一种指导噻嗪类利尿药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种指导噻嗪类利尿药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法，包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包括以下10个与噻嗪类利尿药用药相关基因上的15个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如SEQID?NO.1～NO.46所示；其使用方法包括采集样本并提取核酸的步骤；以提取的核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品的步骤，优点是特异性强、准确度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。
【专利说明】一种指导噻嗪类利尿药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种指导噻嗪类利尿药用药的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]噻嗪类利尿药是五种一线降压药之一，主要通过三种机制发挥作用:抑制远曲小管前段和近曲小管对氯化钠的吸收，增加远曲小管和集合管的Na+-K+交换，促进K+的分泌；抑制磷酸二酯酶的活性，减少肾小管对脂肪酸的摄取和线粒体氧耗，抑制肾小管对Na+、Cl—的主动重吸收；因肾小管对水、Na+的吸收减少，肾小管内压力升高，流经远曲小管的水和Na+增加，促使致密斑通过管一球反射，肾内肾素、血管紧张素分泌增加，肾小管收缩、肾血流量下降，肾小球入球和出球小动脉收缩，肾小球滤过率也随之下降。虽然噻嗪类利尿剂长期作为一线抗高血压药物，但在临床应用中，却存在治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异，部分患者获益，部分患者耐药并出现严重毒副作用。研究表明，人群对噻嗪类利尿药的个体差异与单核苷酸多态性(SNP)密切相关。高血压患者在接受噻嗪类利尿药治疗之前，进行噻嗪类利尿药相关SNP基因位点的监测，根据监测结果制定化疗方案，提闻闻血压临床治疗的针对性，减少药物毒副作用的发生，节约宝贵的医治时间。
[0003]现有的SNP检测方法主要为基因芯片法、荧光定量PCR(qPCR)和Sanger测序法。
[0004](I) qPCR检测方法:采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点是(I)通量低:不适宜多SNP位点的检测；难以设置内控基因。(2)成本较高:探针标记成本高；若需获得所有相关SNP信息，需进行多个检测试验，叠加成本更加昂贵。
[0005](2)基因芯片法:基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。DNA芯片:由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测。其优点是:(1)高通量并行检测；(2)操作简便快速:整个检测只需4-8小时基本可以出结果。缺点:1)不同SNP位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制；2)技术成本昂贵、复杂:每个样品需要一个芯片，成本大于Y1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3)重复性差，准确性低，易出现假阳性假阴性结果；4)灵敏度较低:芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5)由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。
[0006](3)Sanger (双脱氧链终止法)测序法:Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。其优点是SNP分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，多个SNP位点检测累计价格相对昂贵。
[0007]多重SNP位点检测方法基于多重PCR和毛细管电泳(CE)分离技术。采用多重PCR方法，在同一个反应管中同时加入> I对特异性基因扩增引物及反应内参引物，根据基因扩增片段的大小用毛细管电泳分离分析多个SNP位点及基因型，能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势:
[0008]1、高通量:本系统实现单个反应检测30-40个位点。
[0009]2、准确性强:采用CE对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；
[0010]3、敏感性高，结果重复性好:本系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定性的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度；
[0011]4、方法简便，使用经济:本发明提供从试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于Y50,利于大规模推广；
[0012]5、灵活性强:可随时根据需求调整检测的靶基因。
[0013]6、易于实现自动化。
`[0014]目前，国内外还没有关于基于多重PCR和CE的多重SNP检测指导噻嗪类利尿药用药的试剂盒及其使用方法的相关报道。
【发明内容】
[0015]本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于多重PCR和毛细电泳的SNP检测系统的引物组合物。
[0016]本发明所要解决的技术问题还在于提供包含上述引物组合物的多重基因检测试剂盒及其使用方法。
[0017]本发明解决上述技术问题所采用的技术手段是:一种指导噻嗪类利尿药用药的的引物组合物，包括以下10个与噻嗪类利尿药用药相关基因上的15个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下表1所示:
[0018]表1
[0019]
【权利要求】
1.一种指导噻嗪类利尿药用药的的引物组合物，其特征在于，包括以下10个与噻嗪类利尿药用药相关基因上的15个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下:
2.一种指导噻嗪类利尿药用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合物、PCR反应液和阳性对照品；所述PCR反应液包括以下组分:超纯水，X溶液，10XPCR缓冲液，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的一种指导噻嗪类利尿药用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID N0.47所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID N0.48所示；所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。
4.根据权利要求3所述的一种指导噻嗪类利尿药用药的多重基因检测试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照品为上述10个与噻嗪类利尿药用药相关基因上的15个SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
5.上述的指导噻嗪类利尿药用药的多重基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)采集样本并提取核酸采集患者口腔拭子或血液样品，从中提取核酸； (2)以提取的核酸为模板进行PCR反应 取DNA样品2 μ L，10 X PCR缓冲液2 μ L，25mM的氯化镁3.4 μ L，PCR弓丨物溶液2 μ L，DNA聚合酶0.6 μ L，X溶液2 μ L，超纯水10 μ L混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件:95°C I分钟-M0C 30秒钟，60。。30秒钟，70。。I分钟，循环35次；70°C I分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID N0.47所示；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID N0.48所示；所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下10个与噻嗪类利尿药用药相关基因上的15个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1~N0.46所示； (3)毛细电泳分离样品 取PCR产物0.1-1 μ L，上样缓冲液38.75 μ L，DNA标准品0.5 μ L，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指导噻 嗪类利尿药用药相关基因的SNP位点的等位基因型。
【文档编号】C12N15/11GK103757109SQ201410014297
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】南丽, 吴勇, 吕军英, 陈燕芬 申请人:宁波海尔施基因科技有限公司