具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且具有高产孢能力的抗生素敏感性 ...的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了一种芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，所述芽孢杆菌属菌株的特征在于：(i)对氨苄西林(ampicillin)、万古霉素(vancomycin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)、四环素(tetracycline)以及氯霉素(chloramphenicol)具有敏感性；(ii)具有对抗大肠杆菌(E.coli)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的抗微生物活性；以及(iii)在孵育2天后进行测量时具有至少80％的产孢百分比。本发明进一步涉及一种用于选择这些菌株的方法。根据本发明的所鉴定出的菌株中的许多是菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株。所述解淀粉芽孢杆菌中的一些被进一步鉴定为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)，而其它被鉴定为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)。本发明的芽孢杆菌属菌株可以用作动物饲料的饲料添加剂，其中它具有益生作用。DSMZ 2584120120403DSMZ 2703220130321DSMZ 2703320130321DSMZ 2583920120403DSMZ 2584020120403
【专利说明】具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且具 有高产孢能力的抗生素敏感性芽孢杆菌属菌株
【技术领域】
[0001] 在动物饲料行业中将芽孢杆菌属菌种（Bacillus spp)用于益生菌解决方案，并 且基于芽孢杆菌的益生菌对于生产动物的生产和健康的积极作用是众所周知的（Spiehs 等，2008 ;Cutting，2011)。它们的使用与芽孢杆菌能够代替抗生素或减少抗生素的使用有 关，所述抗生素在动物饲料行业中被用作生长促进剂。
[0002] 然而，对针对常用于人类的抗生素不具有抗生素抗性的芽孢杆菌属菌株的需求仍 未得到满足。本发明提供了分离的芽孢杆菌属菌株，所述分离的芽孢杆菌属菌株的特征在 于对氨节西林（ampicillin)、万古霉素（vancomycin)、庆大霉素（gentamicin)、卡那霉素 (kanamycin)、链霉素（streptomycin)、红霉素（erythromycin)、克林霉素（clindamycin)、 四环素（tetracycline)以及氯霉素（chloramphenicol)具有敏感性并且还具有对抗诸如 大肠杆菌（E.coli)和产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)之类的主要病原体的抗 微生物活性。在第2天进行测量时，所述菌株进一步具有至少80%的产孢百分比，从而使得 有可能高效地生产安全并且有用的芽孢杆菌芽孢以用于动物饲料生产。
[0003] 本发明进一步涉及本发明的芽孢杆菌属菌株的芽孢用于生产动物饲料添加剂、特 别是用于猪和家禽的产品的用途，其中所述菌株具有益生（健康、饲料利用率以及生长促 进）作用。
【背景技术】
[0004] 猪，特别是仔猪，易患新生动物泄泻症，即腹泻，所述新生动物泄泻症可能由诸 如大肠杆菌（Escherichia coli/E.coli)以及A型和C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens/C. perfringens)之类的细菌所引起。如果不进行治疗，新生动物泄泻症可能 会导致死亡损失和严重的生产损失，包括体重减轻。
[0005] 大肠杆菌是仔猪腹泻的主要原因，并且在养殖场中所使用的抗生素中有50%至 75%是用来对抗断奶后腹泻，所述断奶后腹泻主要由大肠杆菌所引起。腹泻是断奶幼畜和 生长期幼畜（最多40 kg)所面临的最大问题，并且大肠杆菌是最重要的会引起腹泻的病原 体（Klose 等，2010)。
[0006] 猪的肠道梭菌感染主要在断奶前的时期出现，但还与在肥育期侵害猪的出血性肠 综合征有关。虽然针对C型产气荚膜梭菌进行免疫接种已极大地降低了断奶前死亡率，但 当前没有可商购的疫苗可供用于对抗A型产气荚膜梭菌。A型产气荚膜梭菌感染目前随着 断奶前猪的发病率不断增加而被重视，并且诊断和防治的方法与用于C型感染的诊断和防 治方法相比均不同且更为复杂。
[0007] 家禽的多种感染和疾病由包括大肠杆菌和产气荚膜梭菌在内的病原性细菌所引 起。由病原体所引起的感染和疾病会导致死亡率升高、性能下降以及生产成本增加。此外， 这些病原体中有许多可能会向人类传播。禽类大肠杆菌病是一种由大肠杆菌引起的全身感 染并且最常出现在年幼的肉仔鸡和幼禽中。
[0008] 益生菌在动物健康应用中被用以维持健康肠道微生物区系，包括减少诸如梭 状芽孢杆菌（Clostridia)和大肠杆菌之类的有害细菌以及增加诸如乳酸杆菌属菌种 (Lactobacillus spp.)和双歧杆菌（Bifidobacterium)之类的有益细菌。益生菌非常适合 于维持病原性细菌与有益细菌之间的健康平衡，这是因为不同于抗生素，它们不会不加区 别地破坏细菌，它们也不会产生病原性细菌的抗生素抗性菌株。认为益生菌通过以下多种 机制维持健康肠道微生物区系：竞争性排斥病原性细菌、经由产生抗微生物性物质来减少 病原性细菌、增强有益肠道微生物区系的生长和活力、以及刺激动物的全身性免疫应答。
[0009] 鉴于上述内容，期望用一种或多种芽孢杆菌属菌株来治疗或预防猪和家禽的因大 肠杆菌和/或梭状芽孢杆菌感染所致的疾病。
[0010] Guo等，2006描述了对作为潜在益生菌的芽孢杆菌属菌株进行的筛选以及在猪中 对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)MA139进行的测试。从肉仔鸡、猪、土壤、发酵食物以 及中草药中采集了 124个样品。从这些样品中分离出750种需氧型芽孢形成菌株。使用滤 纸片平板扩散测定法（disc plate diffusion assay)来测试针对大肠杆菌K88和K99、沙 门氏菌（Salmonella)以及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的抑制活性。测试 具有最佳活性的6种芽孢杆菌在模拟GIT条件（pH 2和0. 3%的胆汁盐）下的存活率。枯 草芽孢杆菌MA139是最佳的候选者并且在使用90头仔猪进行的28天饲喂试验中在仔猪中 对枯草芽孢杆菌MA139进行体内测试。ADG和饲料利用率提高。乳酸菌增加，粪便中的大肠 杆菌减少。然而，未测试对抗产气荚膜梭菌的抗微生物活性和对抗生素的敏感性。
[0011] Barbosa等，2005描述了从有机（接触土壤）养殖的肉仔鸡的粪便中分离出237种 芽孢杆菌。对31种分离株进行了表征。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌（B. Iicheniformis) 存在于这些当中。多种枯草芽孢杆菌菌株对产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌显示出抑制作 用。地衣芽孢杆菌还显示出对抗产气荚膜梭菌的作用。然而，所选的芽孢杆菌分离株中无 一种表现出如本申请中所定义的对抗大肠杆菌的抗微生物活性。所选择的一种芽孢杆菌分 离株对大肠杆菌菌株〇78:K80显示出生长强度降低作用，但未显示出完全的抑制作用，并 且未显示出对抗所测试的其它大肠杆菌菌株的作用（参见表5)。未提供有关孵育2天后的 产孢百分比或对万古霉素、卡那霉素、链霉素以及克林霉素的敏感性的数据。
[0012] Chaiyawan等，2010公开了一种芽孢杆菌属菌株菌种Τ3-1，所述芽孢杆菌属菌株 菌种Τ3-1对医疗中广泛使用的抗生素敏感并且显示出对抗产气荚膜梭菌ATCC 15191的抗 微生物活性。所述菌株不具有对抗大肠杆菌0157的抗微生物活性。未提供有关孵育2天 后的产孢百分比的数据。
[0013] Benitez等，2011最近描述了完整或失活的大肠杆菌的存在增强了解淀粉芽孢杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens)LBM 5006菌株对抗微生物肤的合成。
[0014] US 7, 754, 469涉及用于治疗家禽的微生物和方法，并且US 8, 021，654涉及使用 芽孢杆菌属菌株治疗猪的方法。
[0015] 然而，在这些文章或专利中没有一篇中存在任何有关选择如下芽孢杆菌属菌株的 描述或建议，所述芽孢杆菌属菌株对常用于人类的抗生素具有敏感性，具有对抗产气荚膜 梭菌和大肠杆菌这两者的抗微生物活性并且具有高产孢百分比，以使得所述菌株可用于高 效产孢并且因此可用于芽孢杆菌属益生菌生产。
[0016] 现有技术文献（例如 Barbosa 等，2〇〇5 ;Chaiyawan 等，2〇10 ;以及 Guo 等，2〇〇6) 中没有一篇公开了对常用于人类的抗生素具有敏感性、具有在抑制生长的意义上对抗产气 荚膜梭菌和大肠杆菌这两者的抗微生物活性并且具有高产孢百分比的菌株。
[0017] 综上所述，与筛选芽孢杆菌属菌株有关的现有技术并未提供本发明的三个区别特 征，即对常用于人类的抗生素具有敏感性、具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物 活性以及具有高产孢百分比。现有技术也并未提供满足这三个标准的芽孢杆菌属菌株。
【发明内容】
[0018] 本发明所要解决的问题在于提供一种芽孢杆菌属菌株，所述芽孢杆菌属菌株的特 征在于对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及 氯霉素具有敏感性；具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性；并且在第2天进 行测量时具有至少80 %的产孢百分比。
[0019] 所述解决方案是基于一种由本申请的发明人所研发的用于鉴定具有这些改良特 性的经过改良的芽孢杆菌属菌株的选择方法。
[0020] 所述选择方法的第一个必要步骤是特异性地筛选对常用于人类的抗生素具有敏 感性的芽孢杆菌属菌株。更确切地说，针对于对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、 链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素的敏感性来对所述菌株进行筛选。
[0021] 此外，针对于对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性和在第2天测量时具 有至少80%的产孢百分比对所述菌株进行筛选。
[0022] 在本申请的发明人所研究的来自土壤和粪便以及食物来源的261种分离株当 中，有161种分离株在实施例中所描述的预筛选测试中具有抗生素抗性。在对抗生素具 有敏感性的100种分离株当中，有56种具有对抗产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且仅 22种具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌这两者的作用。在这些当中，有12种分离株来 自于菌种解淀粉芽孢杆菌。其它代表性菌株来自于菌种枯草芽孢杆菌和莫哈韦芽孢杆菌 (B. mojavensis)。表2和3汇总了科汉森公司（Chr. Hansen)专有菌株（被选用于二次筛 选的32种菌株中的22种）的结果。
[0023] 所述选择方法侧重于（i)安全性、（ii)作用以及（iii)在适用于生产的培养基中 的高产孢能力。所述安全性方面主要是基于不存在抗生素抗性，由于在人类中抗性细菌的 病例不断增多，因而这点是重要的。这些细菌会引起因病原性细菌已具有抗性而不再能够 用抗生素治疗的公知疾病。
[0024] 众所周知的是，芽孢杆菌能够产生可能具有抗微生物活性的物质，如即细菌素 (bacteriocin)、溶细菌酶（bacteriolytic enzyme)或表面活性素（surfactin)。所述第 二个选择标准，即对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的作用是重要的，这是因为这两种病原体 是猪和家禽腹泻的主要原因。测试对抗大肠杆菌的三种菌株和对抗A型产气荚膜梭菌的作 用，但在此考虑了所述结果指示了对抗大肠杆菌的一般作用以及对抗诸如C型产气荚膜梭 菌之类的另外其它类型梭状芽孢杆菌的作用。
[0025] 所述第三个选择标准对于生产益生菌来说是重要的。所述生产过程在培养所述芽 孢杆菌的发酵罐中进行并且在所述过程结束时，高生产效益需要高产孢速率。芽孢杆菌的 产孢过程多年来一直被研究，但仍存在许多问题。因此，从事芽孢杆菌的生产和工艺研发的 本领域技术人员公知的是一些芽孢杆菌属菌株具有非常低的产孢速率。已表明，芽孢杆菌 分化成特化细胞的亚群，如即形成芽孢的群落、产生用于降解复合营养物质的酶的群落以 及死亡的群落（Lopez和Kolter, 2010)。这种分化似乎是受细胞外信号调控的，这些信号中 的大部分是由芽孢杆菌本身产生的。因此已假设的是，酶或抗微生物性物质的大量产生可 能引起低产孢功效。因此，对于本领域普通技术人员来说不寻常的并且惊人的是，芽孢杆菌 属菌株兼具抗微生物活性和高产孢百分比。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1示意性地示出了 261种芽孢杆菌属菌株的抗微生物活性。惊人的是，许多解 淀粉芽孢杆菌菌株具有抗微生物作用。
【具体实施方式】
[0027] 在2006年抗生素生长促进剂在欧盟（European Union)的逐步停用使得对具有 高功效的有成本效益的饲料添加剂的需求不断增长，并且因此使得对新型益生菌的需求也 不断增长。基于芽孢杆菌的益生菌饲料添加剂因其对猪和家禽的健康和生产的积极作用 而被人们所知。这些产品适用于饲料行业，这是因为芽孢具有热稳定性并且能够在高达 90°C -95°C的温度下进行的制粒过程中存活下来。
[0028] 用于猪的益生菌对于动物、人类以及环境来说必须是安全的，并且应当促进动物 的生长和饲料利用率。本发明的目的在于以三个步骤对来自不同来源的广泛的需氧型内 生芽孢形成细菌（AEB)针对它们在猪中的益生作用进行筛选。所述AEB是从发酵食物 (Kantong (-种酱汁）和Gergoush (-种自然发酵的苏丹面包点心）初级起子）、猪粪便、土 壤以及不同的培养物收藏物中分离出的。通过对16SrDNA基因进行测序鉴定出261种AEB 分离株，并且通过测定多种相关抗生素的最低抑制浓度（MIC)来对所述AEB分离株的相关 抗生素抗性进行研究。
[0029] 进一步的分析包括对胆汁和酸的耐受性、病原体抑制作用、在不同培养基中的生 长、产孢能力以及与动物细胞系的相互作用以评估对肠道系统中的紧密连接产生积极作 用的可能性。结果显示在菌种和菌株这两者之间存在很大的差异。分离的菌种主要属 于芽孢杆菌属，包括来自食物来源的解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及沙福芽孢杆菌 (B. safensis);来自粪便的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌（B. pumilus)、解淀粉芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌（B. megaterium);以及来自土壤的地衣芽孢杆菌和简单芽孢 杆菌（B. simplex)。
[0030] 这些分离株中有许多显示出不希望有的高于由欧洲食品安全局（EFSA)所界定的 分界点的抗生素抗性并且由于安全性问题而被舍弃。当在小牛浸液肉汤中培养过夜时，对 于大部分的菌株观测到良好的生长，而16%在适用于发酵的培养基中的生长不令人满意。 在所述筛选方法的第2步骤中，通过对gyrB基因进行测序并且进行PFGE指纹图谱分析鉴 定出32种所选择的不具有抗生素抗性的菌株。此外，对它们对所选择的病原体的抗微生物 作用进行了测试并且在各分离株之间观测到相当大的差异。所述分离株中的多种显示出对 产气荚膜梭菌的抑制作用，而仅有几种分离株抑制大肠杆菌。本发明的结果因此确认对产 气荚膜梭菌和大肠杆菌这两者生长的抑制作用只在极少的情况下会同时存在。所述筛选方 法的第3步骤涉及具有高病原体抑制作用的10种菌株并且包括测定芽孢的热稳定性、基因 组测序以及证实它们对紧密连接的作用的进一步体外研究。
[0031] 本发明提供了特征在于以下的芽孢杆菌属菌株：（i)对氨苄西林、万古霉素、庆大 霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氣霉素具有敏感性。
[0032] 术语"对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四 环素以及氯霉素具有敏感性"意指被认为对特定抗生素敏感的菌株在表1中所概述的由 EFSA(EFSA，2008)所给出的分界点水平一定不能生长。
[0033] 表1中所概述的MIC值是基于由EFSA所发布的准则（Technical guidance prepared by the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP) on the update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human and veterinary importance (由 用于动物饲料中的添加剂和产品或物质方面的专家组（FEEDAP)所制定的有关用于评估 细菌对具有人类和兽医学重要性的抗生素的抗性的标准更新的技术指导）。The EFSA Journal (2008)732, 1-15)提供了抗生素和针对芽孢杆菌属的可接受的分界值的列表。EFSA 未给出针对芽孢杆菌的氨苄西林分界点，然而存在针对多种其它细菌（即乳酸杆菌属菌 种）的分界点。因此，选择芽孢杆菌属菌株对氨苄西林的这种敏感性作为用于本发明的分 界点。
[0034] 表1 :常用于人类的多种抗生素的EFSA分界点
[0035]
【权利要求】
1. 一种芽孢杆菌属（Bacillus)菌株，所述菌株的特征在于： (i) 对氣节西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以 及氯霉素具有敏感性； (ii) 具有对抗大肠杆菌（E.coli)和产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)的抗 微生物活性；以及 (iii) 在孵育2天后进行测量时具有至少80%的产孢百分比。
2. 如权利要求1所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株选自由菌种解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、萎缩芽抱杆菌（Bacillus atrophaeus)、甲基营养型芽抱 杆菌（Bacillus methylotrophicus)、西姆芽抱杆菌（Bacillus siamensis)、死谷芽抱杆菌 (Bacillus vallismortis)组成的组或由菌种莫哈韦芽抱杆菌（Bacillus mojavensis)、枯 草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis)组成的组。
3. 如权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株是莫哈韦芽孢杆菌。
4. 如权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株是解淀粉芽孢杆菌。
5. 如权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株是枯草芽孢杆菌。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株选自由以下各项组 成的组： (a) 具有保藏号DSM 25839的莫哈韦芽孢杆菌菌株CHCC 15510 ; (b) 具有保藏号DSM 25840的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15516、具有保藏号DSM 27032 的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15536以及具有保藏号DSM 27033的解淀粉芽孢杆菌菌株 CHCC 15539;以及 (c) 具有保藏号DSM 25841的枯草芽孢杆菌菌株CHCC 15541 ; 以及（a)、（b)或（c)的突变株。
7. -种用于选择具有以下特征的芽孢杆菌属菌株的方法： (i) 对氣节西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以 及氯霉素具有敏感性； (ii) 具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性；以及 (iii) 在孵育2天后进行测量时具有至少80%的产孢百分比， 所述方法包括以下步骤： (i) 从芽孢杆菌属菌株池中选择并且分离对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、 链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氣霉素具有敏感性的牙抱杆囷属囷株， (ii) 从芽孢杆菌属菌株池中选择并且分离具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微 生物活性的芽孢杆菌属菌株， (iii) 从芽孢杆菌属菌株池中选择并且分离在孵育2天后进行测量时具有至少80%的 产孢百分比的芽孢杆菌属菌株， (iv) 针对营养细胞在pH 4的敏感性对芽孢杆菌属菌株池进行测定，以及 (v) 针对胆汁抗性对芽孢杆菌属菌株池进行测定。
8. -种用于获得以下菌株的突变株的方法： (a) 具有保藏号DSM 25839的莫哈韦芽孢杆菌菌株CHCC 15510 ; (b) 具有保藏号DSM 25840的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15516、具有保藏号DSM 27032 的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15536或具有保藏号DSM 27033的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15539 ;或 (c)具有保藏号DSM 25841的枯草芽孢杆菌菌株CHCC 15541 ; 所述方法包括： 任选地对所述菌株进行诱变处理，以及 选择具有以下特性的突变株： (i) 对氣节西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以 及氯霉素具有敏感性； (ii) 具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性，以及 (iii) 在孵育2天后进行测量时具有至少80%的产孢百分比。
9. 一种芽孢杆菌组合物，所述芽孢杆菌组合物包含至少一种如权利要求1至5中任一 项所述的芽孢杆菌属菌株的细胞。
10. 如权利要求9所述的芽孢杆菌组合物，所述芽孢杆菌组合物包含至少两种如权利 要求1至5中任一项所述的菌株的细胞。
11. 如权利要求9或10所述的芽孢杆菌组合物，所述芽孢杆菌组合物包含至少三种如 权利要求1至5中任一项所述的菌株的细胞。
12. 如权利要求9至11中任一项所述的芽孢杆菌组合物，其中所述芽孢杆菌属菌株的 细胞是芽孢。
13. -种用于生产动物饲料或预混合料的方法，所述方法包括将如权利要求10至12中 任一项所述的芽孢杆菌组合物添加至动物饲料中。
14. 一种用于饲喂动物的方法，所述方法包括向动物施用如权利要求9至12中任一项 所述的芽孢杆菌组合物或根据如权利要求13所述的方法所生产的动物饲料或预混合料。
15. 如权利要求14所述的用于饲喂动物的方法，其中所述动物是选自由以下各项组成 的组的动物：家禽、反当动物、小牛、猪、兔、马、鱼以及宠物。
【文档编号】C12R1/07GK104487566SQ201380019655
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年4月11日 优先权日:2012年4月13日
【发明者】B·尼尔森, 梅泰·戴尼斯·康托, 斯图-劳里森 柏姬, 帕特里克·德克斯, E·约翰森 申请人:科.汉森有限公司