分离和扩增血液间充质干细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种分离和扩增血液间充质干细胞的方法。该方法包括以下步骤：步骤a：收集血液样品，步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，步骤c：将单核细胞成分接种于高分子材料修饰的培养皿，步骤d：分离间充质干细胞，步骤e：培养和扩增间充质干细胞。本发明使用了成分确定的包被成分对细胞培养板进行包被，有效提高了分离的纯度和效率。在α-MEM中添加b-FGF，EGF，TGF-β等细胞因子能够稳定的维持干细胞生长，能够实现血液间充质干细胞的大量扩增。
【专利说明】分离和扩增血液间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种分离和扩增血液间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞是指生物体内能够进行自我更新，并维持机体各组织细胞新陈代谢的一群细胞。同时，在生物体内各种组织受到内源或外源性的损害时，干细胞可以被激活执行分化功能，从而达到修复该组织的目的。间充质干细胞在适当的条件下，具有强大的增值能力和分化能力，能够修复多种组织损伤，包括骨骼，肌肉，神经等组织，因此，间充质干细胞在再生医学治疗领域引起了越来越多的重视。
[0003]已经证明血液中含有分化能力较高，免疫排斥反应较小的间充质干细胞。各级血库、脐带血银行的建立为实现自体细胞移植提供基础。但是，由于血液中间充质干细胞含量极低(以脐带血为例，I X IO8个单核细胞中仅含有0.5-30个，而成年血液中干细胞数量远低于此数量)，因此如何高效分离和扩增这些细胞成为了阻碍血液间充质干细胞向临床转化的难题。目前，多利用该细胞在培养皿的吸附能力，对脐带血间充质干细胞进行分离，但是成功率低，并且在扩增过程中难以保持干细胞特性。本发明包括利用高分子化学材料对培养皿进行修饰，配合添加多种生长因子的培养基，构建血液间充质干细胞扩增环境，实现了该细胞的高效扩增和分离。
[0004]骨髓当中含有丰富的间充质干细胞，因此得到了最为广泛和深入的研究。研究证实，骨髓间充质干细胞表达特定的表面抗原表型，比如，⑶45-，⑶34-，⑶29+，⑶90+，⑶73+和CD105+。在体外和体内环境中可向骨骼，软骨，神经以及胰岛等细胞分化。另外，骨髓间充质干细胞具有免疫调节的功能，分泌多种免疫相关信号分子，从而在免疫性疾病治疗过程中发挥作用。但是，尽管骨髓间充质干细胞细胞较易分离和培养，但是，骨髓来源有限，难以满足临床大量的需求。即便是进行病人的自体移植，患者也必须承担额外的痛苦。在其他组织，比如肌肉，脂肪，脑以及血液等其它组织也能分离获得间充质干细胞。这些细胞有与骨髓间充质干细胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去血液外，应用其他组织的间充干细胞面临着和应用骨髓间充质干细胞相同的问题，及样品稀缺，不足以满足临床需求。
[0005]已经证实，血液中含有活性很强的干细胞群，包括造血干细胞和间充质干细胞。血液中的间充质干细胞与骨髓干细胞相似，有着相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文献表明,血液干细胞有着更原始的干细胞特性和更低的免疫原性。同时,应用血液治疗糖尿病，神经损伤以及血管坏死等疾病也屡见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的方法通过获取血液，利用特定的高分子化学物质而不是使用成分难以确定的细胞外基质，对其中的间充质干细胞进行分离纯化，并配合适当的培养基，实现对血液的高效扩增。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种分离和扩增血液间充质干细胞的方法，包括以下步骤:
步骤a:收集血液样品，
步骤b:分离血液样品中单核细胞成分，
步骤c:将单核细胞成分接种于高分子材料修饰的培养皿，
步骤d:分离间充质干细胞，
步骤e:培养和扩增间充质干细胞。
[0008]根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品自医院采集，或自血液库中获取。
[0009]根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品是人的血液样品。
[0010]根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品采集自于早产或正常分娩胎儿以及成年人血液。
[0011]根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品均经过肝素抗凝，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种。
[0012]根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤c中，高分子材料是指聚乙二醇(PEG)和精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D) (RGD)按同种浓度Iml:0.01g混合。本发明提出聚乙二醇(PEG)和精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D) (RGD)Olg的比例混合，可以比较好的分离和纯化血液中的间充质干细胞，从而既提高了分离纯化效率，也避免了使用化学成分极其复杂的细胞外基质。
[0013]根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤e中，培养和扩增间充质干细胞是指应用血液间充质干细胞培养基进行培养和扩增。
[0014]根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液间充质干细胞培养基包括:a -MEM, Pen-Strep, b_FGF，EGF, TGF- β。本发明使用含有 a -MEM, Pen-Strep, b-FGF, EGF,TGF-β的培养基，在前期可以维持原代细胞的活性，在后期可以高效扩增血液间充质干细胞。其中，α-ΜΕΜ为α-最小必需极限培养基；Pen-Str印为青霉素-链霉素，b-FGF为b-成纤维细胞生长因子，EGF为表皮细胞生长因子，TGF-β为转化生长因子。
[0015]本发明所述的分离和扩增血液间充质干细胞的主要步骤如下:
在无菌条件下获取血液，25-200ml，经过肝素抗凝。血液间充质干细胞的分离纯化过程在取样后24小时内进行。
[0016]首先，使用同体积a -MEM稀释抗凝过的血液，与5g/L的甲基纤维素按4:1混合，静置30分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS缓冲液制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2500rpm离心20min，取界面层，加PBS缓冲液制成单细胞悬液，离心洗涤。将细胞加入用聚乙二醇(PEG)和R⑶修饰的细胞培养板上。细胞在α-ΜΕΜ中培养，该培养基中含有Pen-Str印，b-FGF, EGF, TGF-β等添加成分。细胞达到90%融合时，进行传代。传代时，使用普通培养皿，并在上述含有添加成分的培养基中进行细胞的扩增。[0017]本发明的有益效果是，本发明使用了成分确定的包被成分对细胞培养板进行包被，有效提高了分离的纯度和效率。在α-ΜΕΜ中添加b-FGF，EGF，TGF-β等细胞因子能够稳定的维持干细胞生长，能够实现血液间充质干细胞的大量扩增，从而完成了本发明。【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0019]图1是本发明培养脐带血间充质干细胞20天后的结果。
【具体实施方式】
[0020]现结合以下实例来更加详细的描述本发明的用于脐带血中间充质干细胞分离和扩增的方法。提供实例的目的仅在于示例性的阐述名发明，不能将其理解为是对本发明范围和实质的限制。
[0021]实施例1:修饰细胞培养板
将聚乙二醇(PEG)和R⑶材料按0.25g:8ml的比例重溶于氯仿中，取培养容器，把上述溶液均匀涂布于其上，低温下抽吸48h，得到透明的覆盖于玻片上的生物材料。加入IOmg /mL的Sulf0.LC.SPDP磷酸盐缓冲液(PBS，pH:8.0)0.5mL，室温下不停振动，反应12h ;PBS缓冲液冲洗3次，室温下不停振动，反应24h ；PBS缓冲液冲洗3次，自然干燥。材料经环氧乙烷消毒后备用。
[0022]实施例2:分离和扩增脐带血间充质干细胞
将在无菌条件下采集的脐带血以体积比1:1与细胞在α-ΜΕΜ混合稀释，与5g/L的甲基纤维素按4:1混合，静置30分钟，沉降红细胞。吸取上清，离心后，用PBS缓冲液制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上,2500rpm离心20min，取界面层，加 PBS缓冲液制成单细胞悬液，离心洗涤。
[0023]因为淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque的比重为1.077g/ml,其比单核细胞重但比红细胞轻，因此可以将单核细胞与残留的红细胞分离。收集界面层即可收集到比较纯的单核细胞。
[0024]将获取的单核细胞用PBS缓冲液稀释，2000rpm,离心lOmin，去掉上清液，并加入新的PBS缓冲液打散，稀释。以同样的条件再洗涤一次，可见沉积于离心管底部的细胞。
[0025]随后，使用添加10%胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基均匀打散收集到的细胞。脐带血间充质干细胞培养基是指在添加l%Pen-Strep, 50ng/ml b-FGF, 10ng/mlEGF,lOng/ml TGF-β等生长因子的α-ΜΕΜ培养基。
[0026]细胞打散后，接种于实施例1制备的细胞培养板，7天后更换培养基。洗涤培养板，除去未贴壁细胞。继续使用添加10%胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，每7天换液一次，直至细胞接近90%融合。
[0027]将90%融合细胞用胰酶进行消化，接种于一般培养板，使用10%胎牛血清的脐带血间充质干细胞培养基培养，3天换液一次。直至融合，并进行下一次传代。
[0028]实施例3:培养的间充质干细胞表面抗原表征
为了确定上述细胞具有间充质干细胞表面抗原的特征，使用FACs对细胞表面进行分析。结果显不于表1。
[0029]表1
【权利要求】
1.一种分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，该方法包括以下步骤: 步骤a:收集血液样品， 步骤b:分离血液样品中单核细胞成分， 步骤c:将单核细胞成分接种于高分子材料修饰的培养皿， 步骤d:分离间充质干细胞， 步骤e:培养和扩增间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，所述血液样品自医院采集，或自血液库中获取。
3.根据权利要求1所述的分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，所述血液样品是人的血液样品。
4.根据权利要求1或2或3所述的分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，所述血液样品采集自于早产或正常分娩胎儿以及成年人血液。
5.根据权利要求4所述的分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，所述血液样品均经过肝素抗凝，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种。
6.根据权利要求1所述的分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，所述步骤c中，高分子材料是指聚乙二醇和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸按同种浓度Iml:0.01g混合。
7.根据权利要求1所述的分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，所述步骤e中，培养和扩增间充质干细胞是指应用血液间充质干细胞培养基进行培养和扩增。
8.根据权利要求7所述的分离和扩增血液间充质干细胞的方法，其特征是，所述血液间充质干细胞培养基包括:a -MEM, Pen-Strep, b_FGF，EGF, TGF-β。
【文档编号】C12N5/0775GK103789260SQ201410046445
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月10日 优先权日:2014年2月10日
【发明者】孙博 申请人:江苏霖峯细胞技术股份有限公司