一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法
【专利摘要】本发明公开的一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，包括如下步骤，（1）以棘孢木霉菌质量浓度对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读取出的CT值为Y轴，绘制标准曲线；（2）将待测棘孢木霉菌接种于土壤中，接种后从土壤中提取出待测DNA并纯化；（3）用荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp的产物时，记录此时待测DNA的CT值，将该CT值带入标准曲线中，得到待测棘孢木霉的质量浓度对数值，根据公式计算出棘孢木霉菌在土壤中的定殖量。本发明的优点在于，摸索出棘孢木霉与其它木霉异源性的特异性区域DNA，能够准确地单一检测出棘孢木霉的量，采用的荧光定量PCR扩增方法，棘孢木霉菌在每个质量浓度下都有相对应的CT值，检测结果准确。
【专利说明】—种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测微生物定殖量的方法，具体一种检测棘孢木霉定殖量的方法。
【背景技术】
[0002]棘抱木霉是于1999 年由 Samuels et al.首次报道的一个木霉新种，我国是杨合同2005年首次作为新记录种进行报道。
[0003]一般是将棘孢木霉添加到作物根际土壤中，用来防治作物的枯萎病、根腐病、猝倒病等，但当棘孢木霉施入土壤中后，土壤中诸多非生物因子，如土壤中原有或人为施入的各种农药、化肥和有机质等，也势必影响外源施入棘孢木霉菌的定殖能力与存活期，导致其在土壤当中的繁殖能力得不到很好的检测，目前可以采用半选择性培养基(TSM培养基)，使用稀释分离法对土壤中的木霉进行平板分离计数检测，但得到的结果是土壤中整个木霉种群的数量，而不是棘孢木霉的数量。
【发明内容】
[0004]为解决现有技术中不能专一的检测出棘孢木霉的定殖量，本发明开发出一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量 的方法，使之实现即使在土壤中有很多影响因素，本发明能够做到单一检测出棘孢木霉定殖量的目的。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明开发出的一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，包括如下步骤，(I)以棘孢木霉菌质量浓度对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读取出的CT值为Y轴，绘制质量浓度对数与CT值的标准曲线:
①采用荧光定量PCR扩增方法将棘孢木霉特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp时，即得到棘孢木霉特异区DNA ；
②将棘孢木霉特异区DNA插入到感受态大肠杆菌载体PMDTM20-T-vector*l后，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，氨苄青霉素在LB培养基中的质量浓度为I μ I /ml,培养24h后，采用质粒试剂盒制备棘孢木霉菌特异区DNA质粒；
③将②步制备好的棘孢木霉菌质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度为2.8X 103ng/mL，然后用灭菌后的去离子水逐级稀释10倍，得到母液逐级稀释液；测得制备出的质粒质量浓度为2.8X103ng/mL，同时也说明了制备出的质粒纯度较高。
[0006]④经③步得到的逐级稀释液，采用荧光定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出126bp产物时，记录该CT值，以每级稀释液质量浓度对数值为X轴，CT值为Y轴，即绘制出质量浓度对数与CT值的标准曲线；荧光PCR仪会自动根据浓度、CT值关系绘制出标准曲线；
(2)将待测棘抱木霉囷接种于土壤中，接种后从土壤中提取出待测DNA并纯化；
(3)采用荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp的产物时，记录此时待测DNA的CT值，将该CT值带入到步骤(1)绘制出的标准曲线当中，得到待测棘孢木霉的质量浓度对数值，根据如下公式
【权利要求】
1.一种检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(I)以棘孢木霉菌质量浓度对数值为X轴，荧光PCR扩增仪读取出的CT值为Y轴，绘制质量浓度对数与CT值的标准曲线: ①采用荧光定量PCR扩增方法将棘孢木霉特异区DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp时，即得到棘孢木霉特异区DNA ； ②将棘孢木霉特异区DNA插入到感受态大肠杆菌载体PMDTM20-T-vector*l后，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，氨苄青霉素在LB培养基中的质量浓度为1μ I /ml，培养24h后，采用质粒试剂盒制备棘孢木霉菌特异区DNA质粒； ③将②步制备好的棘孢木霉菌质粒经紫外分光光度计A260定量，测得质粒母液质量浓度为2.8X 103ng/mL，然后用灭菌后的去离子水逐级稀释10倍，得到母液逐级稀释液； ④经③步得到的逐级稀释液，采用荧光定量PCR扩增法进行扩增，每级稀释液扩增出126bp产物时，记录该CT值，以每级稀释液质量浓度对数值为X轴，CT值为Y轴，即绘制出质量浓度对数与CT值的标准曲线； (2)将待测棘抱木霉囷接种于土壤中，接种后从土壤中提取出待测DNA并纯化； (3)采用荧光定量PCR扩增法对待测DNA进行扩增，当扩增出基因片段为126bp的产物时，记录此时待测DNA的CT值，将该CT值带入到步骤(1)绘制出的标准曲线当中，得到待测棘孢木霉的质量浓度对数值，根据如下公式
2.根据权利要求1所述检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)荧光定量PCR扩增方法所用的试剂包括12.5μ1的SYBR Premix Ex Taq、质量浓度均为lOMmol/L的正向引物、反向引物各?μ?、?μ1的棘孢木霉特异区DNA质粒溶液/待测棘孢木霉菌DNA溶液、超纯水补至25μ1。
3.根据权利要求2所述检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增方法采用的正向引物为5 ‘-CCAAACTCTTTCTGTAGTCCCC _3’，反向引物为5 GCATTTCGCTGCGTTCTT -3’。
4.根据权利要求1所述检测棘孢木霉菌在土壤中定殖量的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)荧光PCR定量扩增程序为，95°C预变性10s，60 °C退火15s，72°C延伸30s，循环45次，55°C再延伸10s。
【文档编号】C12Q1/06GK103667517SQ201410007526
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】贺字典, 高玉峰 申请人:河北科技师范学院