一种通过糖多孢红霉菌sace_3986基因提高红霉素产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，所述的方法为：通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌的SACE_3986基因，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述技术获得的菌株发酵可以提高红霉素产量，本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负向调控子SACE_3986，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_3986基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。
【专利说明】—种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及一种提高发酵生产红霉素产量的方法，尤其涉及一种通过缺失糖多孢红霉菌染色体上负向调控基因SACE_3986提高红霉素产量的方法。
【背景技术】
[0002]放线菌次级代谢产物具有广泛的用途，如抗生素、抗癌剂、免疫调节剂、驱虫剂、昆虫防治剂[I]。目前发现的23000种生物活性次级代谢产物中，有10000多种是放线菌产生的[2]。然而，这些次级代谢物原始产量非常低，需要通过筛选才能获得工业生产高产菌株。过去工业生产菌株主要通过随机物理或化学诱变方法获得。传统的随机诱变技术不但耗时，而且无法指导对育种进行理性设计。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株，用于红霉素或中间产物生产。
[0003]糖多孢红霉菌是1952年从土壤中分离出的革兰氏阳性丝状放线菌，其次级代谢产物红霉素A是重要的广谱大环内酯类抗生素，目前红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病。由于红霉素及其衍生物每年的世界销售量达数百亿美元，吸引了许多科学家来研究如何提高其产量。2007年，Oliynyk等[3]报道了糖多孢红霉菌NRRL23338的基因组序列，但糖多孢红霉菌调控基因研究很少，到目前为止只有 bldD(SACE_2077) [4]、SACE_7040[5]、SACE_0012[6]和 SACE_5599m 的调控基因研究报道，及我们申报的SACE_3446 (申请号:201210099708.8)和SACE_7301 (串请号:201310082765.X)两项发明专利。
[0004]原核生物的转录调控子可以分为LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、Lac1、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR> NtrC (EBP)、OmpR> DeoR、Cold shock、GntR 和 Crp 等 16 个家族[8]，其中TetR家族成员在DNA结合域方面具有螺旋_转角-螺旋(HTH)的结构特征[9][10]。TetR家族在细菌中普遍存在，大约有2000多个成员，但到目前为止人们只发现100多个成员的特征。糖多孢红霉菌染色体上有101个TetR家族基因M，其中有些基因可能参与红霉素生物合成。
【发明内容】
[0005]本发明目的就是提供一种通过缺失糖多孢红霉菌中负向调控基因SACE_3986提
高红霉素产量的方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0008]通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_3986基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。
[0009]一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，所述的SACE_3986基因产物可以负向调控红霉素生物合成。
[0010]一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，所述的方法具体表现为以糖多孢红霉菌SACE_3986基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物
[0011]本发明的特点是:
[0012]本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负向调控子SACE_3986，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_3986基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。
[0013]糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_3986基因时红霉素产量提高了 43%，而在Δ SACE_3986基因突变株中回补SACE_3986基因，红霉素产量得到恢复，表明SACE_3986是一个参与红霉素生物合成的负向调控子。当在糖多孢红霉菌A226中增加SACE_3986基因拷贝时，红霉素产量较出发菌株降低50%，说明在糖多孢红霉菌中缺失SACE_3986基因，可以构建红霉素高产菌株。
[0014]同时，红霉素生物合成基因调控是一个网络，通过基因工程途径改变SACE_3986基因或产物的上下游调控因子，也可构建红霉素高产菌株，用于提高发酵红霉素产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明的染色体同源重组技术示意图；
[0016]图2为SACE_3986基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置及所编码的氨基酸序列；
[0017]图3为Λ SACE_3·986突变体鉴定及红霉素产量分析，其中(A) Δ SACE_3986突变体鉴定:SACE_3986基因(672bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度增加了 688bp ；M, 5000bp DNA Marker ； (B)糖多孢红霉菌出发菌株A226、突变菌株Λ SACE_3986及回复菌株 Λ SACE_3986/pIB1393986 (对照为 Λ SACE_3986/pIB139)在 R5 培养基中 30°C发酵 6 天产物HPLC分析；
[0018]图4为SACE_3986基因过表达及红霉素产量分析，其中(A) A226/pIB1393986过表达菌株PCR鉴定:PCR产物为pIB139载体上SACE_3986基因(672bp)和apr抗性基因(776bp) ;M, 5000bp DNA Marker ； (B)糖多孢红霉菌出发菌株A226、过表达菌株A226/PIB1393986(对照为A226/pIB139)在R5培养基中30°C发酵6天产物HPLC分析；
[0019]图5为ASACE_3986与出发菌株A226中相关基因转录分析；
[0020]图6为载体pET28a3986的成功构建与SACE_3986蛋白的表达及其纯化，其中(A)为pET28a3986质粒的鉴定:目的条带SACE_3986基因(672bp)被PCR扩增出；M, 5000bpDNA Marker, (B)为SACE_3986蛋白的诱导表达及纯化:1M泳道显示的为纯化后的目的蛋白；M.Markerl.pET28a2.pET28a3986 (未诱导)3.pET28a3986 (诱导未纯化)lM-40mM.不同浓度咪唑洗脱后的蛋白
[0021]图7为阳性对照BldD蛋白和SACE_3986蛋白与eryAI基因启动子的EMSA实验:其中㈧为BldD蛋白与PeryAI启动子的EMSA实验，(B)为SACE_3986蛋白与PeryAI启动子的EMSA实验；
[0022]图8 为 SACE_3986 蛋白与 SACE_3985—SACE_3986 基因间隔区的 EMSA 实验。【具体实施方式】
[0023]实施例1
[0024]1.1菌株、质粒与生长条件
[0025]试验中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37°C的液体LB(Luria-Bertani)培养基或在添加1.25%琼脂的LB平板上培养。红霉素生产菌糖多孢红霉菌A226及其工程菌株在30°C胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2%琼脂的R3M平板上培养。
[0026]1.2材料、DNA操作与测序
[0027]PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。 大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
[0028]表1试验中使用到的菌株和质粒
[0029]
【权利要求】
1.一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于包括以下步骤: 通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_3986基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。
2.根据权利要求1所述的一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于所述的SACE_3986基因产物可以负向调控红霉素生物合成。
3.根据权利要求1所述的一种通过糖多孢红霉菌SACE_3986基因提高红霉素产量的方法，其特征在于所述的方法具体表现为以糖多孢红霉菌SACE_3986基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物。`
【文档编号】C12P19/62GK103849642SQ201410014348
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】张部昌, 吴攀攀, 吴杭, 朱林 申请人:安徽大学, 合肥泰瑞生物技术有限公司