一种中华鳖抗病微卫星位点及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种中华鳖抗病微卫星位点，4个微卫星位点，其核苷酸序列分别为SEQ?ID?NO：1-4，引物序列为SEQ?ID?NO：5-12，本发明通过从中华鳖公共数据库中筛选出的4个微卫星位点，并根据微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物,并将筛选出的中华鳖抗病基因内的SSR标记用于快速检测多个样本，本发明筛选出的4个微卫星位点具有高度多态性和稳定性，抗病或易感相关的等位基因可应用于抗病关联分析，通过关联分析判断其抗病能力，进一步应用于中华鳖分子辅助育种。
【专利说明】一种中华鳖抗病微卫星位点及其应用【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学DNA标记【技术领域】，具体涉及一种中华鳖抗病微卫星位点及其应用。
【背景技术】
[0002]中华鳘，又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老鳘，英文名ChineseSoft she I ITurt Ie,拉丁文名(Pelodiscus sinensis),中国除宁夏、新疆、青海及西藏未见报道外，其余各省、市、自治区均有分布，以长江流域和华南地区为多见；国外分布于日本、朝鲜和越南。中华鳖由于其药用价值和营养价值，长期被大量消耗，而品种是中华鳖养殖的物质基础之一(品种、饲料、水质)，良种的选择和育种是增产的有效途径，同时也可以间接起到节能减排的作用。一般认为，在其它条件相同的情况下，使用优良品种可增产20~30%，因此要发展“高产、优质、高效”的中华鳖养殖业，对良种的选育应该引起足够的重视。遗传改良或品种培育是中华鳖养殖发展的动力，研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力与生产性状密切相关，因此，本发明欲建立一种筛选方式，将中华鳖抗病基因内部的SSR标记用于快速检测多个样本，通过关联分析判断其抗病能力，应用与抗病关联分析，进一步应用于分子辅助育种。
[0003]分子标记辅助选育(MAS)是遗传育种中的重要环要节之一，它的原理是根据与某一性状紧密相连的分子标记的出现来对目标性状的基因型进行选择，MAS在鉴定优良亲本，筛选早期优良性个体，加快育种进程中发挥了重要作用。微卫星标记由于具有多态性丰富、遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增、条带易于识别等多种优点成为开发的首选。微卫星(Microsatell ites)又称简单序列重复序列(Simple sequence repeats, SSR),是真核生物基因组中广泛分布的简单重复DNA片段，一般由2~6个核苷酸为基本单位组成，其中，最常见的是双核苷酸重复，如((AC/TG)n及(AG/TC)n。不同的生物个体由于基本单位重复次数的不同以及重复程度的不完全形成了微卫星位点的长度多态性而显示出多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的“链滑(strand slippage)现象造成微卫星DNA多态性信息容量(polymorphic information content, PIC)较高。微卫星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，目前己被广泛用于遗传多样性分析，亲缘关系鉴定，连锁图谱构建，功能基因定位，分子标记选育等研究领域，由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同个体基因型微卫星的多态性，而且，微卫星在基因组中分布密度很大，表现出高度的多态性和共显性遗传，能为种质资源的保护、合理的人工增养殖、人工放流方案的制定提供评价依据。因此，从中华鳖中分离多态性微卫星抗病位点就成为上述工作的基础。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种中华鳖抗病相关微卫星位点及引物，即提供4对与抗病相关的微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，从而为中华鳖筛选抗病的相关的个体选育提供分子标记。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种中华鳖抗病微卫星位点，其微卫星位点的核苷酸的序列为SEQ ID NO:1-4中的任一个。
[0006]本发明还提供了上述4个微卫星卫点的引物对，从序列为SEQ ID NO:1的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，
[0007]其中SEQ ID NO:5 为 5’ -AGGCCAGAAGGGACCATTTAGTA-3’ ;
[0008]SEQ ID NO:6 为 5，-TGGTCGATCATTTTGCTGTGAG-3，。
[0009]从序列为SEQ ID NO:2的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 其中 SEQ ID NO:7 为 5’ -GCACCAGGAAAGAGTCAAGAATC-3’ ;
[0010]SEQ ID NO:8 为 5，-CAGCCCGAGAACATCAGAATAG-3，。
[0011]从序列为SEQ ID NO:3的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO:
9和 SEQ ID NO:10,其中 SEQ ID NO:9 为 5’ -TGCCAATATAGTCTCAGTAGTAT-3，; SEQ ID NO:
10为 5’ -GAAGGAAGTTGTTAGAACATCTC-3’。
[0012]从序列为SEQ ID NO:4的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO:
11和 SEQ ID NO: 12，其中 SEQ ID NO: 11 为 5’ -CGAAGGTGAAAAAAGGTGTTA-3’ ;
[0013]SEQ ID NO: 12 为 5，-ATGTTTGTTTGCTGGGAAGGGA-3，。
[0014]另一方面，提供了所述微卫星引物对用于中华鳖抗病相关微卫星位点的判定步骤如下:
[0015]I)基因组DNA的提取:使用基因组DNA提取试剂盒从中华鳖的易感群体和抗病群体中分别提取基因组DNA作为扩增的模板；
[0016]2)微卫星PCR扩增:利用每对中华鳖微卫星引物分别对易感群体和抗病群体中提取的基因组DNA进行PCR扩增，以获得中华鳖个体中易感群体和抗病群体的微卫星扩增产物；
[0017]3)扩增产物电泳:采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法及银染法检测微卫星扩增产物；
[0018]4)统计分析:采用P0PGENE1.3.1计算微卫星座位在易感群体和抗病群体中的基因频率、遗传杂合度、有效等位基因数以及多态信息含量。
[0019]与现有技术相比，本发明的优点在于:通过从中华鳖公共数据库中筛选出的4个微卫星位点，并根据微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物，并将筛选出的中华鳖抗病基因内的SSR标记用于快速检测多个样本，本发明筛选出的4个微卫星位点具有高度多态性和稳定性，可应用于抗联分析，抗病或易感相关的等位基因可应用于抗病关联分析，通过关联分析判断其抗病能力，进一步应用于中华鳖分子辅助育种。`【具体实施方式】
[0020]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0021]本发明开发出了一类适用于对中华鳖样本进行抗病能力关联分析的多核苷酸集，所述的多核苷酸集中包含有多个简单重复序列(微卫星位点序列，SSR)，利用对应于这些简单重复序列的特异性引物可以检测到中华鳖种群基因的多态性。因此，基于该多核苷酸集中的一个或多个简单重复序列可以分析血吸虫的抗病能力等。本发明人还基于所述简单重复序列设计了特异性的引物，所述引物扩增效果良好，扩增产物唯一。在此基础上完成了本发明。
[0022]实施例1嗜水气单胞菌攻毒的方法的建立
[0023]1、实验样品采集
[0024]选取200g/只的中华鳖黄河群体，用嗜水气单胞菌T4菌株做攻毒处理，最先死亡的50只为易感群体，最后死亡的为抗病群体(其中抗病的鳖用细菌注射了 5-6次依然很活跃)。屠宰后取其肌肉组织_80°C保存。
[0025]2、试验方法
[0026]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)T4菌株由南京农业大学陆承平教授惠赠。T4菌株复壮后接种于普通营养琼脂培养基，28°C恒温培养12h (0D600<1.0)，用灭菌生理盐水洗下菌体，平板计数并稀释到4X 108cfu/mL，用1.0 X 108cfu/50g体重浓度对中华鳖进行攻毒。
[0027]中华鳖经20天预饲养后，进行T4菌半致死量确定，所用菌液浓度为:
1.0X 107CFU/mL、5.0X 107CFU/mL、l.0X 108CFU/mL、5.0X 108CFU/mL、l.0X 109CFU/mL 和
5.0X 109CFU/mL，对照组注射等量的生理盐水。注射剂量为lmL，每个浓度梯度10只中华鳖，共70只，统计攻毒10天后各组的死亡数。经过攻毒后，按照中华鳖死亡的顺序进行排号，易感的个体发生了严重的炎症反应，肠道大量充血，背甲和腹甲发生穿孔，鼻腔内流血，这些是嗜水气单胞菌感染的典型症状。经过连续4次攻毒后还剩下51只完好的中华鳖，这些中华鳖体表光滑无伤，行动活泼，解剖后肠道没有发生明显的充血，肠道中可见有食物。同时根据抗病中华鳖的数量，选择最早发病的51只中华鳖为易感组。
[0028]用半致死量浓度对养殖于33个水族箱的330只健康中华鳖注射。实验间隔时间IOd,对照组注射等体积无菌生理盐水(0.9%NaCl)。日换水率20%，连续观察实验鳖的活动情况，以身体僵直、碰触无反应为死亡评判标准；以趴在料台上不动，反应迟缓作为病鳖的判断标准。每日观察两次，及时取出死亡个体，以分成易感组和抗病组。每只中华鳖单独进行采样，取肌肉组织冷冻保存，以备后续的DNA提取。
[0029]实施例2SSR的获得以及引物设计
[0030]1、易感组和抗病组成虫样本DNA的抽提[0031 ] 采用DNA的酚抽提和乙醇沉淀法:
[0032](1)取0.025g中华鳖肌肉样品，放入1.5mL离心管中。加入IOOmL STE裂解缓冲液，在冰上用眼科小剪刀剪碎，再补加400mL STE裂解缓冲液，50 μ L SDS (10%)，5yL蛋白酶K (20mg/mL),充分混匀后放入56°C消化4h，期间Ih混匀一次。直至裂解液澄清。
[0033](2)加入酚/氯仿/异戊醇(25:24:1) 500mL，抽提lOmin，在12000rpm条件下离心 IOmin0
[0034](3)取离心后的上清液，重复上述步骤一次，直至水相与有机相间无蛋白质层。
[0035](4)取离心后的上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24:l) 500yL，抽提lOmin，12000rpm 离心 lOmin。
[0036](5)取上清液加入50 μ L NaAc (3Μ)，1000 μ L冷无水乙醇缓慢摇匀，可见丝状DNA析出。放入-20°C冰箱IOmin,使DNA充分析出。13000rpm离心lOmin。[0037](6)小心的弃去上清液,用100070%乙醇洗漆沉淀，1000Orpm下离心5min,重复一遍。
[0038](7)吸出乙醇，通风干燥3_5min。
[0039](8)加入50 μ L灭菌双蒸水，轻弹至DNA全部溶解，放在_20°C冰箱中保存备用。
[0040](9)提取好的DNA需要用1%琼脂糖电泳检测其纯度。
[0041](10)采用微量核酸测定仪检测样本DNA的浓度和纯度，并稀释到IOOng/μ L, _20°C保存。
[0042]2、微卫星位点的筛选及引物的获得
[0043]对于采用SSR位点为遗传标记的种群遗传学研究，选择出合适的SSR位点显得尤为重要。首先，其单元结构要求简单，因为结构复杂(重复的碱基多，或者有其非重复碱基的插入)将会对后续分析带来一定的偏差；其次，微卫星位点所在的位置应该远离基因编码区，如果处于或接近基因编码区，这些位点就可能会在种群的传代过程中丢失，不能真实地反映群体的遗传特征；第三，所选取的微卫星位点原始序列要具有高度的特异性。此外，在被研究样本大小的选择上也有很高的要求，如果选取的样本数量太小，可能会失去一些等位基因，从而给样本之间遗传差异的计算带来偏差。因此，合适的SSR位点的选择需要经过大量的分析和试验工作。而引物选择主要是考虑以下几个方面，首选是确定引物的多态性，并参考以下标准:应为公共所有，微卫星座位间不连锁，微卫星座位遗传符合孟德尔遗传规律，每个微卫星座位至少应有4个等位基因。此外，综合考虑微卫星座位的引物序列组成，多态性和产物大小等多方面因素。从基因组数据库获取初始数据，并经过如下原则的筛选:a)3-4个碱基重复(例如CGG，TACC) ；b)各位点不包含复杂结构；c)序列为中华鳖基因组特异；d)微卫星的重复次数在10-25次；e)位点所处的位置应该远离编码区。本发明人经过进一步分析、实验和选择，最后获得4条具有典型性的有效的微卫星序列，它们的序列依次如SEQID NO =1-SEQ ID N0:4所示。经过筛选最终确定4对引物和抗病相关的微卫星位点，引物序列如表1。
[0044]表1抗病相关微卫星引物情况
【权利要求】
1.一种中华鳖抗病微卫星位点，其特征在于:所述的微卫星位点的核苷酸的序列为SEQ ID NO:1-4 中的任一个。
2.一种微卫星引物对，其特征在于:所述的引物是从权利要求1所述的微卫星位点上设计的。
3.根据权利要求2所述的微卫星引物对，其特征在于:从序列为SEQID N0:1的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，
其中 SEQ ID NO:5 为 5’ -AGGCCAGAAGGGACCATGTA-3’ ;
SEQ ID NO:6 为 5，-TGGTCGATCATTTTGCTGTGAG-3，。
4.根据权利要求2所述的微卫星引物对，其特征在于:从序列为SEQID N0:2的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，
其中 SEQ ID NO:7 为 5’ -GCACCAGGAAAGAGTCAAGAATC-3’ ;
SEQ ID NO:8 为 5，-CAGCCCGAGAACATCAGAATAG-3，。
5.根据权利要求2所述的微卫星引物对，其特征在于:从序列为SEQID N0:3的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，
其中 SEQ ID NO:9 为 5’ -TGCCAATATAGTCTCAGTAGTAT-3’ ;
SEQ ID NO: 10 为 5’ -GAAGGAAGTTGTTAGAACATCTC-3’。
6.根据权利要求2所述的微卫星引物对，其特征在于:从序列为SEQID N0:4的微卫星位点上设计的引物对，其序列分别为SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12，
其中 SEQ ID NO: 11 为 5’ -CGAAGGTGAAAAAAGGTGTTA-3’ ;
SEQ ID NO: 12 为 5’ -ATGTTTGTTTGCTGGGAAGGGA-3’。
7.一种中华鳖抗病微卫星位点的应用，其特征在于:所述微卫星引物对用于中华鳖抗病相关微卫星位点的判定步骤如下: 1)基因组DNA的提取:使用基因组DNA提取试剂盒从中华鳖的易感群体和抗病群体中分别提取基因组DNA作为扩增的模板； 2)微卫星PCR扩增:利用每对中华鳖微卫星引物分别对易感群体和抗病群体中提取的基因组DNA进行PCR扩增，以获得中华鳖个体中易感群体和抗病群体的微卫星扩增产物； 3)扩增产物电泳:采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法及银染法检测微卫星扩增产物； 4)统计分析:采用POPGENE1.3.1计算微卫星座位在易感群体和抗病群体中的基因频率、遗传杂合度、有效等位基因数以及多态信息含量。
【文档编号】C12Q1/68GK103820437SQ201410041950
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】王伟, 钱国英, 李彩燕, 葛楚天, 尹尚军, 朴龙斗 申请人:浙江万里学院