一种制备头孢氨苄的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备头孢氨苄的方法，该方法是将左旋苯甘氨酸酯类衍生物与7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.6:1的比例投料，再按照7-ADCA1~2倍的投料量加入催化剂青霉素酰化酶进行酰化反应；其中所述的青霉素酰化酶其编码的基因序列如SEQIDNO:3所示。本发明有效克服了酶缩合反应过程中的逆反应，由此大大降低了侧链的使用量、避免了侧链过高消耗所导致的产品杂质多的问题，由此也避免了目的产物难以纯化的问题。与此同时，本发明方法还大大提高了7-ADCA的转化率（采用本发明方法可使7-ADCA平均转化率达到98%以上），由此也进一步提高了产品品质，降低了生产成本。
【专利说明】一种制备头孢氨苄的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗生素合成技术，具体的说是一种制备头孢氨苄的方法。
【背景技术】
[0002]头孢氨节,英文名称Cephalexin,是一种半合成β -内酰胺类抗生素,具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用，其作用机理是通过抑制细胞壁的合成，使细胞内容物膨胀至破裂溶解，从而达到杀菌作用。
[0003]头孢氨苄的合成工艺主要有化学方法合成和酶法合成两种，化学合成法是在二氯甲烷溶剂中从左旋苯甘氨酸乙基邓钾盐混酐后，与经过羧基保护的7ADCA进行反应，经化学方法缩合而得到头孢氨苄。最终每生产Ikg头孢氨苄会产生IOkg以上的三废。在这种情况下，酶法合成工艺逐渐受到更多的关注和研究。酶法合成技术是在青霉素酰化酶的催化下，通过用侧链(即左旋苯甘氨酸衍生物，如苯甘氨酸甲(乙)酯及其盐、苯甘氨酰胺及其盐等)对7-ADCA进行酰化反应来生产头孢氨苄，使侧链与7-ADCA缩合制得头孢氨苄。这一工艺已被专利文献广泛描述，如CN100368554C、CN1063491C及CN02826109.7等。与传统的化学方法相比较，酶法合成无论从降低成本、简化工艺，还是从环境友好等方面考虑，都具有明显优势。但其仍有许多不尽人意之处。如:现有酶法合成头孢氨苄的工艺其酶缩合反应过程中存在较严重的酶解反应，即反应产物在酶的作用下再度逆分解成原料，由此大大影响了正反应产率。为提高酶缩合反应的产率，生产者通常是加大侧链对母核的投料量，有的甚至过量4~6倍(摩尔比)，由此又造成侧链过高消耗，并在产品中引入了不需要的杂质，最终导致产物纯度低以及产品分离、纯化困难等诸多问题。
【发明内容】
`[0004]本发明的目的是提供一种制备头孢氨苄的新方法，以解决现有工艺存在侧链投料量大、酶解反应严重、产品纯度低、制备成本高，环境污染严重等问题。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0006]一种制备头孢氨苄的方法，该方法是将左旋苯甘氨酸酯类衍生物与7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.6:1的比例投料，再按照I~2倍于7-ADCA的投料量加入催化剂青霉素酰化酶进行酰化反应；其中所述的青霉素酰化酶其编码的基因序列如SEQ ID Ν0:3所示。
[0007]具体的，本发明的方法包括以下步骤:
[0008]a)将左旋苯甘氨酸酯类衍生物在30~120min内缓慢加入到7-ADCA水溶液中，然后加入所述的青霉素酰化酶，在15~25°C进行酰化反应；反应过程中PH维持在6.0~7.2 ；
[0009]b)待反应终止后，过滤80~120目筛网，即得到滤物一青霉素酰化酶，滤液一头孢氨节混悬液；
[0010]c)将头孢氨苄混悬液过滤，得到头孢氨苄粗粉。
[0011]所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物为左旋苯甘氨酸甲酯及其盐、苯甘氨酸乙酯及其盐中的任意一种。
[0012]优选的，所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物为左旋苯甘氨酸甲酯盐。
[0013]所述左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐酸盐或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸盐。
[0014]加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐固体、左旋苯甘氨酸甲酯盐溶液或左旋苯甘氨酸甲酯盐混悬液。
[0015]所述7-ADCA水溶液其质量浓度为10~15%，其水溶液的温度为15~25°C，PH为
7.8 ~8.0。
[0016]a)步所述酰化反应过程中，使用氨水维持PH在6.0~7.2。
[0017]待a)步所述酰化反应的反应液出现浑浊之后，开始向反应液中缓慢加入纯化水。
[0018]具体的，所述a)步，将从开始反应至反应液开始出现浑浊的时间记为A，当反应时间为2~3XA时，开始缓慢加入纯化水，并在加入纯化水的过程中用HPLC法判断反应终点。
[0019]具体的，所加入纯化水的量与反应液的体积比为0.15~0.5: I ;所述加入纯化水的过程用时20~60min。
[0020]优选的，所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物与所述7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.3: I的比例投料。
[0021]进一步的，所述c)步，用头孢氨苄混悬液过滤后的滤液洗涤所得到的青霉素酰化酶，然后过滤80~120目筛网，得到滤物一青霉素酰化酶，滤液一头孢氨苄混悬液，然后将头孢氨苄混悬液再次过滤，得到头孢氨苄粗粉；重复本步骤，收集98%以上的头孢氨苄粗粉。
[0022]更进一步的，将上述所收集的全部的头孢氨苄粗粉与最后所得滤液混合后，用硫酸调PH至0.1~2.5，然后过0.45 μ m滤膜过滤后得料液，将料液温度升高至30~60°C、用氨水调节料液PH至4.0~6.0，然后养晶、过滤、水洗涤、丙酮洗涤，最后干燥，得终产物。
[0023]上述青霉素酰化酶的制备方法如下:
[0024]I)构建SEQ ID NO:3所示的青霉素酰化酶的编码基因:
[0025]1.1)根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶蛋白序列(SEQ ID NO:1，Genebank:AY919310.1 )，将其第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第415位赖氨酸替换为精氨酸，第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸，在这三个位置引入突变位点，即得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；
[0026]1.2)根据SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，使用在线设计工具Jcat反向设计出核苷酸序列，针对宿主大肠杆菌表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G + C碱基含量，优化上述设计的核苷酸序列为SEQ ID N0:3所示序列，SEQ ID N0:3所示序列与野生型基因序列SEQ ID N0:4相比:大肠杆菌稀有密码子从野生型(SEQ ID N0:4)的55个降低到了 2个，G + C碱基含量由野生型(SEQ ID NO:4)的68.75%下降到57.25% ;同时在设计过程中去除BamHI酶切位点，有利后期基因操作。通过上述系列设计有利于宿主菌大肠杆菌高效表达该基因(SEQ ID NO:3)。
[0027]2)构建含有I)步所述编码基因的重组载体:
[0028]所述重组载体所用到的质粒为PET系列诱导型载体，优选PET28质粒；[0029]2.1)将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行全基因合成，获得ASPGA基因；
[0030]2.2)将所述PET28质粒和所述ASPGA基因分别使用BamH I和Hind III双酶切体系进行酶切，分别得到ASPGA基因片段和PET28质粒片段；
[0031]2.3)使用T4连接酶对ASPGA基因片段和PET28质粒片段进行连接，将连接后的产物转化到宿主菌中，然后涂布到LB培养抗性平板，然后挑取生长出的阳性克隆接种到LB液体培养基进行培养后，提取质粒即得到所构建的重组载体——表达载体PET28-ASPGA。
[0032]3)构建含有2)步所述重组载体的重组菌株:
[0033]在E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109(DE3)感受态细胞悬液中加入所述重组载体混匀，然后经过冷却、热激、冷却、复苏等步骤，完成转化，吸取转化后的细胞涂布加有卡那霉素抗生素的平板，倒置培养，生长出的菌株即为重组菌株——转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA 或转化体 JM109 (DE3) /PET28-ASPGA ；
[0034]构建重组菌株时所用的宿主细胞可选择生工生物工程(上海)有限公司出售的E.coliBL21(DE3)或 E.coli JM109(DE3)。
[0035]4)步骤3)所述重组菌株的诱导表达:
[0036]挑取上述重组菌株的单菌落于含Kan (浓度50 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C、200r/min条件下培养8~IOh后成为活化种子，然后将活化种子以2%的接种量接种到M9培养基中(装液量 为50ml/250ml)，23°C、200r/min条件下培养14h后，加入IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳糖苷)使其终浓度为0.05mM,进行诱导表达，继续培养12h，得菌液。
[0037]5)粗制酶液的制备及其进一步的分离纯化和固定化
[0038]5.1)将4)步得到的菌液离心，收集菌体，然后加入与菌液等体积的磷酸盐缓冲液(0.02M, PH8.0)重悬，使用超声细胞破壁仪破壁20min，然后离心取上清，即为粗制酶液；
[0039]5.2)粗制酶液1L，使用0.01M的盐酸调整PH至5.5，于50°C下保温30min，然后离心除去沉淀；在上清液中加入15% (质量体积比)的硫酸铵，充分混合后离心除去沉淀，然后在上清液中再次加入15% (质量体积比)的硫酸铵，充分混合后离心收集沉淀；将沉淀溶解于200ml磷酸盐缓冲液(0.2M，PH8.0)中，即得到浓缩酶液；
[0040]5.3)取浓缩酶液200ml，加入磷酸盐使其终浓度为0.4M，并调节PH至6.8~7.2，然后加入活化好的LX-1000HA载体20g，于25°C、150rpm条件下搅拌固定化24h，真空抽滤后收集固定化酶，用2倍体积去离子水冲洗3-5遍，过滤收集得到固定化酶，即为a)步所述其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的青霉素酰化酶。
[0041]本发明有效克服了酶缩合反应过程中的逆反应，由此大大降低了侧链的使用量、避免了侧链过高消耗所导致的产品杂质多的问题，由此也避免了目的产物难以纯化的问题。与此同时，本发明方法还大大提高了 7-ADCA的转化率(采用本发明方法可使7-ADCA平均转化率达到95%以上)，由此也进一步提高了产品品质，降低了生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1是本发明所述其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的青霉素酰化酶的重组载体。
[0043]图2是本发明所制备的头孢氨苄的HPLC谱图。【具体实施方式】
[0044]下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不以任何方式意味着对本发明的保护范围做任何限制。
[0045]以下实施例1~6中，进行HPLC分析的条件为:
[0046]填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶；
[0047]流动相A:0.01mol/L醋酸钠水溶液(用冰醋酸调节pH值至5.0);流动相B:甲醇；流速为1.0ml/min，梯度洗脱，见表1 ;
[0048]检测波长:220nm；
[0049]取杂质对照品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，记录色谱图，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸峰、α -苯甘氨酸峰、PGME峰和CEX峰的分离度应符合要求。
[0050]表1:
[0051]
【权利要求】
1.一种制备头孢氨苄的方法，其特征在于该方法是， 将左旋苯甘氨酸酯类衍生物与7-ADCA按照摩尔比为1.15~1.6:1的比例投料，再按照1`2倍于7-ADCA的投料量加入催化剂青霉素酰化酶进行酰化反应；其中所述的青霉素酰化酶其编码的基因序列如SEQ ID N0:3所示。
2.根据权利要求1所述的制备头孢氨苄的方法，其特征在于它包括以下步骤: a)将左旋苯甘氨酸酯类衍生物在30~120min内缓慢加入到7-ADCA水溶液中，然后加入所述的青霉素酰化酶，在15~25°C进行酰化反应；反应过程中PH维持在6.0-7.2 ； b)待反应终止后，过滤80-120目筛网，即得到滤物一青霉素酰化酶，滤液一头孢氨节混悬液； c)将头孢氨苄混悬液过滤，得到头孢氨苄粗粉。
3.根据权利要求2所述的制备头孢氨苄的方法，其特征在于，所述左旋苯甘氨酸酯类衍生物为左旋苯甘氨酸甲酯及其盐、左旋苯甘氨酸乙酯及其盐中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的制备头孢氨苄的方法，其特征是，所述左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐酸盐或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸盐。
5.根据权利要求3所述的制备头孢氨苄的方法，其特征是，加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯盐为左旋苯甘氨酸甲酯盐固体、左旋苯甘氨酸甲酯盐溶液或左旋苯甘氨酸甲酯盐混悬液。
6.根据权利要求2所述的制备头孢氨苄的方法，其特征是，所述7-ADCA水溶液其质量浓度为10~15%，其水溶液的温度为15~25°C，PH为7.8~8.0。
7.根据权利要求 2所述的制备头孢氨苄的方法，其特征是，a)步所述酰化反应过程中，使用氨水维持PH在6.0-7.2。
8.根据权利要求2所述的制备头孢氨苄的方法，其特征是，a)步所述酰化反应的反应液出现浑浊之后，向反应液中缓慢加入纯化水。
【文档编号】C12P35/04GK103805671SQ201410046595
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】刘 东, 杨梦德, 胡国刚, 甘平娟, 张锁庆, 魏阔, 杨宏利, 张文胜, 刘力强, 王新辉, 曹欢, 黄刚 申请人:华北制药河北华民药业有限责任公司