一种利用固定化酶提取肝素钠的方法
【专利摘要】本发明提供一种利用固定化酶提取肝素钠的方法，包括如下步骤：先将蛋白酶在pH为7.5-8.5磷酸盐缓冲液存在下加入二氧化硅吸附剂进行吸附处理，离心后得固定化酶沉淀物；将匀浆处理后的小肠黏膜在pH8-9硼酸缓冲液存在下采用所述固定化酶进行酶解处理，过滤，取滤液，所述滤液进行离心处理，分离得酶解液和沉淀物；最后对所述酶解液进行纯化处理。本发明由于在固定化酶处理中蛋白酶不参加化学反应，使蛋白酶整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。而且采用本发明酶解处理后，蛋白酶无需作为杂质去除，有效降低了粗品肝素钠中蛋白质的含量，从而提高了肝素钠的纯度。
【专利说明】一种利用固定化酶提取肝素钠的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用小肠酶解提取肝素钠的方法，具体地说，涉及一种利用固定化酶提取肝素钠的方法。
【背景技术】
[0002]目前肝素钠是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素钠除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素钠是由肝素钠原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用途，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。
[0003]肝素钠是世界上迄今为止已知的分子结构最复杂的化合物，短期内无法人工化学合成，目前只有来源于猪小肠粘膜的肝素钠能够用于临床治疗。肝素钠原料药的原料是肝素钠粗品，其提取多源自健康生猪的小肠粘膜(牛肺也可以)，由于含有大量杂质蛋白、杂质核酸、微生物等杂质，需经过物理和化学提取分离过程，定向获取天然结构基团完整的肝素钠，从而制成肝素钠原料药。肝素钠钠原料药是标准肝素钠制剂的唯一有效成分和低分子肝素钠原料的生产起点，目前肝素钠制剂只有按照注射给药方式用于临床，这使得肝素钠原料药需要有很高的纯度，方可保证制剂的用药安全。
[0004]肝素钠原料药主要从健康生猪小肠黏膜提取加工而成，多采用酶解、吸附、洗脱、沉淀等提取工序来进行肝素钠或肝素钠的制备。其中，酶解多以游离酶的方式进行，该方式酶活力不足，在溶液中发生自身降解作用，使反应难以控制，催化效率下降，不利于产物的提纯精制，影响肝素钠的提取。
【发明内容】
[0005]为了克服上述技术问题，本发明提供了一种利用固定化酶提取肝素钠的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明所述一种利用固定化酶提取肝素钠的方法，包括如下步骤:
[0007]I)制备固定化酶
[0008]先将蛋白酶在pH为7.5-8.5磷酸盐缓冲液存在下加入二氧化硅吸附剂进行吸附处理，离心后得固定化酶沉淀物；
[0009]2)采用固定化酶对小肠黏膜进行酶解
[0010]将匀浆处理后的小肠黏膜先在pH8-9硼酸缓冲液存在下采用所述固定化酶进行酶解处理，过滤，取滤液，所述滤液进行离心处理，分离得酶解液和沉淀物；
[0011]3)提纯处理
[0012]所述酶解液进行纯化处理。
[0013]其中，步骤I)中所述蛋白酶为胰蛋白酶、肝素钠酶或碱性蛋白酶。[0014]所述7.5-8.5磷酸盐缓冲液(PBS)的组分为:磷酸二氢钾的含量为5.9g/L_6.8g/L，氢氧化钠的含量为1.58g/L-l.71g/L，其余为水。
[0015]所述二氧化硅吸附剂为纳米二氧化硅，粒径20-300纳米。
[0016]所述蛋白酶与所述二氧化硅吸附剂的重量比为1:20-50，优选为1:20_30。
[0017]所述蛋白酶与磷酸盐缓冲液的量比为1:400-600 (g/ml)。
[0018]所述吸附处理是在常温下进行，搅拌处理2-6小时，搅拌速度200-500转/分钟。
[0019]所述离心的条件为:常温下4000-8000转/分钟离心处理5_15分钟。
[0020]步骤2)中所述匀浆处理是在常温下，将洗净的小肠黏膜于小肠黏膜的1-3倍重量的蒸馏水中，在6000-12000转/分钟下处理2-5分钟。
[0021]所述固定化酶与所述小肠黏膜的重量比为1:10_20。
[0022]所述硼酸缓冲液的组分为:硼砂含量为5.721-15.256g/L，硼酸含量为
2.474-8.659g/L，其余为水。
[0023]所述酶解的条件为20_60°C下酶解处理2-5小时。
[0024]所述滤液离心处理 条件为常温下以4000-8000转/分钟离心处理5_15分钟。
[0025]由于所述沉淀物中还含有部分固定化酶，从经济、有效利用资源等角度考虑，还可以将其用于小肠黏膜的酶解处理，最多不易超过3次；其加入量可采用:所述沉淀物与所述小肠黏膜的重量比为1:2_6。
[0026]步骤3)中所述纯化处理采用离子交换处理吸附、氯化钠解析、乙醇沉淀。
[0027]所述离子交换树脂可采用FPA98CL树脂、D201树脂、D207树脂、D217树脂或D301
树脂等。
[0028]本发明采用先对蛋白酶进行固定化处理，再对小肠黏膜进行酶解，以制备肝素钠产品；由于在固定化酶处理中蛋白酶不参加化学反应，使蛋白酶整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。
[0029]本发明采用固定化酶方法较现有游离酶方法具有可提高酶活，又可重复利用的优点。
[0030]而且采用本发明酶解处理后，蛋白酶无需作为杂质去除，有效降低了粗品肝素钠中蛋白质的含量，从而提高了肝素钠的纯度。
【具体实施方式】
[0031]下面说明本发明的实施例。在本发明的一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
[0032]下面对本发明做进一步描述。
[0033]实施例1
[0034]取胰蛋白酶0.2g，粒径300纳米二氧化硅5g，加pH为7.5的磷酸盐缓冲液(其配置采用:取磷酸二氢钾1.36克，加入0.lmol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml )100ml，常温下搅拌(磁力搅拌器、搅拌速度500转/分钟)吸附4小时，使胰蛋白酶与吸附剂重复接触，然后常温、5000转/分钟速度下进行离心机离心处理8分钟，弃去上清液，取沉淀(即固定化酶)20g备用。[0035]取猪小肠黏膜72克，匀浆(在常温下，将洗净的小肠黏膜于100ml蒸馏水中，10000转/分钟匀浆处理3分钟，离心，取沉淀)，于100ml、pH8.7硼酸缓冲液中(其配置采用:取
0.05mol/L (19.07g/L)硼砂溶液 60ml,0.2mol/L(12.37g/L)硼酸溶液 40ml 混合摇匀，即得)。
[0036]加入前述获得的固定化酶5克，在50°C下酶解3小时；采用滤纸抽滤，弃去滤渣，滤液在常温、5000转/分钟速度下离心机进行离心处理8分钟；离心所得沉淀(含有固定化酶的部分)可重新用于小肠粘膜酶解，最多不超过3次；离心所得上清液为酶解液70ml左右，用于后续纯化。
[0037]后续纯化过程:先采用pH9.0、FPA98CL树脂15克进行吸附处理4小时，然后过滤，取滤渣(吸附后的树脂)，再采用等体积的2mol/L氯化钠解吸12小时，最后用等倍体积的乙醇沉淀，得约0.1g肝素钠粗品。
[0038]实施例2
[0039]取胰蛋白酶0.2g，粒径300纳米二氧化硅4g，加pH为7.5的磷酸盐缓冲液(其配置采用:取磷酸二氢钾1.36克，加入0.lmol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml )120ml，常温下搅拌(搅拌速度300转/分钟)吸附6小时，然后常温、8000转/分钟速度下进行离心处理10分钟，弃去上清液，取沉淀(即固定化酶)20g备用。
[0040]取猪小肠黏膜90克，匀浆(在常温下，将洗净的小肠黏膜于200ml蒸馏水中，6000转/分钟匀浆处理5分钟，离心，取沉淀)，于150ml、pH8.7硼酸缓冲液中(其配置采用:取
0.05mol/L (19.07g/L)硼砂溶液 60ml,0.2mol/L(12.37g/L)硼酸溶液 40ml 混合摇匀，即得。
[0041]加入前述获得的固定化酶9克，在60°C下酶解2小时；采用滤纸抽滤，弃去滤渣，滤液在常温、4000转/分钟速度下进行离心处理15分钟；离心所得沉淀(含有固定化酶的部分)可重新用于小肠粘膜酶解，最多不超过3次；离心所得上清液为酶解液120ml左右，用于后续纯化。
[0042]后续纯化过程:先采用PH9.0，D201树脂20克进行吸附处理4小时，然后过滤，取滤渣(吸附后的树脂)，再采用等体积量的2mol/L氯化钠解吸10小时，最后用等体积量乙醇沉淀，得约0.14g肝素钠粗品。
[0043]实施例3
[0044]取肝素钠酶0.15g，粒径200纳米二氧化硅10g，加pH为7.5的磷酸盐缓冲液(其配置采用:取磷酸二氢钾1.36克,加入0.lmol/L氢氧化钠溶液79ml,用水稀释至200ml)80ml，常温下搅拌(搅拌速度500转/分钟)吸附2小时，然后常温、4000转/分钟速度下进行离心处理15分钟，弃去上清液，取沉淀(即固定化酶)15g左右备用。
[0045]取猪小肠黏膜50克，匀浆(在常温下，将洗净的小肠黏膜于150ml蒸馏水中，12000转/分钟匀浆处理2分钟，离心，取沉淀)，于pH8.7硼酸缓冲液中(其配置采用:取0.05mol/L (19.07g/L)硼砂溶液60ml, 0.2mol/L(12.37g/L)硼酸溶液40ml混合摇匀，即得)。
[0046]加入前述获得的固定化酶2.5克，在20°C下酶解5小时；采用滤纸抽滤，弃去滤渣，滤液在常温、8000转/分钟速度下进行离心处理5分钟；离心所得沉淀(含有固定化酶的部分)可重新用于小肠粘膜酶解，最多不超过3次；离心所得上清液为酶解液，约60ml，用于后续纯化。[0047]后续纯化过程:先采用D217树脂15克进行吸附处理4小时，然后过滤，取滤渣(吸附后的树脂)，再采用等体积量的2mol/L氯化钠解吸12小时，最后用等体积量乙醇沉淀，得约0.08g肝素钠粗品。
[0048]试验例
[0049]本试验例用于研究固定化酶的活性以及回收的固定化酶的可利用性。
[0050]称取0.2克胰蛋白酶，加入100ml蒸馏水(取5ml备用测原酶液活力)，再加入5g粒径为300nm的Si02，常温磁力搅拌4小时，转速不宜过大，以免溅出，500转/分钟即可，离心10分钟，取沉淀。分别测原酶液、离心上清、离心沉淀(除上清后加入同等体积的蒸馏水)的酶活力。测得的酶活力(采用的检测方法是GB/T23527-2009)分别为69.31U/ml、60.5U/ml、83.12U/mL.固定化酶相对活力可达9.43(固定化酶相对酶活=固定化酶活力/原酶液活力-上清液活力)。
[0051]取猪小肠黏膜，匀浆，于ρΗ8.7硼酸缓冲液中。加入固定化酶，酶解；采用滤纸抽滤，弃去滤渣(小肠粘膜)，滤液在常温、5000转/分钟速度下进行离心处理10分钟；离心所得沉淀(固定化酶的部分)可重新用于小肠粘膜酶解。两次后测得酶活力为19.43U/ml，酶活力下降，故重复不得超过三次。
[0052]虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或 者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
【权利要求】
1.一种利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)制备固定化酶 先将蛋白酶在PH为7.5-8.5磷酸盐缓冲液存在下加入二氧化硅吸附剂进行吸附处理，离心后得固定化酶沉淀物； 2)采用固定化酶对小肠黏膜进行酶解 将匀浆处理后的小肠黏膜先在PH8-9硼酸缓冲液存在下采用所述固定化酶进行酶解处理，过滤，取滤液，所述滤液进行离心处理，分离得酶解液和沉淀物； 3)提纯处理 所述酶解液进行纯化处理。
2.根据权利要求1所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，步骤I)中所述蛋白酶为胰蛋白酶、肝素钠酶、碱性蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，所述二氧化硅吸附剂为纳米二氧化硅，粒径20-300纳米。
4.根据权利要求1所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，所述蛋白酶与所述二氧化硅吸附剂的重量比为1:20-50，优选为1:20-30 ;所述蛋白酶与磷酸盐缓冲液的量比为 1:400-600 (g/ml)。
5.根据权利要求1所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，所述吸附处理是在常温下进行，搅拌处理2-6小时，搅拌速度200-500转/分钟；所述离心的条件为:常温下4000-8000转/分钟离心处理5-15分钟。
6.根据权利要求1所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，所述固定化酶与所述小肠黏膜的重量比为1:10_20。
7.根据权利要求1所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，所述酶解的条件为20-60°C下酶解处理2-5小时。
8.根据权利要求1所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，步骤2)中所述沉淀物参与小肠黏膜的酶解处理，所述沉淀物与所述小肠黏膜的重量比为1:2-6。
9.根据权利要求1所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，步骤3)中所述纯化处理采用离子交换吸附处理、氯化钠解析、乙醇沉淀。
10.根据权利要求9所述利用固定化酶提取肝素钠的方法，其特征在于，所述离子交换树脂采用FPA98CL树脂、D201树脂、D207树脂、D217树脂或D301树脂。
【文档编号】C12P19/04GK103789373SQ201410054335
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】吴飞虹 申请人:浦江亚太肠衣有限公司