述核苷酸序列转录。在一些实施方案中，所述启动子序列可以是组成型植物启动子或者组织特异性启动子。[0010]本发明还包括多克隆抗体，包含由选自如下的核苷酸序列编码的多肽的多克隆抗体:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36以及SEQIDNO:38。[0011]本发明还包括用选自如下的一或多个核苷酸序列转化的植物:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4,SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:1USEQIDNO:13、SEQIDNO:15,SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32,SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:38以及其变体和片段。所述植物选自水稻、玉米、大豆、芸苔(canola)、小麦、苜猜、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆(bean)、豌豆(pea)、马铃薯、油菜(oilseedrape)、高粱、饲草(foragegrass)、牧草(pasturegrass)、草坪草以及甘鹿。本发明还包括这种植物的组成部分、从这种植物产生的植物种子以及用本发明的载体构建体转化的植物种子。[0012]本发明还包括用选自如下的一或多个核苷酸序列转化的宿主细胞:SEQIDNO:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17,SEQIDNO:22,SEQIDNO:24,SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36以及SEQIDNO:38。所述宿主细胞可以是细菌细胞或者植物细胞。[0013]本发明还包括在植物中表达由氮调节的核酸分子的方法，所述方法包括提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或者植物种子，以及在有效条件下生长所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中表达所述核酸分子的条件。转基因植物的生长有效增加所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物的氮摄取，和/或增加所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物的氮利用效率。本发明还包括前述方法，其中提供转基因植物或者转基因植物种子。本发明还包括前述方法，其中所述植物选自水稻、玉米、芸苔、小麦、苜猜、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆、豌豆、马铃薯、油菜、高粱、饲草、牧草、草坪草以及甘蔗。[0014]本发明还包括通过在植物中表达由氮调节的核酸分子而改良植物逆境耐性的方法，所述方法包括提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或者植物种子并且在有效条件下生长所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中表达所述核酸分子的条件。[0015]本发明还包括通过在植物中表达由氮调节的核酸分子而改变植物形态学的方法，所述方法包括提供用本发明的载体构建体转化的转基因植物或者植物种子并且在有效条件下生长所述转基因植物或者由所述`转基因植物种子长成的植物的步骤，所述条件是在所述转基因植物或者由所述转基因植物种子长成的植物中表达所述核酸分子的条件。[0016]本发明还包括载体构建体，其包含编码选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10,SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18、SEQIDNO:23,SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35,SEQIDN0:37和SEQIDNO:39的氨基酸序列的核苷酸序列、5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA启动子序列以及终止子序列可操纵地连接以允许所述核苷酸序列转录。[0017]本发明还包括包含由植物中氮调节的核苷酸序列的载体构建体，其中所述核苷酸序列选自核苷酸序列SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13,SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36和SEQIDNO:38;与如下核苷酸序列具有至少95%序列相同性的核苷酸序列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17,SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32,SEQIDNO:34、SEQIDNO:36或者SEQIDNO:38，其中所述核苷酸序列由植物中氮调节；编码选自如下氨基酸序列的核苷酸序列:SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23,SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:3USEQIDNO:33、SEQIDNO:35,SEQIDNO:37和SEQIDNO:39;以及编码与如下氨基酸序列具有至少95%序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列:SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35,SEQIDNO:37或者SEQIDNO:39，其中所述核苷酸序列由植物中氮调节；其中所述构建体进一步包含5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA启动子序列以及终止子序列是可操纵地连接的以允许所述核苷酸序列的转录。[0018]优选实施方案详述[0019]更有效利用氮的植物品种的开发将降低氮的过量施用、节约农场主的生产成本、帮助不能获得肥料的发展中国家的农场主获益并且降低与应用过量氮肥相关的污染。一种已经用于开发具有改良的氮利用的植物品种的方法依赖于常规的植物育种技术。[0020]需要开发更有效地吸收和利用氮的植物栽培种。植物学家已经采用简略语氮利用效率(NUE)，且已经开发了各种测量和评估NUE的方法[CraswelI，E.T.andGodwin,D.C.(1984)Theefficiencyofnitrogenfertilizersappliedtocerealsgownindifferentclimates.1nAdvancesinPlantNutrition(Vol.1)(Tinker,P.B.andLauchli,A.,eds),pp.1-55,PraegerPublishers；Steenbjerg,FandJakobsen,S.T.(1963)Plantnutritionandyieldcurves.SoilSc1.95,69-90:Siddiqi,Μ.Y.andGlass,D.M.(1981)Utilizationindex:amodifiedapproachtotheestimationandcomparisonofnutrientutilizationefficiencyinplants.T.PlantNutr.4,289-302:Moll,R.H.etal.(1`982)Analysisandinterpretationoffactorswhichcontributetoefficiencyofnitrogenutilization.Agron.T.74,562-5641。在定义中有一些差异。一些定义基于总生物量，而其它定义基于产生的谷物的重量。另一组定义使用从土壤中提取氮的效率加以描述。用于改良谷物产量所应用的氮的效率可以通过农学利用率(AE)即生理学效率和利用效率的乘积或者摄取效率与利用效率的乘积NUEg进行测量。其它定义将生理学因素考虑在内。[0021]如在本说明书中所用，术语氮利用效率或者NUE被定义为包括在同化途径中任何主要氮代谢库大小的可测量改变(例如可包括如下一或多项的可测量改变:硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的总蛋白质含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量)，或者植物示出在较低的施氮肥水平提供相同或提高的产量，或者植物示出当与未用本发明的氮调节的核酸构建体转化的植物相比时在相同施氮肥水平提供提高的产量。“可测量改变”可包括氮同化途径的任何成分(代谢库)的量的增加或降低。改变可包括所述途径中一或多个代谢库的降低或增加，或者一或多个库的降低伴随一或多个其它库的增加，例如当氮同化途径中一个中间体被用于产生另一个中间体或者所述途径的产物时。例如，在谷氨酸向谷氨酰胺的转化中，谷氨酸的水平可降低而谷氨酰胺的水平可增加。因此，虽然不受任何特别的理论或机制的束缚，一或多个这些库中的任何改变均提示氮被植物更有效地利用。[0022]氮利用效率的增加可以与同化途径中任何主要氮代谢库大小中大约5%、大约10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、大约200%或者更高的可测量改变相关。在一个实施方案中，本发明的转基因植物当与不含本发明的氮调节序列的植物相比时从环境摄取增加的氮。“氮调节序列”是指应答暴露于氮而被调节(例如增加或降低，或者上调或下调)的核苷酸或氨基酸序列，“调节氮利用的核苷酸序列”是指编码与氮代谢相互作用的蛋白质的核苷酸序列。[0023]本发明进一步提供了通过在植物中表达一或多个氮调节核苷酸序列而改良植物逆境耐性的方法。在一个实施方案中，所述氮调节核苷酸序列是SEQIDN0:2、4、7、9、ll、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38，或者其变体和片段。在另一个实施方案中，所述氮调节核苷酸序列是编码SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39的核苷酸序列，或者其变体和片段。[0024]如本文所用，术语“逆境(stress)”或“逆境条件(stresscondition)”是指植物、植物细胞等暴露于对植物的代谢、生长、发育、繁殖和/或存活(统称“生长”)具有不利作用的物理或化学剂或者条件。逆境可以通过例如环境因素如水(例如灌溉、干旱、脱水)、厌氧条件(例如低水平氧)、异常渗透条件、盐度或温度(例如高热/温热、寒冷、严寒、霜冻)、营养素缺乏如氮缺乏或者暴露于污染物或者通过激素、第二信使或者其它分子而施加于植物。厌氧逆境例如是由于足以产生逆境应答的氧水平降低(低氧或缺氧)。灌溉逆境可以是由于植物、植物部分、组织或分离的细胞在液体介质中长期或短暂浸泡所致，例如在季风、多雨季节、洪水或者过量灌溉植物等期间发生。寒冷逆境或者热逆境可以是分别由于温度从特定植物物种的最佳生长温度范围降低或升高而发生。本领域技术人员易于确定且已知这种最佳生长温度范围。脱水逆境可以通过细胞、组织、器官或者完整植物的水分丧失、膨压降低、或者水含量降低而引起。干旱逆境可由于水的匮乏或者供给细胞、组织、器官或生物体的水减少而引起或者与之相关。盐逆境可以与细胞的胞内或胞外环境的渗透压波动相关或者由其引起。渗透逆境可以与例如植物细胞的胞内或胞外环境中分子浓度的改变相关或者由其引起，特别是在所述分子不能穿过植物细胞膜而隔离(panitioned)的情况中。[0025]逆境耐性的改良可以在指定逆境条件下对植物性能进行任何定量或定性测量而评定并且与在相同逆境条件下生长的未用本发明的氮调节序列转化的植物的性能进行对t匕。因此，所述植物可表现为改良的氮含量、改变的氨基酸或蛋白质组成、健壮的生长特性、增加的营养体产量(vegetativeyield)或者更好的种子产量和品质。这些植物可以通过检查如下任何参数而鉴别:1)生长速度，根据湿重或干重的增长速度测量；2)成熟植物的营养体产量，根据鲜重或干重测量；3)种子或果实产量；4)种子或果实重量；5)植物的总氮含量；6)果实或种子的总氮含量；7)植物的游离氨基酸含量；8)果实或种子的游离氨基酸含量；9)植物的总蛋白质含量；以及10)果实或种子的总蛋白质含量。检测这些参数的程序和方法为本领域技术人员所熟知。这些方法可包括测量酶/蛋白质水平的酶测定法和免疫测定法；测量各种植物组织的氨基酸组成、游离氨基酸库或者总氮含量的测定法；根据鲜重随着时间的增加测量生长速度；或者根据总干重和/或总种子重量测量植物产量。[0026]细菌或植物细胞的转化[0027]本发明提供了新的核苷酸序列，其调节植物中氮利用效率。本发明还提供了本发明的氮调节蛋白质的氨基酸序列。[0028]可以对本发明的氮调节核苷酸序列进行修饰以获得或者增强在植物细胞中的表达。本发明的氣调节序列可以提供在表达盒中以在感兴趣的植物中表达。“植物表达盒”包括能导致在植物细胞中从开放读框中表达蛋白质的DNA构建体。所述盒包括5'-3'转录方向的与本发明的DNA序列可操纵地连接的转录起始区(即启动子)以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。所述盒可另外含有被共转化进生物体中的至少一个其它基因，如选择标记基因。或者，所述其它基因可以提供在多个表达盒上。这种表达盒具有多个限制位点，用以插入氮调节序列使之在调节区的转录调节下。[0029]“启动子”是指发挥指导下游编码序列转录功能的核酸序列。启动子与其它转录和翻译调节核酸序列(也称作控制序列)在一起是感兴趣的DNA序列表达所必需的。优选地，启动子是已知在导入了本发明的核苷酸序列的生物体中刺激转录的启动子。[0030]启动子与植物宿主和/或本发明的DNA序列可以是天然的或者类似的，或者是外源或异源的。另外，启动子可以是天然序列或者是合成序列。在启动子与植物宿主是“天然”或者“同源”的情况中，所述启动子是指在导入所述启动子的天然植物中发现的启动子。在启动子与本发明的DNA序列是“外源”或者“异源”的情况中，所述启动子是指与本发明的DNA序列可操纵地连接的非天然或非自然发生的启动子。“异源”通常是指核酸序列与其存在于之中的细胞或者天然基因组的一部分不是内源的核酸序列，但是已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微轰击(microproiection)等技术加入细胞中。“可操纵地连接”是指启动子与第二个序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列起始并介导相应于第二个序列的DNA序列的转录。通常“可操纵地连接”是指连接的核酸序列是邻近的，且在需要连接两个蛋白质编码区的情况中是邻近并且位于相同读框中。[0031]在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。用于植物中的合适的组成型启动子包括:来自植物病毒的启动子，如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(chloroticstreakcaulimovirus,PCISV)启动子(美国专利N0.5，850，019);花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Odelletal.(1985)Nature313=810-812);小球藻病毒甲基转移酶基因启动子(美国专利N0.5，563，328)以及玄参花叶病毒(FMV)全长转录启动子(美国专利N0.5,378,619);如水稻肌动蛋白这样的基因启动子(McElroyetal.(1990)PlantCell2:163-171);遍在蛋白基因启动子(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)，包括TrpPro5启动子(美国专利申请N0.10/377,318;2005年3月16日提请)；pEMU启动子(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588);MAS启动子(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3:2723-2730);玉米H3组蛋白启动子(Lepetitetal.(1992)Mol.Gen.Genet.231:276_285和Atanassovaetal.(1992)PlantJ.2(3):291-300)；欧洲油菜(Brassicanapus)ALS3(PCT申请W097/41228)；以及各种农杆菌基因的启动子(见美国专利N0.4，771，002,5,102，796,5,182，200和5，428，147)。[0032]在另一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。常用的组织特异性启动子的列表可见于Mooreetal.(2006)PlantJ.45(4):651-683中的综述，该文献以其全部内容并入本文作参考。[0033]这种构建体通常也含有5'和3'非翻译区。这种构建体可含有“信号序列”或者“前导序列”以促进感兴趣的肽的共翻译或者翻译后转运至一定的胞内结构如叶绿体(或者其它质体)、内质网或者高尔基体或者被分泌。例如，基因可以被工程化为含有信号肽以促进肽转移进内质网中。“信号序列”是指已知或者推测导致共翻译或翻译后的肽转运穿过细胞膜的序列。在真核细胞中，这典型包括分泌进高尔基体中，一些导致糖基化。“前导序列”是指这样的任何序列，当其被翻译时导致氨基酸序列足以触发肽链共翻译转运至亚细胞细胞器。因此，其包括通过进入内质网、进入液泡、质体包括叶绿体、线粒体等而靶向转运和/或糖基化的前导序列。。也可以优选工程化植物表达盒使其含有内含子，由此内含子的mRNA加工为表达所需。[0034]“3'非翻译区”是指位于编码序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信号序列及编码能影响mRNA前体3'末端添加聚腺苷酸段(tracts)的调节信号的其它序列是3'非翻译区。“5,非翻译区”是指位于编码序列上游的核苷酸序列。[0035]其它上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是增强启动子区域表达的核苷酸序列。增强子为本领域所熟知，包括但不限于SV40增强子区域和35S增强子元件。[0036]终止区与转录起始区可以是天然的，可以与本发明的氮调节序列是天然的，或者可以衍生自另一来源。实用的终止区可得自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的T1-质粒,如章鱼碱合酶及胭脂氨酸合成酶终止区，或者马铃薯蛋白酶抑制剂II序列(PinlI)，如Liuetal.(2004)ActaBiochimBiophysSin36(8):553-558所述。也见于Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroeetal.(1990)Gene91:151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903；以及Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639。[0037]在适当情况下，可以优`化基因以增加在转化的宿主细胞中的表达。也就是说，基因可以通过使用改良表达的宿主细胞优选密码子合成，或者可以通过使用宿主优选的密码子使用频率的密码子合成。通常基因的GC含量将增加。见例如CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92:1-11论述的宿主优选的密码子使用。本领域已知合成宿主优选的基因的方法。见例如美国专利N0.6，320，100,6,075，185,5,380，831和5，436，391，美国公布的申请N0.20040005600和20010003849，以及Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498，所述文献在此并入本文作参考。[0038]在一个实施方案中，感兴趣的核酸靶向叶绿体以表达。在这种方式中，在感兴趣的核酸未直接插入叶绿体中时，表达盒将另外含有编码转运肽的核酸以指导感兴趣的基因产物到达叶绿体。这种转运肽为本领域所已知。见例如VonHeijneetal.(1991)PlantMol.Biol.Rep.9:104-126；Clarketal.(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiol.84:965-968；Romeretal.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；以及Shahetal.(1986)Science233:478-481所述。[0039]被靶向于叶绿体的感兴趣的核酸可以优化为在叶绿体中表达，以解决在植物细胞核与该细胞器之间密码子使用中的差异。在这种方式中，感兴趣的核酸可以通过使用叶绿体优选密码子合成。见例如在此并入作参考的美国专利N0.5，380，831所述。[0040]典型地，这种“植物表达盒”被插入“植物转化载体”中。“转化载体”是指细胞有效转化必需的DNA分子。这种分子可以由一或多个表达盒组成，且可以组织成一个以上的“载体”DNA分子。例如二元载体是这样的植物转化载体，其利用两个非邻近的DNA载体编码植物细胞转化所有必需的顺式和反式作用功能(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience5:446-451)。“载体”是指设计为在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指在外源细胞中具有掺入、整合及表达异源DNA序列或片段能力的载体。[0041]这种植物转化载体可以包含为实现植物转化所需的一或多个DNA载体。例如，本领域通常利用包含一个以上连续DNA节段的植物转化载体。本领域通常将这些载体称作“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA节段的大小和复杂性非常大，且有利于区别各个DNA分子的功能。二元载体典型含有质粒载体，其含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(如左边界和右边界)、被工程化能在植物细胞中表达的选择标记，以及“感兴趣的核苷酸序列”(被工程化能在希望产生转基因植物的植物细胞中表达的核苷酸序列)。在这个质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列的排列方式是使得有效转移进植物细胞中并且在其中表达。例如，选择标记基因和感兴趣的基因位于左边界与右边界之间。通常第二个质粒载体含有反式作用因子，其介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞。如本领域所已知，这个质粒通常含有毒力功能(Vir基因)，使得农杆菌感染植物细胞，并且通过在边界序列裂解以及vir-介导的DNA转移而转移DNA(HellensandMulIineaux(2000)TrendsinPlantScience,5:446-451)。一些类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。第二个质粒载体对于通过其它方法例如是显微轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇法等转化植物不是必需的。[0042]可用于本发明构建体中的改变或改良的变体[0043]可用于本发明中的`核苷酸序列和氨基酸序列可以通过各种方法改变，而且这些改变可产生编码蛋白质的序列，所述蛋白质与由本文揭示的氮调节序列编码的蛋白质具有不同的氨基酸序列。[0044]可用于本发明的核苷酸序列包括SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36和38所示序列，以及其变体、片段和互补序列。如本文所用，术语“核苷酸序列”或者“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或者基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链分子但优选是双链DNA。“互补序列”是指与指定核苷酸序列充分互补的核苷酸序列，由此其可以与指定核苷酸序列杂交，从而形成稳定双链体。由这些核苷酸序列编码的氮调节蛋白质的相应氨基酸序列示于SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37和39，以及其变体和片段。本发明还包含如下核酸分子的应用，所述核酸分子包含编码部分长度的氮调节蛋白质的核苷酸序列及其互补序列。[0045]是这些氮调节核苷酸序列的片段的核酸分子也可用于本发明。“片段”是指编码氮调节蛋白质的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码氮调节蛋白质的生物学活性部分，或者其可以是在下文所述方法中可用作杂交探针或PCR引物的片段。是氮调节核苷酸序列的片段的核酸分子根据指定用途包含本文揭示的全长氮调节核苷酸序列的至少大约15、20、50、75、100、200、300、350或者至少大约400个连续的核苷酸或者直至全长序列核苷酸。“连续”核苷酸是指彼此紧密相邻的核苷酸残基。[0046]是这些氮调节多肽的片段的多肽也可用于本发明中。“片段”是指编码SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示氮调节蛋白质的氨基酸序列的一部分，且其保留氮利用效率。氮调节蛋白质的生物学活性部分可以是这样的多肽，即例如长度为10、25、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400或更多个氨基酸。这种生物学活性部分可以通过重组技术制备，并评估其氮利用效率。如本文所用，片段包含SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示序列的至少8个连续氨基酸。然而，本发明也包含其它片段，如超过大约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸的任何蛋白质片段。[0047]本发明还包含变体核酸分子或者变体氨基酸序列在本发明的方法和组合物中的应用。氮调节核苷酸序列的“变体”包括那些序列，其编码本文揭示的氮调节蛋白质但是由于遗传密码的简并性而有所不同的序列，以及与上述序列基本相同的那些序列。天然发生的等位基因变体可以通过熟知的分子生物学技术鉴别，例如在下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括通过合成获得的核苷酸序列，其已经例如通过使用定点诱变技术产生但是其仍编码本发明揭示的氮调节蛋白质，如下文论述。可用于本发明中的变体蛋白质是生物学活性的，即其保留希望的天然蛋白质生物学活性，即氮利用效率和/或改良的逆境耐性。[0048]“变体”是指具有与SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示氨基酸序列具有至少大约60%、65%、大约70%、75%、80%、85%、或者90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%相同性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体还包括由在严格条件下与SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括由于诱变而导致氨基酸序列不同的多肽。本发明涵盖的变体蛋白质是生物学活性的，即其仍具有天然蛋白质的希望的生物学活性，即保留氮利用效率和/或改良的逆境耐性。[0049]可用于本发明中的优选的氮调节蛋白质由与SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示核苷酸序列基本相同的核苷酸序列编码。术语“基本相同的”是指利用本文描述的序列对比程序之一使用标准参数与参考序列相比具有至少大约60%或65%序列相同性、大约70%或75%序列相同性、大约80%或85%序列相同性、或者大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员意识到可以对这些值适当调节以通过考虑到密码子简并性、氨基酸相似性、读框位置等因素确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应相同性。[0050]为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸的相同性百分比，对序列进行排列以进行最佳对比。两个序列之间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置数的函数(即相同性百分比=相同位置数/总位置数(例如重叠位置)X100)。在一个实施方案中，两个序列是相同长度的。两个序列之间的相同性百分比可以使用与下文描述的那些相似的技术确定，允许或不允许缺口。在计算相同性百分比时，典型计算精确匹配。[0051]两个序列之间的相同性百分比的确定可以使用数学算法完成。用于对比两个序列的数学算法的非限制性例子是KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264中描述的算法，由KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877加以修改。将这种算法与Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403所述的BLASTN和BLASTX程序组合。BLAST核苷酸检索可以利用BLASTN程序进行，score=100、wordlength=12,以获得与本发明氮调节核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以利用BLASTX程序进行，score=50、wordlength=3,以获得与本发明氮调节蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口对比以进行对比，可以利用Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389所述的GappedBLAST。或者，可以使用PS1-Blast进行重复检索，检测分子之间的距离关系。见Akschuletal.(1997)Supra0当利用BLAST、GappedBLAST和PS1-Blast程序时，可以使用各自程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。见WWW.ncb1.nlm.nih.gov。用于序列对比的另一个数学算法的非限制性例子是ClustalW算法(Higginsetal.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW对比序列并排列对比了完整氨基酸或DNA序列，因此可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性数据。ClustalW算法用于一些可商购的DNA/氨基酸分析软件包中，例如theVectorNTIProgramSuite的ALIGNX模块(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。在利用ClustalW进行氨基酸序列排列对比之后，可以确定氨基酸相同性百分比。用于分析ClustalW序列对比的一个非限制性软件程序例子是GENED0C?。GENED0C?(KarlNicholas)可以评定多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和相同性。用于序列对比的数学算法的另一个非限制性例子是MyersandMiller(1988)CAB10S4所述算法。将这个算法与ALIGN程序(2.0版)组合，后者是GCG序列对比软件包(得自Accelrys,Inc.,9865ScrantonRd.，SanDiego,California,USA)的一部分。当利用ALIGN程序对比氨基酸序列时，可以使用PAMl20权重残基表(weightresiduetable)、缺口长度罚分为12以及缺口罚分为4。[0052]优选的程序是GAPversionlO,其使用NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453所述算法。GAPVersionlO可以使用如下参数:核苷酸序列的相同性百分比和相似性百分比使用GAPWeight为50和LengthWeight为3,以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的相同性百分比和相似性百分比使用GAPWeight为8和LengthWeight为2，以及BL0SUM62评分矩阵。也可以使用等价程序。“等价程序”是指这样的任何序列对比程序，其对于质询的两个序列`而言，当与通过GAPVersionlO产生的相应序列排列对比结果进行对比时，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列相同性百分比的序列对比结果。[0053]技术人员会进一步意识到在本发明的核苷酸序列中可以通过突变导入变化，从而导致编码的氮调节蛋白质的氨基酸序列变化，而不改变所述蛋白质的生物学活性。因此，变体分离的核酸分子可以通过在本文揭示的相应核苷酸序列中导入一或多个取代、添加或者缺失而产生，由此在编码的蛋白质中导入一或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术导入突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。这种变体核苷酸序列也包含在本发明中。[0054]例如，保守氨基酸取代可以在一或多个预定的、优选非必需氨基酸残基进行。“非必需”氨基酸残基是在氮调节蛋白质的野生型序列中可以被改变但是不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是为生物活性所必需的残基。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，无电荷极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保留功能的氨基酸取代可以在非保守区域进行。通常这种取代不是针对保守氨基酸残基或者保守基序中的氨基酸残基进行，这种残基是蛋白质活性必需的。然而本领域技术人员理解功能变体在保守残基中可具有少量保守或非保守的改变。保守的且为蛋白质活性必需的残基的例子包括例如在已知参与氮同化作用的相似或相关序列的对比中包含的在所有蛋白质之间均相同的残基。保守的但是可允许保守氨基酸取代且仍保留活性的残基的例子包括例如在已知参与氮同化作用的相似或相关序列的对比中包含的在所有蛋白质之间仅具有保守取代的残基。[0055]或者，变体核苷酸序列可以通过沿着所有或部分编码序列随机导入突变例如通过饱和诱变而产生，对所得突变体筛选赋予氮利用效率的能力以鉴别保留活性的突变体。在诱变之后，编码的蛋白质可以重组表达，蛋白质的活性可以通过使用标准测定技术确定。[0056]使用例如PCR、杂交等方法可以鉴别相应的氮调节序列，这种序列与本发明的序列基本相同。见例如SambrookJ.,andRussell,D.w.(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)以及Innis,etal.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY)。在杂交方法中，所有或部分氮调节核苷酸序列可用于筛选cDNA或基因组文库。构建这种cDNA和基因组文库的方法为本领域所已知,在SambrookandRussell,2001,supra中揭示。[0057]本发明的核苷酸或氨基酸序列的变体或片段通常编码保留全长氮调节蛋白质的生物学活性(即保留氮利用效率)的蛋白质片段。“保留氮利用效率”是指所述变体或片段具有SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示全长氮调节蛋白质或者SEQIDNO:`2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36、或38所示全长氮调节核苷酸序列的至少大约30%、至少大约50%、至少大约70%或者至少大约80%的氮利用效率和/或逆境耐性。监测氮利用效率的方法包括检测同化途径中任何主要氮代谢库大小的变化(例如硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的总蛋白质含量、植物部分的总氮含量和/或叶绿素含量中可测量的变化)或者检测与不含有或者不表达本发明的氮调节序列的植物相比，植物以较低的氮肥水平提供相同或增加的产量的能力或者植物在相同氮肥水平提供增加的产量的能力。“相同”或“较低”氮肥水平是指通常应用于不表达本发明的氮调节序列的植物的氮的水平。本领域已知大多数(如果不是所有)感兴趣的植物品种的足够的氮水平。其它指导可见于例如Hewitt(1966)SandandWaterCultureMethodsUsedintheStudyofPlantNutrition,2nded.,FamhamRoyal(Bucks),CommonwealthAgriculturalBureaux;以及Hewitt(1975)PlantMineralNutrition,London,EnglishUniversityPress。[0058]可用于本发明中的多肽序列可以通过各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这种处理方法为本领域所已知。例如，本文揭示的氮调节蛋白质的氨基酸序列变体可以通过核苷酸序列中的突变而制备。这也可以通过各种形式的诱变和/或定向进化中的一种实现。在一些情况中，氨基酸序列中编码的改变基本上不影响蛋白质的功能。这种变体具有希望的氮利用效率。然而，本发明的氮调节序列改变或改良氮利用的能力可以通过使用这种技术之一在本发明组合物上进一步改良。例如，可以在DNA复制期间呈现高比率碱基错掺入的宿主细胞例如XL-1Red(Stratagene，LaJolla,CA)中表达本文揭示的核苷酸序列。在这种菌株增殖之后，可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA或者通过PCR扩增以及将所得PCR片段克隆进载体中)，如本文在别处所述将DNA转化进植物中并测量氮利用效率。[0059]或者，可以在氨基或羧基末端对许多蛋白质的蛋白质序列进行改变而基本不影响其活性。这可包括通过现代分子学方法导入的插入、缺失或者改变，所述分子学方法例如为PCR,包括依靠在PCR扩增中使用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列而改变或延伸蛋白质编码序列的PCR扩增。或者，加入的蛋白质序列可包括完整的蛋白质编码序列，如本领域常用于产生融合蛋白的那些序列。这种融合蛋白通常用于(I)增加感兴趣的蛋白质的表达，(2)导入结合结构域、酶活性或者表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或者本领域已知的其它实验性应用，或者(3)使蛋白质靶向亚细胞细胞器分泌或翻译，例如靶向革兰氏阴性细菌的周质空间或者真核细胞的内质网，后者通常导致蛋白质糖基化。[0060]本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包含衍生自诱变和重组程序如DNA改组的序列。使用这种程序，一或多个不同的氮调节蛋白质编码区可用于产生具有希望性质的新的氮调节蛋白质。以这种方式，从包含具有充分的序列相同性且可以在体外或体内同源重组的序列区域的一群相关序列多核苷酸中产生重组多核苷酸文库。例如，使用这种方法，编码感兴趣的结构域的序列基序在用于本发明中的氮调节序列与其它已知的氮调节序列之间可以改组以获得编码具有改良的感兴趣的性质如改良的氮利用的蛋白质的新序列。本领域已知这种DNA改组的方法。见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751,Stemmer(1994)Nature370:389-391,Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15:436_438、Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272:336_347、Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509>Cramerietal.(1998)Nature391:288-291以及美国专利N0.5，605，793和5，837，458所述。[0061]棺物转化[0062]本发明的方法包括在植物中导入一或多个氮调节核苷酸序列。在一些实施方案中，仅一个本发明揭示的氮调节序列被导入植物中。在其它实施方案中，导入至少2个、至少3个、至少4个或者更多个所述序列。在导入多个序列的情况中，每个核苷酸序列均不相同。如果两个核苷酸序列在至少一个核苷酸位置不同则认为这两个序列是不相同的。因此，不相同的核苷酸序列包括编码相同氨基酸序列的两或多个不同的核苷酸序列(例如已经优化以在植物中表达的一或多个)以及编码至少两个不同氨基酸序列的两或多个不同的核苷酸序列。[0063]“导入”是指为植物提供包含一或多个氮调节序列的一或多个构建体，由此所述构建体得以进入植物细胞的内部。本发明的方法不需要使用将核苷酸构建体导入植物的特殊方法，仅是所述核苷酸构建体得以进入至少一个植物细胞的内部即可。将核苷酸构建体导入植物中的方法为本领域所已知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法以及病毒介导的方法。[0064]通常植物转化方法包括将异源DNA转移进靶植物细胞(例如不成熟或成熟胚，悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，随后应用最大阈值水平的合适选择(依赖于选择标记基因)从未转化的一组细胞中回收转化的植物细胞。典型将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并常规培养。随后，转化的细胞在被置于补加了最大阈值水平选择剂(即抗生素，如壮观霉素和卡那霉素)的再生培养基中之后分化为芽(shoot)。然后将芽转移至选择性生根培养基中以回收生根的芽或小植物。随后使该转基因小植物生长为成熟植物并产生能育种子(例如Hieietal.(1994)ThePlantJournal6=271-282；Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnologyl4:745-750所述)。将外植体转移至新鲜供应的相同培养基中并常规培养。关于产生转基因植物的技术和方法的一般描述见AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantSciencel3:219-239和BommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120所述。由于转化的材料含有许多细胞，因此转化和未转化的细胞均存在于任何选定的靶愈伤组织或组织或细胞中。杀死未转化的细胞并且使得转化的细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。通常除去未转化的细胞的能力是对快速回收转化的植物细胞以及成功产生转基因植物的一个限制。然后可以使用分子和生物化学方法证实转基因植物的基因组中整合的感兴趣的异源基因的存在。[0065]转基因植物的产生可以通过许多方法进行，所述方法包括但不限于通过农杆菌在植物细胞中导入异源DNA(农杆菌介导的转化)、用与粒子附着的异源外源DNA轰击植物细胞以及各种其它非粒子直接介导的方法(例如Hieietal.(1994)ThePlantJournal6:271-282；Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnologyl4:745-750；AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantSciencel3:219-239；RommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120所述)转移DNA。[0066]转化叶绿体的方法为本领域所已知。见例如Svabetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:8526-8530；SvabandMaliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:913-917；SvabandMaliga(1993)EMBOJ12:601-606所述。所述方法依赖于基因枪输送含有选择标记的DNA并且通过同源重组使得所述DNA靶向于质体基因组。此外，质体转化可以通过核编码的及质体指导的RNA聚合酶的组织优选表达反式激活沉默的质体携带转基因而实现。这种系统已经在Mcfcideetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7301-7305中报道。[0067]细菌细胞的转化是通过本领域已知的一些技术实现的，所述技术包括但不限于电穿孔或者化学转化(见例如Ausubel,ed.(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.，Indianapolis,IN所述)。赋予对毒性物质抗性的标记可用于从未转化的细胞(不含有或者不表达检测DNA的那些细胞)中鉴别转化的细胞(含有及表达检测DNA的细胞)。[0068]在本发明的一个方面中，本发明的核苷酸序列可用作标记以评定细菌或植物细胞的转化。在这种方式中，转化是通过如上述监测氮利用效率评定。[0069]植物细胞的转化可以通过相似方式实现。“植物”是指完整植物或者植物的组成部分包括植物器官(例如叶、茎干、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚和后代。植物细胞可以是分化的或者未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物”或者“转化的植物”或者“稳定转化的”植物或者细胞或者组织是指在植物细胞中已经掺入或者整合了外源核酸序列或者DNA片段的植物。“稳定转化”是指导入植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中且能被植物后代遗传。[0070]已经转化的细胞可以根据常规方式生长为植物。见例如McCormicketal.(1986)PlantCellR印orts5:81-84所述。然后使这些植物生长，并且用相同的转化植株或者不同的植株授粉，鉴别组成型表达希望的表型特征的所得杂交体。生长两或多个世代以保证希望的表型特征的表达得以稳定保持和遗传，然后收获种子以保证希望的表型特征的表达已经实现。以这种方式，本发明提供了在其基因组中稳定掺入本发明的核苷酸构建体例如本发明的表达盒的转化的种子(也称作“转基因种子”)。[0071]通过调节氮利用增加植物产暈的方法[0072]本发明提供了增加植物产量的方法。所述方法包括将本发明揭示的氮调节核苷酸序列导入植物或者植物细胞中，由此氮利用效率的增加相应于植物产量的增加。如本文所定义，植物的“产量”是指由植物产生的生物量的质量和/或数量。“生物量”是指任何测量的植物产物(例如植物的任何组成部分，如种子、茎、根、谷粒、叶等)。生物量生产中的增加是测量的植物产物的产量的任何改良。植物产量增加具有一些商业用途。例如，植物叶生物量的增加可增加为人和动物消费的叶类植物的产量。此外，叶生物量的增加可用于增加产生得自植物的药物或工业产品。产量的增加可包括具有任何统计学意义的增加，包括但不限于与其中未导入本发明的调节氮利用的核苷酸序列的植物的产量相比，所述植物的产量增加至少1%、至少3%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更高。[0073]植盤[0074]本发明可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的例子包括但不限于玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔属植物(Brassicasp.)、苜蓿、黑麦、小米、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、坚果、杏、燕麦、蔬菜、草(例如饲草、草坪草或牧草)、观赏植物、果树以及针叶树。[0075]蔬菜包括但不限于洋葱、番茄、莴苣、绿豆、利马豆、豌豆，以及Curcumis属成员如黄瓜、甜瓜和香瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、绣球花属植物、芙蓉属植物、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选本发明的植物是农作物(例如玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。[0076]本发明特别适合单子叶植物家族的任何成员，包括但不限于玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、薯蓣、洋葱、香蕉、椰子和椰枣(date)。[0077]植物转化的评估[0078]在将异源外源DNA导入植物细胞中之后，异源基因在植物基因组中的转化或整合可通过各种方法证实，例如分析与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢物。[0079]PCR分析是在植入土壤之前的早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中掺入的核昔酸序列存在的一种快速方法(SambrookandRussell(2001)MolecularCloning.:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY)。使用特异于感兴趣的基因或者农杆菌载体背景等的寡核苷酸引物进行PCR。[0080]植物转化可以通过基因组DNA的Southern印迹分析证实(SambrookandRussell,2001,supra)。通常从转化体中提取总DNA,用合适的限制酶消化,在琼脂糖凝胶中分级分离并转移至硝化纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术将该膜或“印迹”用例如放射标记的32P靶DNA片段探查以证实植物基因组中导入的基因的整合(SambrookandRussell,2001,supra)。[0081]在Northern分析中，根据本领域常用的标准方法从转化体的特定组织中分离RNA,将其在甲醒琼脂糖凝胶中分级分离，印迹于尼龙滤膜上(SambrookandRussell,2001，supra)。然后根据本领域已知方法通过将所述滤膜与衍生自本发明多核苷酸的放射性探针杂交以检测由本发明的核苷酸序列编码的RNA的表达(SambrookandRussell,2001,supra)。[0082]可以对所述转基因植物进行Western印迹和生物化学测定以确定由氮调苄基因编码的蛋白质的存在情况，这通过标准方法(SambrookandRussell,2001,supra)使用结合所述氮调节蛋白质上存在的一或多个表位的抗体进行。例如，通过本发明的方法产生的多克隆抗体可用于检测氮调节蛋白质的存在。[0083]技述[0084]本发明还包含用于本发明中的多肽或者其变体或片段的抗体。产生抗体的方法为本领域所熟知(见例如HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.;美国专利N0.4,196，265所述)。[0085]实验[0086]材料和方法[0087]这个计划的大多数起始遗传材料以玉米表达序列标签或“EST”形式提供，得自鉴别应答氮而被上调或下调的潜在基因的微阵列实验。所述微阵列实验鉴别了可能用于转化的几百个候选物。虽然这些序列能预测应答氮波动的基因转录，但是它们未提供对于应答氮水平而被调节的基因或者调节氮水平的基因的明确鉴别。基于基因组选择标准筛选来自微阵列实验的候选EST以分析并确定少量优选候选物随后用于如本说明书描述的转基因表达中。首先检验进入这个计划的所有EST序列(即“计划基因(piOjectgene)”)以鉴别可以编码应答植物氮水平的蛋白质的开放读框。在EST中典型存在多个开放读框。最后，基于多重标准选择各个计划基因，所述标准包括开放读框的大小，其中优先选择较长的开放读框，并推测翻译的基因的功能，其中各个开放读框被翻译，然后进行BLAST搜索以鉴别蛋白质同源物。在鉴别同源物的情况中，我们推断所述基因很可能编码具有相似功能的蛋白质。这个信息用于评定基因是否编码与植物中氮同化作用相关的蛋白质功能。[0088]通过这种选择方法，从每个EST中选择个体基因靶。选自每个EST的完整基因序列在下文实施例中揭示。EST序列之一(N-EST77-A01)用作进入计划的两个不同基因(N-EST77A和N-EST77B)以及一个其它EST(ESTN-EST76-H12)的来源。我们发现可以对EST进行修饰以产生比未修饰的EST中存在的开放读框长的开放读框。概括而言，三个开放读框组合产生一个较长的基因(N-EST76A)。[0089]在一些情况中，由微阵列实验提供的DNA样品用作所有随后的DNA克隆步骤的原材料。在EST样品不合适的情况中，产生合成序列。N-EST76b基因是购自BlueHeronBiotechnology,Inc.(Bothell,WA)的合成基因。每个EST以及每个合成基因的基因序列通过DNA测序证实，之后亚克隆每个基因以进行蛋白质过表达。[0090]蛋白质i寸表汰和钝化[0091]将针对计划选择的每个基因均亚克隆进促进蛋白质在大肠杆菌(E.coli)中过表达的表达载体中。进行蛋白质过表达以使得各个蛋白质得以纯化。纯化的蛋白质可用于在一对兔中产生每种蛋白质的多克隆抗体。最后，所述多克隆抗体可用于检测转基因植物中靶蛋白质的存在。[0092]使用本领域已知的方法，将每个计划基因均亚克隆进大肠杆菌表达载体pRSFlb(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)中。所得克隆通过DNA测序证实并用于诱导每种蛋白质在大肠杆菌中的表达。然后如本领域所已知的那样使用钴亲和树脂(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA)纯化表达的His标记的蛋白质。[0093]棺物转化[0094]将各自的计划基因亚克隆进载体中以进行玉米的农杆菌介导的转化。在载体构建和农杆菌转化之后，通过本领域已知的Southern印迹方法证实载体。然后使通过这些检测的阳性农杆菌菌株在固体培养基上生长，产生细胞计数以进行大规模转化实验。[0095]如下实验描述了植物载体构建与植物转化的方法。[0096]进行植物转化的载体的构建[0097]通过PCR从玉米EST序列或者合成基因中扩增每个计划基因的开放读框(ORF)。在PCR期间在ORF的每个末端加入限制位点(例如BamHI和AscI)。此外，在基因的起始密码子的立即5’加入核苷酸序列ACC以增加翻译效率(Kozak(1987)NucleicAcidsResearchl5:8125-8148Joshi(`1987)NucleicAcidsResearchl5:6643-6653)。将PCR产物亚克隆进中间载体(例如pRSF-lb)中并使用本领域熟知的技术测序以保证在PCR期间未导入突变。含有计划基因的质粒用例如BamHI和PstI消化并分离和纯化含有完整ORF的片段。[0098]然后将含有计划ORF的纯化的DNA片段亚克隆进质粒如pSBll(Japantobacco,Inc.)中，例如在BamHI和PstI位点以完成植物表达载体。所述植物表达载体含有例如磨擦草属(Tripsacum)遍在蛋白启动子、TripPro5启动子(2006年3月16日申请的美国专利申请系列N0.11/377，318，在此并入本文作参考)以及PinII终止子(Anetal.(1989)ThePlantCelll:115-122)形成最终的质粒，在此称作pSBll-lA。pSBll-?Α是这样组成的，即含有例如启动子-NUE基因-终止子构建体的DNA片段可以由适当的限制酶切割并且也用于例如通过气雾束注射(aerosolbeaminjection)转化进植物中。pSBll-?Α的结构通过限制消化和凝胶电泳以及通过对各种克隆连接处进行测序而证实。[0099]使用本领域熟知的三亲株杂交(triparentalmating)方法将质粒转移至还携带质粒pSBl(Japantobacco,Inc.)的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404中，并且铺板于含有抗生素的培养基上。质粒pSBll-?Α携带壮观霉素抗性但是是窄谱宿主范围的质粒且不能在农杆菌中复制。当通过同源重组将pSBll-?Α整合进广谱宿主范围的质粒pSBl中时产生抗生素抗性集落。所得共合体产物通过Southern杂交证实。携带该共合体的农杆菌菌株可用于转化植物，例如通过PureIntro方法(Japantobacco,Inc.)转化。通过农杆菌介导的转化方法转化植物[0100]在授粉8-12天后收集耳穗(ear)。从耳穗中分离胚，并将大小为0.8-1.5mm的那些胚用于转化。将胚盾片侧向上铺板于合适的保温培养基中，在25°C于黑暗中保温过夜。然而，非必须将所述胚保温过夜。将胚与含有适合Ti质粒介导的转移的载体的农杆菌菌株接触5-10分钟，然后铺板于共培养基上培养3天(于黑暗中25°C)。在共培养之后，将外植体转移至恢复期培养基(recoveryperiodmedia)中培养5天(于黑暗中25°C)。根据利用的特定选择方法的性质和特性将外植体在选择培养基中保温直至8周。在选择期之后，将所得愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直至观测到成熟体细胞胚形成。然后将所得成熟体细胞胚置于低光照条件下，开始本领域已知的再生过程。使所得芽在生根培养基上生根，并将所得植物转移至培育罐(nurserypot)中并且使其增殖为转基因植物。此时，分离叶样品并且通过PCR证实感兴趣基因的存在。[0101]以此方式产生的所有植物均生长至结种并与分离自H1-1I植物(1waStateUniversity,Ames,1wa)的花粉杂交。受精的植物生长直至成熟。从各个植物中收获成熟种子并且如果需要则保存以在Tl代进行进一步检测。[0102]转基因植物中的蛋白质表达[0103]代表性的转基因玉米转化事件(transgenicmaizeevent)中的蛋白质表达通过Western印迹评估。简言之，在温室中生长4周后取叶样品并立即在干冰上冷冻。提取总蛋白质(P-PER植物蛋白质提取试剂盒，Pierce),通过Bradford测定法确定蛋白质浓度。将各个植物蛋白质样品通过电泳分离，转移至硝化纤维素上，使用本领域已知的方法将固定的蛋白质与兔多克隆抗血清接触。利用ECLPlusWestern印迹检测系统(GEHealthcareBio-SciencesCorp.,Piscataway,NJ)观测结合的抗体复合物。_4]氮测定方法[0105]在氮测定的准备`中，从组织培养转移至温室2或4周后(对于Tl植物为发芽后4周)的植物中切下叶。将该材料在干冰上速冻，在加工之前于_80°C贮存。[0106]硝酸盐[0107]将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶组织在存在新鲜MilliQ水的条件下使用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不锈钢珠研磨。将研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤并注射进AgilentllOOHPLC中，以1.8mM碳酸钠和1.7mM碳酸氢钠的混合物的流动相以1.5ml/分钟运行。使用配有保护柱的1nPacAS9-SC离子层析柱分离离子。以再循环模式使用具有自生式抑制器(self-regeneratingsuppressor)的阴离子自抑制电导率(anionauto-suppressedconductivity)进行分析。将样品与每个样品运行中包含的内部标准对比。[0108]铵[0109]将50mg叶材料(鲜重，无中脉)在存在60%甲醇的条件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不锈钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤并注射进配有3.3m、63°C不锈钢线圈和冷却的自动取样器的AgilentllOOHPLC中。流动相含有3mM邻苯二醛(OPA)、10πιΜβ-巯基乙醇和IOOmM磷酸盐缓冲液(ρΗ6.8)，以0.4ml/分钟运行。荧光(激发410nm,发射470nm)和二极管阵列检测(410nm)用于量化叶提取物中的铵。每个运行中均包含内部铵标准以进行对比。[0110]通过HPLC分析氨基酸[0111]将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶组织在存在新鲜MilliQ水的条件下用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不锈钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤并注射进AgilentllOOHPLC中，使用配有保护柱的ZorbaxEclipseAAA、4.6X75mm反相柱。冷却的自动取样器用于混合叶提取物与400mM硼酸盐缓冲液(ρΗΙΟ.2)、在甲醇中的I%邻苯二醛/I%3-巯基丙酸，然后在注射之前将其用水稀释。注射程序的详细描述如下:将0.5μI样品加入2.5μI硼酸盐缓冲液中，以最大速度混合两次。在保持0.5分钟后，将针置于水中以从针尖除去残余物，然后加入0.5μIOPA溶液。将此组合的3.5μI溶液以最大速度混合六次。将针再次置于水中漂洗针尖，然后置于含有新鲜水的小瓶中。接着向样品混合物中加入32μIMilliQ水，并将18μI以最大速度混合两次。然后将样品溶液注射进HPLC中，在5分钟内泵运行2ml/min流动相的具有0-26%乙腈/甲醇/水(45:45:10)(B)梯度的40mMNa2HP04(pH7.8)(A)，随后是2分钟的100%保持B，然后是2分钟的100%A0天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的量化通过二极管阵列检测法(328-348nm)和荧光检测法(激发340nm，发射450nm)进行。将样品与每个样品运行中包含的天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的内部标准对比。[0112]总氨基酸[0113]将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶组织在存在新鲜MilliQ水的条件下使用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不锈钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤。叶提取物在水中稀释，加入茚三酮试剂溶液(在DMSO和乙酸锂缓冲液中的茚三酮和还原茚三酮，pH5.2)。然后将样品用厚箔带密封，在90°C加热10分钟，精确冷却2分钟，在590nm在分光光度计中读数。将数值与每个样品分析期间包含的内部标准对比。[0114]总蛋白质[0115]将50mg叶材料(鲜重，无中脉)冻干以进行干重测定。然后将脱水的叶组织在存在新鲜MilliQ水的条件下使用MiniBeadbeater-96?和2.3mm不锈钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过0.45μm聚偏氟乙烯(PVDF)滤膜过滤。向在水中稀释的叶样品中加入Bio-Rad蛋白质染料，进行Bradford蛋白质测定,在595nm在分光光度计中读数,并且与测定中包含的内部蛋白质标准对比。叶绿素[0116]将50mg叶材料(鲜重，无中脉)在存在60%甲醇的条件下使用MiniBeadbeater_96TM和2.3mm不镑钢珠研磨。将经研磨的叶组织通过1.0μmA/B玻璃纤维滤膜过滤，将100μI提取物置于Corning3370平底微量培养板中，在分光光度计中读数，空白孔含等体积的60%甲醇。使用SofiMaxPro软件将光路长换成lem。使用Porra,R.J.PhotosynthesisResearch,73:149-156,2002所述等式计算叶绿素含量。[0117]实施例1:候诜EST的鉴别[0118]每个候选氮调苄基因的核苷酸序列信息在申请人:爱荷华州立大学Dr.PatSchnable指导下进行的差别氮微阵列实验中产生。这个微阵列实验用做初始筛选以选择与氮条件也许相关的EST亚群(sub-set)。[0119]从在微阵列中示出一些差异的大量EST序列中(具有3’和5’数据的136个序列)在生物信息学分析之后进一步选择。这个分析包括核查InternationalNucleotideSequence数据库(位于NCBI)中的核苷酸序列相似性，核查蛋白质数据库如NCBI和Swisspro中预测的蛋白质相似性，研究关于已知或预测功能的信息以及核查专利局的核苷酸和蛋白质数据库。使用这些分析结果以及支持性关键信息选择EST亚群在玉米中进行与氮利用效率相关的转基因过表达。对于每个EST序列，鉴别了开放读框并翻译为氨基酸序列。候选的氮调节序列列于表1中。[0120]在植物中过表达氮调节序列的载体构建[0121]随后将每个候选氮调节EST的开放读框导入植物表达载体中。使用本领域熟知的方法，应用两个不同的选择标记系统，使得可以在存在选择剂的条件下选择转化的植物。[0122]用氮调苄基因转化玉米[0123]所述植物载体可用于植物转化实验，通过使用上述方法将氮调苄基因导入玉米基因组中。[0124]表1:氮调节序列[0125]【权利要求】1.一种调节植物中氮利用的方法，其中所述植物为玉米，包括:a)用包含分离的核酸分子的表达载体转化植物细胞，其中所述分离的核酸分子包含编码与SEQIDNO:30所示的序列具有至少95%相同性的氨基酸序列的核苷酸序列；b)在所述植物细胞中表达所述核酸分子；c)从所述植物细胞生成过表达所述核苷酸序列的转化的植物；及d)从多个所述转化的植物选择与相同条件下生长的对照植物相比氮利用被调节了的植物。2.权利要求1的方法，所述表达载体还包含5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA启动子序列以及终止子序列可操纵地连接以允许所述核苷酸序列的转录。3.权利要求2的方法，其中所述启动子序列选自组成型植物启动子和组织特异性启动子。4.一种调节植物中氮利用的方法，其中所述植物为玉米，包括:a)用包含分离的核酸分子的表达载体转化植物细胞，其中所述分离的核酸分子包含编码SEQIDNO:31所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)在所述植物细胞中表达所述核酸分子；c)从所述植物细胞生成过表达所述核苷酸序列的转化的植物；及d)从多个所述转化的植物选择与相同条件下生长的对照植物相比氮利用被调节了的植物。【文档编号】C12N15/84GK103773800SQ201410058569【公开日】2014年5月7日申请日期:2007年10月27日优先权日:2006年10月27日【发明者】J·麦克拉伦,N·杜克,B·范德贝格,A·沙瓦尔德尔,V·贝林松,J·辛森申请人:爱荷华谷类推广协会