植物中雄性育性的遗传减少的利记博彩app

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【专利摘要】本发明提供了遗传雄性不育植物，在所述遗传雄性不育植物中补充构建体从而产生对所述子代中的亲本表型的抑制。提供了产生和保持此类植物的方法以及使用所述植物的方法，包括使用亲本植物以产生不育植物以用于杂交种子生产。
【专利说明】植物中雄性育性的遗传减少
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求提交于2012年3月13日的美国临时专利申请61/610,243、提交于 2013年3月12日的PCT申请PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12日的PCT申请 PCT/US2013/30455的优先权和权益，其公开内容据此以引用方式并入。

【技术领域】
[0003] 本发明整体涉及分子生物学领域，具体地讲涉及植物育性的调节以提高植物胁迫 耐受性。
[0004] 背景信息
[0005] 许多植物的驯化已与产量显著增加相关。天然群体中发生的大多数表型变异是连 续的并且受多种基因影响的作用。对造成驯化植物中产量显著不同的特定基因的识别已成 为农业研究的重要焦点。
[0006] 植物在发育生命周期期间在各种植物组织间分配光合产物、矿质营养和其他生长 组分。在玉蜀黍中，例如，穗和穗丝为共享某些发育过程并且相互竞争所需营养物质的特定 雌性和雄性花序结构。穗丝顶端显性可限制玉蜀黍植物中的穗生长和谷粒产量潜力，本文 公开了提高谷粒产量的方法和组合物。


【发明内容】

[0007] -种用于增加植物中的产量或维持产量稳定性的方法，该方法包括减少雄性育 性，从而在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。在一个实 施例中，通过改变遗传雄性育性基因的表达或活性来减少植物中的雄性育性。在一个实施 例中，植物在非生物胁迫下生长。在一个实施例中，营养物质限定为氮。在一个实施例中， 具有减少的雄性育性的植物具有选自如下的农学参数：增大的SPAD值、增加的抽穗丝、增 加的穗长度、增加的穗宽度、增加的每个穗的种子数、增加的每个穗的种子重量和具有增加 的胚尺寸的种子。在一个实施例中，植物在干旱胁迫下生长。在一个实施例中，通过雄性不 育来提高植物的耐旱性。
[0008] -种用于增加玉蜀黍植物中的产量或维持产量稳定性的方法，该方法包括减少雄 性育性，从而在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。在一 个实施例中，植物包含导致显性遗传雄性不育的核基因中的突变。
[0009] 在一个实施例中，本文公开的植物的雄性育性通过表达编码SEQ ID N0S:14或 153的多肽的多核苷酸而减少。在一个实施例中，多核苷酸选自SEQ ID NOS :13、15和152。
[0010] 在一个实施例中，雄性育性在选自 SEQ ID NO :64-106、134、137、142、143、144、149 和150的调控元件下通过表达抑制穗丝的核酸而减少。
[0011] 在一个实施例中，雄性育性在选自 SEQ ID N0 :64-106、134、137、142、143、144、149 和150的调控元件下通过表达核酸而减少，所述核酸抑制编码SEQ ID NO :107的氨基酸序 列的多核苷酸的表达。
[0012] 在一个实施例中，雄性育性通过表达编码多肽的核酸而减少，所述多肽具有对应 于SEQ ID N0:14的第37位氨基酸的突变，其中多肽选自SEQ ID N0:14、108-130。在一个 实施例中，突变导致信号肽的不当加工。
[0013] 在一个实施例中，表现出减少的雄性育性的植物为玉蜀黍非转基因植物。在一个 实施例中，雌性组织发育为玉蜀黍中的穗发育。
[0014] 在一个实施例中，导致减少的雄性育性的突变在植物的内源育性基因中进行改 造。
[0015] 一种在具有第一玉蜀黍植物群体的田地中增加玉蜀黍产量的方法，该方法包括在 田地中栽培玉蜀黍植物群体，其中玉蜀黍植株由于存在包含SEQ ID N0 :14或其同系物的氨 基酸序列的多肽而表现出显性雄性不育，并且其中所述田地还包含第二玉蜀黍植物群体， 所述第二玉蜀黍植物群体产生有效量的花粉以使田地中的第一玉蜀黍植物群体受精，从而 相较于不包含第一植物群体的对照田地产量增加。在一个实施例中，第一植物群体包括田 地中玉蜀黍植株的约50%至约90%。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植 株的约80%。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约75%。在一个实 施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约85 %。在一个实施例中，第一植物群体包 括田地中玉蜀黍植株的约70%。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的 约95 %。在一个实施例中，所得的子代是可育的。
[0016] 在田地中生长的玉蜀黍植物群体，其中玉蜀黍植物群体包括具有减少的雄性育性 的第一亚群体和表现出正常的雄性育性的第二亚群体，其中所述玉蜀黍植物群体产生与对 照植物群体相比增加的谷粒产量。在一个实施例中，种子由玉蜀黍植株产生，其中所述种子 产生可育的植株。
[0017] 一种具有多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸引发植物细胞中的转录并且 包括选自如下的序列：
[0018] a. SEQ ID N0 :13 和 62、SEQ ID N0 :64-106、134、137、142、143、144、149 和 150 的 启动子区；
[0019] b. SEQ ID N0 :13、62、64-106、134、137、142、143、144、149 和 150 的至少 100 个连 续核苷酸；以及
[0020] c.与 SEQ ID N0 :13、62、64-106、134、137、142、143、144、149和150的全长具有至 少70%序列同一性的核苷酸序列。
[0021] 表达盒具有引发如本文所公开的转录并且可操作地连接到目的多核苷酸的多核 苷酸。在一个实施例中，载体包括本文所述的表达盒。在一个实施例中，植物细胞已将本文 所述的表达盒稳定掺入到其基因组中。在一个实施例中，植物细胞来自单子叶植物。在一 个实施例中，单子叶植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、裸麦、高粱或水稻。
[0022] 在一个实施例中，包括已将本文所述的表达盒稳定掺入到其基因组中的植物。在 一个实施例中，植物为单子叶植物。在一个实施例中，植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、裸 麦、高粱或水稻。
[0023] 公开了本文所述的植物的转基因种子。在一个实施例中，公开了编码基因产物的 多核苷酸，所述基因产物赋予病原体或昆虫抗性。
[0024] 在一个实施例中，植物还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽涉及营养物质吸收、 氮利用效率、耐旱性、根强度、根耐倒伏性、土壤害虫管理、玉米根虫抗性、碳水化合物代谢、 蛋白质代谢、脂肪酸代谢或植物激素生物合成。
[0025] -个单位玉蜀黍种子，其包括一部分为转基因的雄性不育种子和一部分为转基因 的雄性可育种子，其中雄性不育转基因种子与该单位中总玉蜀黍种子的比例在约50%至约 95%的范围内。在一个实施例中，一个单位为一袋玉蜀黍种子。
[0026] 玉蜀黍种子的种子混合物，其包括一部分为转基因的雄性不育种子和一部分为转 基因的雄性可育种子，其中雄性不育转基因种子与该单位中总玉蜀黍种子的比例在约50% 至约95%的范围内。在一个实施例中，种子混合物在一袋玉蜀黍种子中。在一个实施例中， 雄性不育种子在单独的袋中。在一个实施例中，雄性不育种子与雄性可育种子在相同的袋 中混合。
[0027] 在一个实施例中，雄性育性基因编码SEQ ID N0 :10的蛋白质。在一个实施例中， 雄性育性基因包括SEQ ID N0:13的核苷酸序列。在一个实施例中，雄性育性基因编码SEQ ID N0 :14的多肽。
[0028] 在一个实施例中，雄性育性的减少或使植物雄性不育通过在相对于SEQ ID N0 :13 的第一 Met密码子的第118位从G变为A的单个核苷酸置换来实现，得到在第37位氨基酸 处的氨基酸改变，在预测的蛋白质中从丙氨酸变为苏氨酸。在一个实施例中，雄性育性的减 少或使植物雄性不育通过在相对于SEQ ID NO :2629的第一 Met密码子的第119位从C变 为T的单个核苷酸置换来实现，得到在第37位氨基酸处的氨基酸改变，在预测的蛋白质中 从丙氨酸变为缬氨酸。在一个实施例中，显性雄性育性基因可操作地连接到选自如下的启 动子：诱导型启动子、组织优选的启动子、时间调节型启动子或它们的元件。例如，启动子优 先地驱动雄性生殖组织中的表达。
[0029] 在一个实施例中，雄性育性在育种对的雌性植物（例如，雌性自交系）中减少。
[0030] 在一个实施例中，一种植物或细胞或种子或它们的子代，其包括减少的编码其基 因组中的SEQ ID N0 :10的第43-101位氨基酸序列的雄性育性序列，并且其中该雄性育性 基因的表达赋予显性雄性不育性状。
[0031] 分离的核酸分子包括能够引发植物细胞中的转录的多核苷酸并且包括选自如下 的序列：SEQ ID NO :15、SEQ ID N0 :15的至少100个连续核苷酸，以及与SEQ ID N0 :15的 全长具有至少70%序列同一性的序列。在一个实施例中，表达盒或载体包括本文公开的可 操作地连接到目的多核苷酸的SEQ ID N0 :15。
[0032] 适用于本文公开的材料和方法的植物包括，例如，玉米、高粱、卡诺拉油菜、小麦、 大麦、裸麦、黑小麦、水稻、甘蔗、草坪草、珍珠粟、大豆、棉花。
[0033] 在一个实施例中，具有减少的育性或本文公开的任何其他性状的植物任选地具有 赋予以下目的表型或性状的一种或多种多核苷酸：营养物质吸收、氮利用效率、耐旱性、根 强度、根耐倒伏性、土壤害虫管理、玉米根虫抗性、除草剂耐性、抗病性、昆虫抗性、碳水化合 物代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢或植物激素生物合成。
[0034] 一种增加植物中的产量或维持产量稳定性的方法，包括通过如下方式减少雄性生 殖组织发育：在雄性生殖组织优选的启动子的控制下表达转基因；以及在雄性和雌性组织 同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。
[0035] 在一个实施例中，雄性生殖组织为穗丝。在一个实施例中，雄性生殖组织发育通过 表达可操作地连接到启动子的基因而减少，所述启动子包括选自列表SEQ ID NO :64-106的 序列的至少100个连续核苷酸。本文公开的启动子序列的子集，例如，SEQ ID NO :64-70、 70-75、75-80、85-90、90-95、100-106同样适用于驱动本文公开的目的多核苷酸的组织优选 的表达。
[0036] 在一个实施例中，在本文公开的穗丝优选的启动子的控制下转基因地表达目的多 核苷酸（例如，具有显性雄性不育突变的Ms44)的植物或植物细胞或种子表现出提高的农 学参数，诸如在生殖发育期间增加分配至穗的营养物质。
[0037] -种包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸引发植物细胞中的转录并且 包括选自如下的序列：
[0038] 选自 SEQ ID NO :64-106 的序列；
[0039] 选自SEQ ID NO :64-106的序列的至少100个连续核苷酸，以及
[0040] 与选自SEQ ID NO :64-106的序列的全长或与其子启动子区具有至少
[0041] 70%至约95%序列同一丨生的序列。
[0042] 在一个实施例中，在本文公开的穗丝优选的启动子的控制下转基因地表达目的多 核苷酸（例如，靶向涉及穗丝发育的多核苷酸的RNAi抑制序列）的植物或植物细胞或种子 表现出提高的农学参数，诸如在生殖发育期间提高分配至穗的营养物质。
[0043] 一种增加植物中产量或维持产量稳定性的方法，包括减少雄性育性，并且在雄性 和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。在一个实施例中，通过改 变遗传雄性育性基因的表达来减少植物中的雄性育性。在一个实施例中，植物在胁迫下生 长。在一个实施例中，植物在营养物质限制条件，例如减少的可用氮下生长。
[0044] 在一个实施例中，具有减少的雄性育性并且其中营养物质在雄性和雌性组织同时 发育期间更多地分配至雌性生殖组织的植物表现出以下农学相关参数中的一者或多者：增 大的SPAD值、增加的抽穗丝、增加的穗长度、增加的穗宽度、增加的每个穗的种子数、增加 的每个穗的种子重量和增加的胚尺寸。
[0045] 在一个实施例中，具有减少的雄性育性并且其中营养物质在雄性和雌性组织同时 发育期间更多地分配至雌性生殖组织的植物在干旱胁迫下生长。在一个实施例中，通过雄 性不育来提高植物的耐旱性。
[0046] 分离的核酸分子包含以组织优选的方式引发植物细胞中的转录的多核苷酸，并且 包括来自以下序列的序列：
[0047] SEQ ID N0 :13、62 和 64-106 ;
[0048] SEQ ID N0 :13、62和64-106的至少100个连续核苷酸；以及
[0049] 与SEQ ID N0S :13、62和64-106的全长具有至少70%序列同一性的序列。
[0050] 在一个实施例中，一种在胁迫下增加植物中产量稳定性的方法，包括在本文公开 的穗丝优选的启动子下表达影响雄性育性的元件从而减小在植物生殖发育阶段期间对营 养物质的竞争，并且其中产量增加。
[0051] 一种在氮限制条件和/或正常氮条件下增加植物中产量或维持产量稳定性的方 法，包括减少雄性生殖组织发育并且增加在雄性和雌性组织同时发育期间分配至雌性生殖 组织的营养物质。
[0052] 在一个实施例中，雄性生殖组织为穗丝并且雄性生殖组织发育通过减少NIP3-1 或NIP3-1类蛋白质的表达来减少。在一个实施例中，NIP3-1蛋白质具有SEQ ID N0:107 的氨基酸序列。雄性生殖组织发育通过增加 SEQ ID NO :63的表达来减少。
[0053] 在一个实施例中，雄性生殖组织发育通过影响涉及穗丝形成的基因、例如无穗丝 基因的功能而减少。
[0054] 在一个实施例中，雄性生殖组织发育在用靶向基因的抑制的表达盒转化的植物中 减少，所述基因编码SEQ ID N0:107的氨基酸序列或与SEQ ID N0:107具有至少70%或 80 %或85 %或90 %或95 %同一性的序列。本文还公开了在T1 s 1等位基因中具有天然突变 的植物。
[0055] 在一个实施例中，启动子优先地驱动雄性生殖组织中目的基因的表达。在一个实 施例中，启动子为组织特异性启动子、组成型启动子或诱导型启动子。在一个实施例中，组 织优选的启动子为穗丝特异性启动子。
[0056] -种包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸包括选自如下的序列：SEQ ID NO :63 ;SEQ ID N0 :63的至少100个连续核苷酸，以及与SEQ ID N0 :63的全长具有至 少70%序列同一性的序列。分离的核酸分子包括编码TLS1蛋白质的多核苷酸，所述多核苷 酸包括SEQ ID N0:107的氨基酸序列或与SEQ ID N0:107具有至少70 %或80 %或85 %或 90 %或95%同一性的序列。
[0057] -种用于产生雄性不育杂交种子的方法，包括转化对于具有基因构建体的显性雄 性不育为杂合的雌性自交系，所述基因构建体包括抑制显性雄性不育表型的元件、破坏花 粉功能的第二元件，以及任选地选择性标记，其中在自交系中表达构建体使雄性系可育。在 一个实施例中，该方法还包括对这些雄性可育植物自花授粉并且产生为显性雄性不育的纯 合子代。该方法还包括鉴别具有雌性自交系的纯合显性雄性不育基因型的那些种子；任选 地通过与转基因保持系杂交来增加雌性自交系，得到无构建体的100%纯合显性雄性不育 种子；以及将显性雄性不育种子的子代与雄性亲本杂交以产生对于显性雄性不育为杂合的 杂交体并且显示显性雄性不育表型。
[0058] 在一个实施例中，显性雄性不育表型由多核苷酸序列赋予，所述多核苷酸序列包 括SEQ ID N0 :15的至少100个连续核苷酸并且还包括在第109至111位的密码子，其编码 苏氨酸来替代SEQ ID N0 :14的第37位的丙氨酸（由SEQ ID N0 :15编码的氨基酸序列）。
[0059] 在一个实施例中，抑制元件包括对于SEQ ID N0 :15是特异性的启动子反向重复序 列。在一个实施例中，反向重复序列包括SEQ ID N0 :15的至少100个连续核苷酸的功能片 段。在一个实施例中，抑制元件为设计用于抑制显性Ms44基因在雄性不育雌性自交系中的 表达的RNAi构建体。在一个实施例中，抑制元件为以显性方式起作用以抑制植物中Ms44 突变的显性表型的遗传抑制因子。任选地，如果内源的正常ms44也受到抑制元件抑制，则 构建体可包括恢复ms44基因、例如在其自身启动子或异源启动子控制下的ms44基因的正 常功能的元件。
[0060] 在一个实施例中，公开了从本文所公开的方法得到的植物或植物细胞或种子或植 物的子代。
[0061] 在一个实施例中，用于产生杂交种子的方法包括在雌性自交系中表达可操作地连 接到异源启动子的适于反向重复失活的显性雄性不育基因；用来自雄性可育植物的花粉对 雄性不育植物授粉，所述雄性可育植物包含对于异源启动子是特异性的反向重复。在一个 实施例中，花粉包含对具有反向重复失活特异性的异源启动子是特异性的反向重复。在一 个实施例中，显性雄性不育基因连接至水稻5126启动子。
[0062] 在一个实施例中，在杂交种子生产的上下文中使用的显性雄性不育基因为以显性 方式起作用以实现雄性不育并且任选地适于抑制以维持雄性不育雌性自交系的任何基因。 在一个实施例中，显性雄性不育基因选自：芽孢杆菌RNA酶、DAM甲基化酶、MS41和MS42。

【专利附图】

【附图说明】
[0063] 图1-产生雄性不育杂交植物的遗传显性雄性不育体系的图。已发现可利用显性 核雄性不育基因、穗丝特异性或穗丝优选的启动子和穗丝特异性或穗丝优选的基因中的一 种或多种的植物中的雄性育性的遗传减少可增加穗组织发育、提高正在生长的植物中的营 养物质利用率、增加胁迫耐受性和/或增加种子度量值，最终得到提高的产量。
[0064] 图2-MS44相关序列的比对（图2A-C)。相同的残基以粗体示出并且所有相似的残 基以下划线和斜体示出。
[0065] 图3-利用隐性雄性不育基因产生雄性不育杂交植物的方法的图。雌性亲本和雄 性亲本均具有赋予不育性的纯合隐性等位基因。然而，雄性亲本使恢复等位基因在构建体 内，其防止恢复等位基因通过花粉传递。所得的杂交种子产生雄性不育的杂交植物。
[0066] 图4-用于利用下述显性雄性不育基因产生雄性不育杂交种子的方法的图：
[0067] M-对于显性雄性不育为杂合的雌性自交系用基因构建体转化，所述基因构建体 包括抑制显性雄性不育的元件、破坏花粉功能的第二元件，以及任选地选择性标记。该构造 体在自交系中的表达使植物雄性可育。
[0068] 迎-植物自花授粉以产生种子。
[0069] 4C和4D-对种子或子代棺物讲行基因分型以鉴别对于显件雄件不育为纯合的那 些。
[0070] 4E-雌性自交系可通过将其与转基因保持系杂交而增加，得到100%纯合显性雄 性不育种子。
[0071] 4E-显性雄性不育植物由第二自交系授粉以产生对于显性雄性不育为杂合并且表 现出显性雄性不育表型的杂交体。
[0072] 图5-图5A示出了响应于氮肥力的MS44杂交体产量-试验1。图5B示出了响应 于氮肥力的MS44杂交体产量-试验2。
[0073] 图6示出了与野生型相比较的MS44杂交体穗干重（R1)。
[0074] 图7-图7A示出了响应于植物群体的MS44杂交体产量-试验1。图7B示出了响 应于植物群体的MS44杂交体产量-试验2。
[0075] 图8示出了 tlsl突变表型。A)来自野生型植物的穗丝。B)具有小的穗丝表型的 纯合tlsl植物。C)不具有穗丝的纯合tlsl植物。D)具有最严重表型的植物往往具有带 长壳并且不抽穗丝的多个穗（箭头）。E)穗表型的范围。F)叶表型的范围。WT=纯合野 生型植物；ST =具有小的穗丝的纯合tlsl植物；NT =不具有穗丝的纯合tlsl植物。
[0076] 图9示出了 tlsl的基于图谱的克隆。
[0077] 图10示出了 tlsl候选基因验证。ZmNIP3_l的敲除得到tlsl表型。图10A-具有 完整ZmNIP3-l的野生型植物。图10B-在ZmNIP3. 1中具有Mu-插入的植物表现出tlsl表 型。
[0078] 图11示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗丝分枝数。
[0079] 图12示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗丝分枝长度。
[0080] 图13示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗长度。
[0081] 图14示出tlsl植物较不易受50ppm硼的硼毒性条件影响。图14A-并列放置纯 合tlsl植物和野生型植物，其中突变型植物看起来更高和更大。图14B-在野生型植物中， 第二嫩的完全张开的叶的节在最嫩的完全张开的叶的节的上方延伸，然而突变型植物看起 来是正常的。图14C-突变型的最嫩的完全张开的叶比野生型更宽。
[0082] 图15示出了 ZmNIP3-l类似于硼通道蛋白。图15A-系谱树示出ZmNIP3. 1与已被 表征为硼通道蛋白的0sNIP3. 1和AtNIP5. 1(突出显示的）密切相关。图15B-在图15A中 突出显示的蛋白质序列的比对；ZmNIP3. 1与0sNIP3. 1和AtNIP5. 1的百分比同一性分别为 84. 4 和 67. 3。
[0083] 图16-来自所选物种的Ms44序列。在该比对中，Ms44显性多肽序列的氨基酸突变 在第42位以粗体和下划线示出，如MS44dom等位基因中的T(SEQ ID N0:14)或Ms44-2629 等位基因中的V(SEQ ID NO :153)，其中所有其他序列在该位置具有A。
[0084] 发明详述
[0085] 提交于2013年3月12日的PCT申请PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12 日的PCT申请PCT/US2013/30455的内容和公开内容以全文引用方式并入本文。与雄性育 性相关的方法及其实施例以引用方式并入本文。
[0086] 氮利用效率（NUE)基因影响产量并对改善氮在作物（特别是玉蜀黍）中的利用具 有实用性。氮使用效率增加可由增加的对氮肥的吸收和同化和/或对积聚的氮储备的后续 再动员和再利用，以及植物对诸如低氮环境之类的胁迫情况的耐受性增加得到。基因可用 于改变植物的遗传组成，从而使得它们在当前的肥料施用标准下更高产或在肥料显著减少 或氮可用量显著减少的情况下保持它们的产出率。在氮肥获得受限的发展中国家和在氮使 用水平保持较高的发达国家，改善玉米中的NUE都将会增加每单位投入氮肥的玉米可收获 产量。氮利用改善还使得能降低在农场上的投入成本，降低对氮肥生产所需的非可再生能 源的使用和依赖，以及减少氮肥生产和农业利用的环境影响。
[0087] 本发明提供了改善植物产量的方法和组合物。在一些实施例中，植物产量在胁迫， 特别是非生物胁迫，例如氮限制条件下得以改善。提高植物产量的方法包括抑制植物的育 性。植物的雄性育性可用本领域已知的任何方法来抑制，这些方法包括但不限于破坏穗丝 发育基因，或者通过利用共抑制、反义或RNA沉默或干扰来降低基因的表达。其他雄性不育 植物可通过利用遗传雄性不育突变体来实现。
[0088] 抑制植物中的雄性育性可改善植物的氮胁迫耐受性，并且这种植物可在显著较低 的氮肥投入的情况下保持它们的产出率和/或可表现出增加的氮肥吸收和同化和/或对积 聚的氮储备的再动员和再利用。除了产量的总体增加外，通过减少雄性育性改善氮胁迫耐 受性还可导致根质量和/或长度增加，穗、叶、种子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改 善。因此，在一些实施例中，所述方法还包括在氮限制条件下栽培所述植物，并任选选择表 现出对低氮水平有较大耐受性的那些植物。
[0089] 另外，提供了改善非生物胁迫下的产量的方法和组合物，该方法包括：评价耕作区 的环境条件的非生物应激源（stressor)(例如，土壤中的低氮水平），并在胁迫环境下栽培 具有减少的雄性育性的种子或植物。
[0090] 本文还提供了构建体和表达盒，所述构建体和表达盒包含可有效减少雄性育性的 核苷酸序列。
[0091] 另外的方法包括但不限于：
[0092] 一种通过增加植物中的一种或多种产量组分来增加产量的方法，包括通过影响植 物中核编码组分的表达或活性来减少雄性育性，以及在植物生长条件下种植植物，其中该 组分表现出显性表型。在一个实施例中，核编码组分为具有显性表型的雄性育性基因或雄 性不育基因。任选地，雄性育性基因或雄性不育基因为转基因。
[0093] 正在发育的雌性生殖结构与雄性生殖结构在这些生殖结构发育期间竞争氮、碳和 其他营养物质。这在当植物以增加的氮肥水平种植时定量正在发育的玉蜀黍穗和穗丝的氮 平衡中进行说明。当玉蜀黍在较低氮肥力水平下生长时，穗的氮平衡为负，或在发育期间 当氮受限时，穗丢失氮至植物的其他部分。穗的氮平衡在提供给植物的氮肥的量增加时提 高，直到穗维持氮的正向增加直至抽穗丝。相比之下，无论种植植物的育性水平如何，穗丝 都维持正向氮平衡。穗丝和穗在生殖发育期间竞争氮，并且正在发育的穗丝对正在发育的 穗占优势。穗和穗丝可能在发育期间竞争多个营养物质，并且竞争在胁迫条件下变得更激 烈。穗在开花之前在生殖发育期间与穗丝竞争减少了正在发育的穗在胁迫下积聚营养物质 的能力，得到具有较少籽粒的较小、发育较差的穗。更严重的、延长的胁迫可导致穗无法抽 穗丝（exert silk)和产生谷粒。雄性育性的遗传减少将减少穗丝发育所需的营养物质，导 致开花时穗发育提高。遗传雄性不育和可育近亲在不同氮肥力水平下生长并且在约50%花 粉散出时取样。雄性不育植物在两种氮肥水平下均产生更大的穗。抽穗丝的雄性不育植物 的比例也大于可育近亲植物。虽然生物量（总地上植物干重减去穗干重）在较高氮肥下生 长的植物中较大，但是雄性不育对生物量无影响。这表明雄性不育具体地对植物产生更重、 更完全发育的（抽穗丝）穗的能力的正面影响，而不影响总体营养生长。
[0094] 尚未对遗传雄性不育衍生的杂交体进行产量实验，因为直到最近还没有利用该雄 性不育源产生杂交种子的适当方法。由于大多数遗传雄性不育为隐性的，因此产生雄性不 育杂交体将需要雄性不育源回交到杂交体的两个亲本中。对于杂交体雌性亲本将必须为纯 合隐性（雄性不育）的并且雄性亲本必须为杂合（雄性可育）的以对雄性不育1:1分离。 相比之下，显性遗传雄性不育MS44仅需要回交到雌性亲本中以产生对雄性不育1 : 1分离 的杂交种子。显性雄性不育在多倍体植物诸如小麦中特别有用，其中纯合隐性不育的维持 更为复杂。
[0095] 已发现表达植物中显性遗传雄性不育基因的过程，所述植物任选地结合穗丝组织 特异性启动子和穗丝优选的基因，以增加穗组织发育、提高正在生长的植物中的营养物质 利用率并且增加种子度量值，最终得到提高的产量。（图1)
[0096] 遗传雄性不育极可能产生产量响应，因为花粉发育在遗传雄性不育突变体中 停滞得更早。大多数雄性不育突变体在花粉四分体释放后很快就失效（Albertson and Phillips，（1981) Can. J. Genet. Cytol. 23 :195-208 (Albertson 和 Phillips，1981 年，《加拿 大遗传学与细胞学杂志》，第23卷，第195-208页），其出现在雌性（穗）发育的非常早的阶 段。直到开花前10天才能确定CMS衍生的雄性不育，如通过与CMS稳定性相关联的环境相 互作用所判断的（Weider，et al.，（2009) Crop Sci. 49 :77-84 (Weider 等人，2009 年，《作物 科学》，第49卷，第77-84页））。穗的主体发育将发生在开花前10天之前。然而，当穗在早 期发育阶段时，遗传雄性不育的早期停滞将是减少正在发育的穗与穗丝发育对营养物质的 竞争的一种方法。与通过提高穗发育引导的雄性不育杂交体相关联的产量提高与穗发育和 穗丝发育竞争的减少一致。
[0097] 在恢复的（雄性可育）和未恢复的（雄性不育）细胞质雄性不育（CMS)杂交体中 测试对氮肥力的产量响应。一个杂交体在开花期间由于环境条件变为雄性可育，而另一个 杂交体由于雄性不育未表现出显著的产量效应。这些结果表明通过细胞质基因确定的雄性 不育可能直到穗丝和穗发育的较晚期才能确定，如通过与CMS稳定性相关联的环境相互作 用所判断的。穗的主体发育已在确定CMS雄性不育之前（开花前10天）发生，从而在穗发 育期间提供极少减轻的穗丝竞争。因此在遗传雄性不育中的穗丝发育将在较长的穗发育时 间段期间减少，并因此与穗发育竞争较少。遗传雄性不育突变体不受环境条件的显著影响。
[0098] 减轻正在发育的穗丝和穗之间的竞争还可通过化学诱导雄性不育来实现。化 学物质和遗传操纵的组合也可诱导雄性不育。通过雄性生殖组织中具有较低功效的启 动子或通过使用杀配子剂前体（pro-gametocide) (Dotson, et al·，（1996)The Plant Journal 10 :383-392 ((Dotson 等人，1996 年，《植物杂志》，第 10 卷，第 383-392 页）和 (Mayer and Jefferson, (2004)Molecular Methods for Hybrid Rice Production(Mayer 和Jefferson，2004年，《用于杂交水稻生产的分子方法》））来修改除草剂耐性。组织特异 性方式的抑制剂也将是实施本发明的有效方法。
[0099] 在多种情况下，特定的植物性状通过维持纯合隐性条件来表达。当转基因恢复基 因必须用于维持时，需要另外的步骤来维持纯合条件。例如，玉蜀黍中的MS45基因（美国 专利No. 5, 478, 369)有助于雄性育性。由于MS45育性性状的孢子体性质，因此显性MS45 等位基因的杂合或半合植物是完全可育的。MS45基因中指定为ms45的天然突变在该突变 型等位基因处于纯合状态时赋予植物雄性不育表型。当通过普通杂交或转基因互补方法将 非突变形式的基因引入植物中时，此不育性可逆转（即，育性被恢复）。然而，通过杂交对育 性的恢复移除了所需的纯合隐性条件，并且两种方法都恢复了全部雄性育性并且阻止了对 纯的雄性不育母系的维持。
[0100] 维持所需的纯合隐性条件的方法在美国专利No. 7, 696, 405和7, 517, 975中有所 描述，其中保持系用于杂交到纯合隐性雄性不育姊妹体上。保持系在雄性不育所需的纯合 隐性条件下，而且还包含由显性雄性育性基因组成的半合转基因构建体以补充雄性不育条 件；花粉消融基因，其阻止通过转基因构建体的花粉转移至雄性不育姊妹体，但允许隐性雄 性不育等位基因通过非转基因花粉粒的转移；以及种子标记基因，其允许对转基因保持系 种子或植物和转基因无效雄性不育种子或植物进行分选。
[0101] 制种技术（SPT)提供了维持植物中雄性不育基因的纯合隐性条件的方法。参见 (例如）美国专利No. 7, 696, 405。SPT将为花粉源的保持系用于其纯合隐性雄性不育姊妹体 的受精。保持系在雄性不育所需的纯合隐性条件下，而且还包含半合转基因构建体（"SPT 构建体"）。在某些实施例中，SPT构建体包含以下三种元件：（1)显性雄性育性基因，以补 充雄性不育隐性条件；（2)编码干扰雄性配子的形成、功能或传播的产物的基因和（3)标记 基因，其允许从那些不含该转基因的种子/植物中分选该转基因保持系种子/植物。对花 粉的形成、功能或传播的干扰阻止了通过转基因构建体的花粉转移；功能性花粉不含该转 基因。所得的种子产生为雄性不育的植物。然后将这些雄性不育自交系植物用于通过用雄 性亲本授粉的杂交体生产，所述雄性亲本对于雄性育性基因的显性等位基因可为不相关的 自交系纯合体。所得的杂交种子产生为雄性可育的植物。
[0102] 要产生杂交雄性不育子代，雄性亲本将用作保持系以杂交到雄性不育雌性自交系 上（利用单独的雌性保持系增加）以得到完全雄性不育的杂交植物。参见（例如）图3。
[0103] 使用显性方法是实现雄性不育或减少的雄性育性的另一种方法。显性雄性不育方 法优于隐性雄性不育的使用，因为完全不育仅需要显性基因的单拷贝。然而，如果方法不可 用于产生纯合显性雄性不育系，那么所得的子代将对雄性不育50%分离。该情况可通过转 基因地将筛选性或选择性标记连接到显性雄性不育基因并且筛选或选择携带标记的子代 种子或植物来减轻。对于显性雄性不育等位基因，连接的遗传标记或连接的表型可用于分 选子代。描述可逆显性雄性不育体系的方法在将化学物质施加于显性雄性不育植物的美国 专利No. 5, 962, 769中有所描述，所述可逆显性雄性不育体系逆转表型并且得到雄性育性， 从而允许自花授粉使得可获得纯合显性雄性不育植物。可预想用于产生纯合显性雄性不育 植物的其他方法，所述方法使用控制抑制或干扰显性雄性不育基因功能的基因的诱导型启 动子。植物为组成型不育的，仅当启动子被诱导时变为可育的，从而允许破坏显性雄性不育 基因功能的阻遏子的表达。阻遏子可为靶向显性雄性不育基因自身或其启动子或能够结合 显性雄性不育基因产物或使其失活的基因产物的反义基因、RNAi、反向重复序列。
[0104] 另一个在显性雄性不育的子代中产生100%雄性不育的方法将使用自动剪接蛋白 质序列。自动剪接蛋白质序列为能够自行切除并且以肽键重新结合剩余的一个或多个部 分的蛋白质片段。自动剪接蛋白质序列可自剪接并且将剩余部分归为顺式和反式两种状 态。显性雄性不育基因可进行修饰使得对N和C蛋白质区域编码的区域被分成不同的转基 因构建体，与对自动剪接蛋白质序列编码的序列结合。由于蛋白质为截短和无功能的，所以 包含单个构建体的植物将为雄性可育的，其允许自体受精以产生纯合植物。然后可将对于 N-DMS-N-自动剪接蛋白质序列为纯合的植物与对于C-自动剪接蛋白质序列-C-DMS蛋白质 为纯合的植物杂交。所有来自此杂交的子代通过切除每个自动剪接蛋白质序列以及N和C 序列的归类将为雄性不育的，以产生功能性的显性雄性不育蛋白质。
[0105] 一系列田地实验用于定量在各种环境变量下遗传雄性不育的产量响应。使用两个 变量：施氮量和植物密度，以使植物经受各种程度的胁迫。胁迫处理的连续性由于对遗传雄 性不育植物的穗的更大程度的同化物分配，允许对植物性能的清晰分离。这些方法用于定 量和说明田地中代表性的作物冠层环境中的正向产量效应。这些数据验证了在温室研究中 测量的早期单个植株响应。
[0106] 雄性不育表现为在特定植物组织的发育中的变化。玉蜀黍穗和穗丝为共享共同的 发育过程并且受共同的一组基因控制的两种花序结构。组织彼此竞争所需的营养物质。然 而穗丝具有优于穗的顶端优势的优点，其不利于玉蜀黍植物中的穗生长和产量潜力。减小 穗丝顶端优势可用于将更多资源转向穗生长、籽粒数量或尺寸，并且最终可得到增加的谷 粒产量。
[0107] 有多种方法减少穗丝的竞争，诸如雄性不育、穗丝尺寸减少或穗丝消除（无穗丝 玉蜀黍植物）。当基因的遗传突变（突变体）诸如雄性不育基因可用于减少穗丝与穗的竞 争时，转基因操作提供用于此目的的替代方案或使能工具。由于涉及穗丝发育的基因通常 涉及穗发育，所以通过中断这些基因减少穗丝发育也可影响穗发育。无穗丝基因（Tsll)突 变为其中无穗丝植物也是无穗的例子。要使穗丝生长减少而不干扰穗发育，则需要穗丝特 异性启动子靶向仅在穗丝组织中的基因破坏。
[0108] 提到的所有参考文献均以引用方式并入本文。
[0109] 除非另外明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域 的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术 是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性 的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
[0110] 借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员 将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容 不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要 求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并 非用于限制目的。
[0111] 除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物 学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。
[0112] 单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5'到3'的 方向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定 该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB 生化命名委员会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号 表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本 说明书整体进行更完整的定义。
[0113] 在描述本发明时，将采用下面的术语，并采用下文所示的定义。
[0114] 所谓"微生物"意指任何微生物（包括真核微生物和原核微生物），诸如真菌、酵 母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
[0115] 所谓"扩增"意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构 建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应（PCR) 系统、连接酶链式反应（LCR)系统、基于核酸序列的扩增（安大略省米西索加市加拿大基 因公司（Cangene，Mississauga, Ontario))、〇-β复制酶系统、基于转录的扩增系统（TAS) 和链置换扩增（SDA)。参见例如 Diagnostic Molecular Microbiology 〖Principles and Applications,Persing,et al. ，eds. ，American Society for Microbiology,Washington, DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，美国微生物学会，华盛顿 特区，1993年）。扩增的产物称为扩增子。
[0116] 术语"保守修饰的变体"同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列 而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗 传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG 和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码 子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为"沉默 变异"，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可 能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子（除了 AUG，它通常是甲硫氨 酸的唯一密码子；一个例外是微球菌（Micrococcus rubens)，对于它来说GTG是甲硫氨酸 密码子（Ishizuka，et al.，（1993) J. Gen. Microbiol. 139 :425-32 (Ishizuka 等人，1993 年， 《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页））可进行修饰以产生功能上相同的分子。因 此，编码本发明多肽的核酸的每种隐匿的变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用 的方式并入本文。
[0117] 对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列作出的会改 变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加， 在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为"保守修饰的变体"。因而，还可变 更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个 变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例 如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质的至少 30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，优选60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守 置换表是本领域所熟知的。
[0118] 下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
[0119] 1)丙氨酸（A)、丝氨酸⑶、苏氨酸（T);
[0120] 2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E);
[0121] 3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q);
[0122] 4)精氨酸（R)、赖氨酸（K);
[0123] 5)异亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、缴氨酸（V);和
[0124] 6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0125] 还可参见 Creighton，Proteins，W. H. Freeman and Co. (1984) (Creighton，《蛋白 质》，W. H. Freeman 公司，1984 年）。
[0126] 如本文所用，"基本上由...组成"意指在如下情况下目标多核苷酸或多肽可包 括额外的序列：额外的序列不会严重影响受权利要求保护的多核苷酸或多肽序列的基本功 能。
[0127] 术语"构建体"用来主要指多核苷酸序列的人工组合，即在自然界中不会发生的、 通常包含一个或多个调节元件和一个或多个编码序列的组合。该术语可包括指表达盒和/ 或载体序列，视上下文而定。
[0128] "对照"或"对照植物"或"对照植物细胞"提供度量其中已针对目的基因实现了遗 传变更（如转化）的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从 作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
[0129] 对照植物或植物细胞可例如包括：（a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗 传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b) 具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体（即，用对所关注性状不具有已知效果的 构建体，诸如包含标记基因的构建体）转化的植物或植物细胞；（c)为受试植物或植物细胞 的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；（d)遗传上与受试植物或植物细胞相同但未 暴露于会诱导所关注基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者（e)处于其中所关注 基因不表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的下调构建体 转化的植物。
[0130] 就指定的核酸而言，所谓"编码"意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白 质的核酸可以包含在该核酸的翻译区内的非翻译序列（例如内含子）或可以缺少这种居 间的非翻译序列（例如，如在cDNA中）。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定 的。通常，氨基酸序列由核酸利用"通用"遗传密码来编码。然而，可使用如在某些植物、动 物和真菌线粒体、细菌山羊支原体（Mycoplasma capricolum) (Yamao，et al.，（1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :2306-9 (Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第 2306-2309页）），或纤毛虫大核（ciliate Macronucleus)中存在的通用密码的变体，当用 这些生物体表达该核酸时。
[0131] 当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密 码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表 达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量 偏好性，因为这些偏好性已被证实不同（Murray，et al.，（1989)Nucleic Acids Res. 17: 477-98 (Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页），将其以引用的方式并 入本文）。因而，具体氨基酸的玉蜀黍优选密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关 于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人（出处同上）的表4中 列出。
[0132] 如本文所用，针对核酸的"异源"为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同 物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了 实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结 构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了 实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的 人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
[0133] 所谓"宿主细胞"意指包含本发明的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体 的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌（E.coli)，或真核细胞如 酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶 植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、 大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
[0134] 术语"杂交复合体"包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核 酸结构。
[0135] 在将核酸插入细胞的语境中，术语"引入"意指"转染"或"转化"或"转导"，包括 指将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组（例如染色体、质粒、质 体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达（例如，转染的mRNA)。
[0136] 术语"分离的"指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其 天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。术语"非天然存在的"、 "突变的"、"重组的"、"重组表达的"、"异源的"或"异源表达的"为不存在于其天然存在环境 中的代表性生物材料。
[0137] 术语"NUE核酸"意指包含编码完全长度或部分长度多肽的多核苷酸（"NUE多核 苷酸"）的核酸。
[0138] 如本文所用，"核酸"包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其 以与天然存在的核苷酸（例如肽核酸）相似的方式杂交至单链核酸。
[0139] 所谓"核酸文库"意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生 物体的基因组的整个被转录的部分。示例性核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建， 在诸如以下的标准分子生物学参考文献中有教导：Berger and Kimmel，（1987)Guide To Molecular Cloning Techniques, from the series Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc·, San Diego, CA (Berger 和 Kimmel，1987 年，《分子克隆技术指南》， 来自《酶学方法》系列第152卷，学术出版社，加州圣地亚哥）；Sambrook，et al.，（1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2nd ed.，vols. l-3(Sambrook等人，1989年，《分 子克隆实验指南》，第 2 版，第 1-3 卷）；以及 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,et al. ,eds,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley&Sons，Inc. (1994Supplement)(《最新分子生物学实验方 法汇编》，Ausubel等人编辑，选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公 司的合资公司（1994年增刊））。
[0140] 本文所用的"可操作地连接"包括指涉第一序列（诸如启动子）和第二序列之间 的功能性连接，其中启动子序列起始并介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作 地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是 连续的且在相同的阅读框内。
[0141] 如本文所用，术语"植物"包括指整个植株、植物器官（例如叶、茎、根等）、种子和 植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组 织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类 通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以 下属的种：南瓜属（Cucurbita)、蔷薇属（Rosa)、葡萄属（Vitis)、胡桃属（Juglans)、草莓 属（Fragaria)、百脉根属（Lotus)、苜猜属（Medicago)、驴食草属（Onobrychis)、三叶草属 (Trifolium)、胡芦巴属（Trigonella)、紅豆属（Vigna)、柑桔属（Citrus)、亚麻属（Linum)、 老鹤草属（Geranium)、木薯属（Manihot)、胡萝卜属（Daucus)、拟南芥属（Arabidopsis)、 芸苔属（Brassica)、萝卜属（Raphanus)、白芥属（Sinapis)、颠爺属（Atropa)、辣椒属 (Capsicum)、曼陀罗属（Datura)、天仙子属（Hyoscyamus)、番爺属（Lycopersicon)、烟 草属（Nicotiana)、爺属（爺属）、碧冬爺属（Petunia)、毛地黄属（Digitalis)、马珠草 属（Majorana)、菊苣属（Ciahorium)、向日葵属（Helianthus)、莴苣属（Lactuca)、雀麦 属（Bromus)、天门冬属（Asparagus)、金鱼草属（Antirrhinum)、萱草属（Heterocallis)、 Nemesis、天竺葵属（Pelargonium)、黍属（Panieum)、狼尾草属（Pennisetum)、毛茛属 (Ranunculus)、千里光属（Senecio)、蛾蝶花属（Salpiglossis)、黄瓜属（Cucumis)、布洛 华丽属（Browaalia)、大豆属（Glycine)、豌豆属（Pisum)、菜豆属（Phaseolus)、黑麦草 属（Lolium)、稻属（Oryza)、燕麦属（Avena)、大麦属（Hordeum)、黑麦属（Secale)、葱属 (Allium)和小麦属（Triticum)。特别优选的植物是玉米（Zea mays)。
[0142] 本文所用的"产量"可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数目（针对谷粒水 分进行了调整，例如玉蜀黍的水分通常为15% )，和指所产生的生物量的体积（对于草料作 物诸如苜蓿而言，以及复种作物的植株根尺寸）。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒 的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位磅/蒲式 耳。生物量测量为所产生的可收获植物材料的重量。
[0143] 如本文所用，"多核苷酸"包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或它们的类似 物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交 的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天 然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调 控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指指定的序列及其互补序 列。
[0144] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这 些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物 的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0145] 本文所用的"启动子"包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋 白质的识别和结合以起始转录的区域。"植物启动子"是能够引发在植物细胞中的转录的启 动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基 因的细菌获得的那些启动子，所述细菌如农杆菌（Agrobacterium)或根瘤菌（Rhizobium)。 例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转 录的启动子。这种启动子被称为"组织优选的"。"细胞类型"特异性启动子主要驱动在一 个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。"诱导型"或"调控型" 启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括 无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动 表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了"非 组成型"启动子类别。"组成型"启动子为在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下， 在植物的基本上所有组织中都有活性的启动子。
[0146] 术语"多肽"指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位 基因或前体（例如原前蛋白或前蛋白）。"NUE蛋白质"包含多肽。除非另有规定，否则术语 "NUE核酸"意指包含编码多肽的多核苷酸（"NUE多核苷酸"）的核酸。
[0147] 如本文所用，"重组的"包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者 源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然（非重组）形式的细 胞内的相同形式存在的基因，或因为有意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本 不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。本文所用的术语"重组的"不 涵盖通过天然发生的事件（例如自发突变、天然转化/转导/转座）进行的细胞或载体的 变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
[0148] 本文所用的"重组表达盒"是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产 生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、 线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达 盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
[0149] 术语"选择性杂交"包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交 的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高（例如，至少2倍于背景），并且基本上排 除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40%的序列同一性，优选60-90%的 序列同一'I"生，最优选1〇〇%的序列同一'I"生（即互补性）。
[0150] 术语"严格条件"或"严格杂交条件"包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与 其他序列杂交的程度可检测地更高（例如，至少2倍于背景）的条件。严格条件是序列依 赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针 可最高达100%互补的靶序列（同源探测）。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一 些错配，从而检测到较低程度的相似性（异源探测）。优选地，探针长为大约500个核苷酸， 但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
[0151] 通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1. 5M钠离子，通常为约0. 01至1. 0M钠离 子浓度（或其他盐），pH为7. 0至8. 3,对短探针（例如，10至50个核苷酸）而言温度为 至少30°C，对长探针（例如超过50个核苷酸）而言温度为至少约60°C的那些条件。严 格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt' s来实现。示例性的低严格性条件 包括在用30%至35%甲酰胺、1M NaCl、l%SDS(十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液37°C下杂 交，并在IX至2X SSC(20X SSC = 3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠）中在50°C至55°C下洗 涤。示例性的中等严格性条件包括37°C下在40至45%甲酰胺、1M NaCl、l%SDS中杂交， 并在55至60°C下在0. 5X至IX SSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括在50%甲酰胺、 1M NaCl、l%SDS中在37°C下杂交和在0. IX SSC中在60至65°C下洗涤。特异性通常决 定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，T m 可根据 Meinkoth and Wahl，（1984)，Anal. Biochem.，138 :267-84(Meinkoth 和 Wahl，1984 年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页）中的1 = 81.51：+16. 6 (log M)+0.41(% GC)-〇. 61 (% form)-500/L来大致估计；其中Μ为单价阳离子的摩尔浓度，％ GC为DNA中鸟 嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体 的长度（单位为碱基对）。TmS50%的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度（在 确定的离子强度和pH下）。每1 %的错配，Tm降低约1 °C ;因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤 条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有> 90%同一性的序列，则可将Tm降 低l〇°C。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热 解链温度（T m)低约5°C。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度（Tm)低1、2、3或4°C 的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以采用比热解链温度（Tm)低6、7、8、9或10°C的杂交和 /或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度（T m)低11、12、13、14、15或20°C的杂交和/ 或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或 洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致^低于45°C (水 溶液）或32°C (甲酰胺溶液），则优选增加 SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核 酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, " Elsevier, New York(1993) (Tijssen,《生物化学和分子生物学实验室技术-核 酸探针杂交》，第I部分，第2章，"核酸探针测定法的杂交原理和策略概览"，Elsevier出版 社，纽约，1993 年）；以及 Current Protocols in Molecular Biology，chapter2，Ausubel， et al. , eds, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(1995)(《最新分 子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版公司与约翰威立出版公 司，纽约，1995年）。除非另有规定，否则在本专利申请中，高严格性定义为在4X SSC、5X DenhardC s(5g Ficoll，5g聚乙烯批咯烧酮，5g牛血清白蛋白于500mL水中）、0· lmg/mL 煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中在65°C下杂交，和在0. IX SSC、0. 1% SDS中在65°C下洗 涤。
[0152] 如本文所用，"转基因植物"包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般 来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多 核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。"转基因" 在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、 组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进 行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语"转基因"不涵盖通过常规 植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或 自发突变之类的自然发生事件导致的基因组（染色体基因组或染色体外基因组）的改变。
[0153] 如本文所用，"载体"包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。 载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。
[0154] 以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a) "参 考序列"、（b) "比较窗口"、（c) "序列同一性"、（d) "序列同一性百分数"和（e) "基本上全 同"。
[0155] 如本文所用，"参考序列"是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指 定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0156] 如本文所用，"比较窗口 "意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该 多核苷酸序列可与参考序列进行比较，并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列部分相比 于参考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即空位），以便两个多核苷酸的最佳 比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。 本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度 相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
[0157] 将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。局部同源性算 法（BESTFIT)(Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2 :482(Smith 和 Waterman,1981 年，《应用数学进展》，第2卷，第482页））可以对用于比较的序列进行最佳比对；Needleman and Wunsch，（1970) J. Mol. Biol. 48 :443-53 (Needleman 和 Wunsch，1970 年，《分子生物学杂 志》，第48卷，第443-453页）的同源性比对算法（GAP);相似性搜索方法（Tfasta和Fasta) (Pearson and Lipman, (1988)Proc. Natl. Acad. Sci.USA85 :2444 (Pearson 和 Lipman, 1988 年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页））；这些算法的计算机化实施包括，但不限 于：Intelligenetics (加州山景城（Mountain View，California))的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software 卩3淡3§6*第 8 版（可得自 Genetics Computer Group(GCG* 程序（Accelrys 公司（加州圣地亚哥（San Diego，CA)))中的 GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下文献详细说明：Higginsh and Sharp，（1988) Gene73 :237-44 (Higgins 和 Sharp，1988 年，《基因》，第 7 卷，第 237-244 页）；Higgins and Sharp，（1989) CABI0S5 :151-3 (Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》， 第 5 卷，第 151-153 页）；Corpet，et al.，（1988)Nucleic Acids Res.l6:10881_90(Corpet 等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第 10881-10890 页）；Huang，et al.，（1992) Computer Applications in the Biosciences8 :155-65 (Huang 等人，1992 年，《计算机在生物科学 中的应用》，第 8 卷，第 155_165 页）以及 Pearson et al·，（l994)Meth.Mol.Biol.，24: 307-31 (Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24第307-310页）。用于多个序 列的最佳全局比对的优选程序是 PileUp(Feng and Doolittle, (1987) J.Mol.Evol.，25: 351-60 (Feng和Doolittle，1987年，《分子进化学杂志》，第25卷，第351-360页），其类似于 Higgins and Sharp，（1989) CABI0S5 :151-53 (Higgins 和 Sharp，1989 年，《计算机在生物科 学中的应用》，第5卷，第151-153页）中描述的方法，将文献以引用的方式并入本文。可用于 数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据 库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP， 用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对 核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列 进行查询° 参见 Current Protocols in Molecular Biology, Chapterl9,Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley_Interscience，New York(1995)(《现代分子生物学实验技 术》，第19章，Ausubel等人（编辑），威利-英特科学出版公司，纽约，1995年）。
[0158] GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上）的算法来寻找两个完整序列的比对，该 比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大 数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和 空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大 于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。 Wisconsin Genetics软件包第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8 和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和 空位延伸罚分可以是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50 或更大。
[0159] 如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然 而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种 或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的 其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单 独使用或联合使用 SEG(Wooten and Federhen，（1993)Comput.Chem. 17 :149-63 (Wooten 和 Federhen，1993 年，《计算化学》，第 17 卷，第 149-163 页））和 XNU(Claverie and States, (1993)Comput. Chem. 17 :191-201 (Claverie 和 States，1993 年，《计算化学》，第 17 卷，第 191-201页））低复杂性过滤程序。
[0160] 在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的"序列同一性"或"同一性"是指 当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性 百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中 氨基酸残基由具有相似化学性质（例如电荷或疏水性）的其他氨基酸残基置换，因此不会 改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置 换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有"序列相似性"或"相似性"。作出 这个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而 不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保 守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :ll_17(Meyers 和 Miller，1988 年，《计算机在生物科学中的 应用》，第4卷，第11-17页）的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE (美国加利 福尼亚州山景城 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California, USA))中所实现的。
[0161] 本文所用的"序列同一性百分数"意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序 列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列（不包含添加或缺 失）相比包含添加或缺失（即空位），以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的： 确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数 目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序 列同一性百分数。
[0162] 术语多核苷酸序列的"基本上相同"意指利用所描述的比对程序之一采用标准参 数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100%之间的序列同一性，优选至少50%的序 列同一'I"生，优选至少60 %的序列同一'丨生，优选至少70 %，更优选至少80 %，更优选至少90 % 且最优选至少95%序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨 基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相 应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100%之间的序列同一 性，优选至少55 %，优选至少60 %，更优选至少70 %、80 %、90 %，最优选至少95 %。
[0163] 在肽的情形中，术语"基本上相同"指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有 55-100 %之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55%的序列同一性，优选60%，优 选70%，更优选80%，最优选至少90 %或95%的序列同一性。优选地，利用Needleman和 Wunsch(出处同上）的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一 种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别 仅在于保守置换的话，则这两种肽基本上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守 变化时，如果抗体识别的表位基本上相同，则它们基本上相同。"基本上上相似的"肽共有如 上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
[0164] 表 1
[0165]

【权利要求】
1. 一种用于通过下列方式增加植物中产量或维持植物中产量稳定性的方法：a)通过 在雄性生殖组织优选的启动子的控制下表达转基因来减少雄性生殖组织发育；以及b)在 雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述雄性生殖组织为穗丝。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述雄性生殖组织发育通过表达可操作地连接到 启动子的基因而减少，所述启动子包括选自列表的序列的至少100个连续核苷酸。
4. 由根据权利要求1所述的方法得到的植物。
5. 根据权利要求4所述的植物的细胞。
6. 根据权利要求4所述的植物的种子或子代。
7. 包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸引发植物细胞中的转录并且包括选 自如下的序列： a) 选自 SEQ ID NO :64-106、134-137、142、144、149、150 的序列； b) 选自 SEQ ID NO :64-106、134-137、142、144、149、150 的序列的至少 100 个连续核苷 酸，以及 c) 与选自 SEQ ID NO :64-106、134-137、142、144、149、150 的序列的全长具有至少 70% 序列同一性的序列。
8. 表达盒，其包含可操作地连接到目的多核苷酸的根据权利要求7所述的多核苷酸。
9. 载体,其包含根据权利要求8所述的表达盒。
10. 植物细胞，所述植物细胞在其基因组中稳定掺入根据权利要求8所述的表达盒。
11. 根据权利要求10所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
12. 根据权利要求11所述的植物细胞，其中所述单子叶植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕 麦、裸麦、高粱或水稻。
13. 植物，所述植物在其基因组中稳定掺入根据权利要求8所述的表达盒。
14. 根据权利要求13所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。
15. 根据权利要求14所述的植物，其中所述单子叶植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、裸 麦、高粱或水稻。
16. 根据权利要求13所述的植物的转基因种子。
17. 根据权利要求13所述的植物，其中所述目的多核苷酸编码赋予病原体或昆虫抗性 的基因广物。
18. 根据权利要求13所述的植物，其中所述表达盒编码涉及营养物质吸收、氮利用效 率、耐旱性、根强度、根耐倒伏性、土壤害虫管理、玉米根虫抗性、碳水化合物代谢、蛋白质代 谢、脂肪酸代谢或植物激素生物合成的多肽。
【文档编号】C12N15/82GK104203973SQ201380014293
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2012年3月13日
【发明者】M.郭, K.R.海斯, M.A.鲁普, B.沈, C.R.西蒙斯, Y.吴 申请人:先锋国际良种公司