非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法

非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标的，包括一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。试剂盒包括PCR混合液、Taq?DNA聚合酶、DEPC-H2O、ASFV阳性质控品、ASFV阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；PCR混合液中含有一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。检测方法包括：总DNA提取、反应组分配制、标准品稀释制作标准曲线、扩增、结果判定。本发明的试剂和试剂盒特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量非洲猪瘟病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，检测方法快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品。
【专利说明】非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]非洲猪瘟病毒病是猪的一种接触性病毒病，本病攻击巨噬单核细胞，典型特征是死亡率高、皮肤有变红的区域和内脏器官有严重的出血，在首次发生该病的国家和地区，死亡率可高达100%。在自然条件下，非洲猪瘟病毒寄存在钝缘蜱和隐性感染的非洲野猪、疣猪、南非野猪和大野猪中。国际兽医局将该病确定为A类动物传染病，我国也将其确定为进境动物一类传染病。本病对国际贸易产生严重影响，世界各国在从该病流行和发生过的国家或地区输入猪时，采取禁止输入或针对本病的严格的检疫措施。我国加入世界贸易组织后，必须参与实施国际间卫生与动植物检疫措施的协定，应按照OIE的有关要求，采用先进技术对非洲猪瘟进行检疫。但是，目前我国尚未进行过该病检疫技术的研究和技术储备，因此，研究建立非洲猪瘟的安全、快速检测技术和配套的检测试剂，为防止重大动物疫病传入我国作好技术储备。目前，国外对非洲猪瘟诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、ELISA、聚合酶链反应(PCR)等。其中红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验的敏感性不高和特异性不强，动物接种试验不安全。聚合酶链反应检测非洲猪瘟病毒的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等特点 。

【发明内容】

[0003]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量非洲猪瘟病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的检测试剂和试剂盒。
[0004]本发明进一步要解决的问题在于，提供一种快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测检测方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0006]一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标的，包括:
[0007]引物:ASFV-PF205:5' -ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3'
[0008]ASFV-PR285:5' -GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3'
[0009]探针:ASFV-Pb229:5' -CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3'
[0010]内标探针:ASFV-PbIC:5' -CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3'，
[0011]所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；[0012]所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为:
[0013]ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
[0014]所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂中，所述探针5'端标记的荧光报告基团是FAM,所述探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl ;所述内标探针的5'端标记的荧光报告基团是ffiX，所述内标探针的3'端标记的荧光淬灭基团为BHQl。
[0015]所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂中，还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为:
[0016]ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCACGTGACCGCTGGCGTGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
[0017]一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、TaqDNA聚合酶、DEPC-H2O, ASFV阳性质控品、ASFV阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；
[0018]其中，所述PCR混合液中包含:
[0019](I)引物:ASFV-PF205: 5' -ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3'
[0020]ASFV-PR285:5' -GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3'
[0021](2)探针:ASFV-Pb229:5' -CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3'；
[0022](3)内标探针:ASFV-PbIC:5' -CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3'
[0023]所述假病毒内标溶液中包含:内标核苷酸序列制作的假病毒；
[0024]所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；
[0025]所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段，所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为:
[0026]ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
[0027]所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒中，所述探针5'端标记的荧光报告基团是FAM,所述探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl ;所述内标探针的5'端标记的荧光报告基团是ffiX，所述 内标探针的3'端标记的荧光淬灭基团为BHQl。
[0028]所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒中，用于制作假病毒的内标核苷酸序列为:
[0029]ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCACGTGACCGCTGGCGTGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
[0030]所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒中，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为:
[0031]
【权利要求】
1.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标的，包括:
弓丨物:ASFV-PF205:5' -ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3'
ASFV-PR285: 5' -GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3' 探针:ASFV-Pb229: 5' -CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3' 内标探针:ASFV-PbIC: 5' -CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3'， 所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团； 所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为:ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述探针5'端标记的突光报告基团是FAM,所述探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl ;所述内标探针的5'端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3'端标记的荧光淬灭基团为 BHQl。
3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括作为 内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为:
ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCACGTGACCGCTGGCGTGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
4.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合液、TaqDNA聚合酶、DEPC-H2O, ASFV阳性质控品、ASFV阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液； 其中，所述PCR混合液中包含:
(1)引物:ASFV-PF205:5' -ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3'
ASFV-PR285: 5' -GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3' (2)探针:ASFV-Pb229: 5' -CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3' (3)内标探针:ASFV-PbIC: 5' -CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3' 所述假病毒内标溶液中包含:内标核苷酸序列制作的假病毒； 所述探针和内标探针的5'端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3'端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团； 所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段，所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为:
ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针5'端标记的突光报告基团是FAM,所述探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl ;所述内标探针的5'端标记的突光报告基团是HEX,所述内标探针的3'端标记的突光淬灭基团为BHQl。
6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，用于制作假病毒的内标核苷酸序列为:
ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCACGTGACCGCTGGCGTGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACo
7.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为: PCR混合液400 u L Taq DNA 聚合酶(5U/ii L)25 U L DEPC-H2OImL ASFV阳性质控品1.2mL ASFV阴性质控品1.2mL 定量用标准品2 mL 假病毒内标溶液500 yL。
8.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，采用采用权利要求4的试剂盒，检测方法包括以下步骤: (I )、总DNA提取:在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的DNA，得到模板DNA溶液； (2 )、反应组分配制:分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、模板DNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、ASFV阳性质控品和DEPC-H20制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、ASFV阴性质控品和DEPC-H20制成阴性对照物； (3)、标准品稀释制作标准曲线:对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线.(4)、扩增:分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增，首先95°C预变性3min，95°C下变性lOsec，在60°C下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环； (5)结果判定:根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果；当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效；若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时结果无效，需重复此样品的检测。
9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中，判定结果包括定性判定结果和定量判定结果: 定性判定结果为: Ct值> 40.0或无扩增曲线，表示样品中无非洲猪瘟病毒； Ct值< 35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在非洲猪瘟病毒； Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性； 所述定量判定结果为:先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以定量用标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。
【文档编号】C12Q1/06GK103757134SQ201410014511
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】翟建新, 花群义, 朱志杰, 张利 申请人:深圳澳东检验检测科技有限公司