用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子的利记博彩app

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【专利摘要】描述了新启动子来驱动脑膜炎球菌中的转录，例如用于过表达蛋白抗原以保持在膜囊泡中。经修饰的porA启动子缺少可以造成相转变的野生型聚-G序列。可以使用脑膜炎球菌rRNA编码基因(例如，编码16S?rRNA)来驱动蛋白编码基因的转录。这些方法可以组合使用。
【专利说明】用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子
[0001] 本申请要求2012年2月2日提交的美国临时专利申请61/594, 159的优先权，其 全部内容通过引用纳入本文。

【技术领域】
[0002] 本发明属于用于在脑膜炎球菌中控制转录的启动子的领域。

【背景技术】
[0003] 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)是细菌性脑膜炎的病因。脑膜炎球 菌疫苗接种的一个方法依赖于外膜囊泡（0MV)，如在诺华（Novartis)MENZB?产品和挪威公 共卫生研究院（Norwegian Institute of Public Health)MENBVAC?产品中所使用，两者都 通过脑膜炎球菌的去污剂处理产生。
[0004] 已知改变脑膜炎球菌外膜的蛋白组成，并且因此改变0MV的组成。已经描述了敲 除不需要的基因并且过表达需要的基因。参考文献1-2, 3报道了 0MV疫苗的临床前研究， 其中fHbp (也称为GNA1870)过表达（并且这种过表达可以与LpxLl [4]的敲除结合）。参 考文献5报道了 5种配方的0MV疫苗的临床研究，其中敲除了 PorA和FrpB并且过表达Hsf 和TbpA。参考文献6报道了由具有灭活的synX和lpxLl基因、过表达的fHbp、两种不同的 PorA蛋白和稳定化的OpcA表达的细菌制备的天然外膜囊泡疫苗的I期临床研究。参考文 献7报道了由具有灭活的synX和lpxLl基因（和，在两个情况中，灭活的lgtA)、两种不同 的PorA蛋白和过表达的NadA或fHbp的细菌制备的三价天然外膜囊泡疫苗。如果通过不 去除LPS的方法产生囊泡，诸如lpxLl的基因的灭活是重要的。
[0005] 蛋白组成中的这些变化可以多种方式实现。例如，细菌可以在铁限制条件下生长 以促进与铁代谢相关的某些蛋白的表达。其他技术可以包括对细菌的工程改造。例如，参 考文献8提出可以使用强启动子（诸如porA、porB、lgtF或hpuAB启动子）来上调保护性 外膜蛋白的表达，或可以去除抑制性转录控制机制。参考文献9提出可以对基因进行工程 改造以去除它们的相可变性。在参考文献7中使用porA启动子来过表达NadA，而使用tac 启动子过表达fHbp。
[0006] 本发明的目标是进一步提供并且改善在脑膜炎球菌中改变蛋白表达的方式，并且 尤其是提供用于驱动感兴趣基因的表达的启动子。可以使用上调来增加在0MV中有用蛋白 的水平。


【发明内容】

[0007] 本发明的第一方面使用经修饰的porA启动子来驱动转录。如参考文献8的实施 例10-16中使用的天然porA启动子在其-35到-10区域之间含有聚-G序列，但是该序列 可能造成相转变并且因此来自天然porA启动子的表达可能不稳定。本发明的经修饰porA 启动子有改善，因为它们缺少野生型聚-G序列。
[0008] 因此，本发明提供了包含启动子的核酸，其包括：
[0009] (i)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和/或
[0010] (ii)来自脑膜炎球菌P〇rA基因启动子的-35区域，
[0011] 其中-10区域和-35区域通过12-20个核苷酸的间插（或间隔子）序列隔开，并 且其中间插序列不含聚-鸟噪呤（guanidine)序列或者包括具有不超过8个连续鸟噪呤核 苷酸的聚-鸟嘌呤序列。
[0012] 本发明的第二方面使用来自脑膜炎球菌rRNA编码基因（诸如16S rRNA基因）的 启动子来驱动蛋白编码基因的转录。因此本发明也提供包含与下游的蛋白编码基因可操作 连接的启动子的核酸，其中该启动子包括（i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域 和/或（ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。
[0013] 本发明也提供包含来自与具有5' UTR的蛋白编码基因可操作连接的rRNA基因启 动子的启动子区域的核酸，所述5' UTR含有蛋白表达的翻译调节元件。启动子区域可以包 括⑴来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域，（ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动 子的-35区域，和（iii)来自基因如porA基因的5' UTR。
[0014] 本发明也提供了包含启动子的核酸，其包括SEQ ID N0:18,或SEQ ID N0:18的变 体，所述变体与SEQ ID NO :18之间存在最多4个（例如，1、2、3或4个）单核甘酸插入、删 除或取代的差异。
[0015] 可以杂合形式使用porA和rRNA启动子，例如具有来自porA启动子的-10区域和 来自rRNA启动子的-35区域（其可以是共有的-35区域）。因此，本发明也提供了包含启 动子的核酸，其包括：
[0016] ⑴来自脑膜炎球菌rRNA基因的-10区域和来自脑膜炎球菌porA基因的-35区 域，或
[0017] (ii)来自脑膜炎球菌porA基因的-10区域和来自脑膜炎球菌rRNA基因的-35区 域。
[0018] 本发明的核酸可以在细菌中存在，并且尤其是在脑膜炎球菌中。启动子可以驱动 与之可操作连接的下游蛋白编码基因的表达（尤其是编码外膜蛋白的基因），并且可以使 用该细菌来制备疫苗（尤其是基于囊泡的疫苗）。本发明也提供了这些细菌、这些囊泡和这 些疫苗。
[0019] 本发明的启动子
[0020] 细菌启动子中的两个基本序列是-10区域（也称为Pribnow盒）和-35区域。通 过间插序列分隔这些区域，并且在-10区域和转录起始位点（+1)之间是短非转录上游序 列。
[0021] 已经详细研究了 PorA启动子。参考文献10报道了 6聚体的-35区域，之后是16 聚体或17聚体的间插序列，然后是7聚体Pribnow盒，然后是7-聚体非转录上游序列，之 后是转录核苷酸+1。在野生型porA基因中的起始密码子在转录体的核苷酸+59,并且在参 考文献8中证明了这个59聚体间隔。
[0022] 在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域的情况中，这 通常是6聚体TATAAT，即典型的-10区域6聚体。
[0023] 在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域的情况中，这 通常是6聚体TGGTTT或ATGGTT。
[0024] 在-35区域和-10区域之间的间插序列可以是12-20个核苷酸，例如12、13、14、 15、16、17、18、19或20个核苷酸。16、17或18个核苷酸的间插序列是典型的。
[0025] 短非转录上游序列通常是5-10个核苷酸，例如6、7或8个核苷酸。其可以是富G : C的，例如在序列中至少1/2的核苷酸是G或C，例如在6聚体非转录上游序列中至少3个 G/C残基。
[0026] 因此，启动子可以包括6聚体-35区域、16聚体或17聚体间插序列、6聚体-10区 域和6聚体或7聚体非转录上游序列，得到总共34、35或36个核苷酸的核心启动子。
[0027] 启动子当然可以在-35区域上游连续。-35区域上游的序列对于来自该启动子的 高水平表达、来自该启动子的表达调节可能是重要的。例如，在rRNA启动子中核心启动子 上游称为UP-元件的序列能够解释它们提高转录高达300倍的突出力度[11，12]。这些可 以由RNA聚合酶核心的α-亚基所识别。因此本发明的启动子可以包括上游UP-元件，其 通常是富A :T的。相似地，本发明的启动子可以包括上游的CREN(奈瑟球菌的接触调控元 件）[13]。
[0028] 在本发明的启动子包括来自porA基因启动子的-35区域和/或-10区域的情况 中，短非转录上游序列可以是TGAAGAC。
[0029] 在本发明的启动子包括来自porA基因启动子的-35区域和/或-10区域的情况 中，如实施例中所示，间插序列可以变化。例如，可以是TTTGCGGGGGGGGGGG(野生型16聚 体；SEQ ID NO :26)或 TTTGCGGGGGGGGGGGGG(野生型 18 聚体；SEQ ID NO :17)，但是并不优 选这些野生型序列。相反，在这16聚体或18聚体中的11聚体或13聚体聚-G序列可以由 非-G核苷酸间断。两个优选的间插序列是TTTGCGAGGGAGGTGG(16聚体；SEQ ID N0:27)和 TTTTGCGAGGGAGGTGG(17 聚体；SEQ ID NO :28)。
[0030] 在一些实施方式中，间插序列不含聚鸟嘌呤序列，即在间插序列中没有GG二核苷 酸。在其他实施方式中，间插序列可以含有聚鸟嘌呤序列，但是其含有不超过8个连续的鸟 嘌呤核苷酸，即其不包括序列GGGGGGGG。理想地，间插序列不包括序列GGGGGGG。理想地， 间插序列不包括序列GGGGGG。理想地，间插序列不包括序列GGGGG。理想地，间插序列不包 括序列GGGG。间插序列可以包括GGG三核苷酸或GG二核苷酸。因此，在间插序列内的聚G 序列可以总共延伸不超过8个核苷酸，并且理想地具有不超过3个连续的鸟嘌呤残基。
[0031] 在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域的情况中，这 通常是6聚体TATAAT，即典型的-10区域6聚体。
[0032] 在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域的情况中，这 通常是6聚体TTGACA (其为共有的-35区域）。
[0033] 在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域和/或-10 区域的情况中，间插序列可以是GGCGGAAGGAATACTT(SEQ ID N0:29)。
[0034] 在本发明的启动子包括来自rRNA基因启动子的-35区域和/或-10区域的情况 中，短非转录上游序列可以是TCGCAAC。
[0035] 可以杂合形式使用porA和rRNA启动子，并且可用的启动子包括来自rRNA 基因的-35区域（例如，TTGACA)、来自porA基因的经修饰的间插序列（例如， TTTGCGAGGGAGGTGG;SEQ ID N0:27)、典型的 Pribnow 盒（TATAAT)和来自 porA 基因的短非 转录上游序列（例如,TGAAGAC)。因此，启动子可以包括SEQ ID N0:30(TTGACATTTGCGAGGG AGGTGGTATAATTGAAGAC)〇
[0036] 在一些实施方式中，启动子包括SEQ ID NO :18(在野生型脑膜炎球菌16S rRNA启 动子的转录起始位点之前的35聚体片段）。如本文所示，该序列可改变有1、2、3或4个单 核苷酸序列插入、删除或取代。
[0037] 当在细菌中以功能DNA形式存在时，这些启动子可操作地连接到编码感兴趣蛋白 的序列，后者的转录受到该启动子的控制。可以使用本发明来表达任意感兴趣的蛋白，但是 该蛋白优选是可以保留在囊泡中的外膜蛋白。下面提供了外膜蛋白的合适示例，但是并不 优选使用本发明来驱动编码PorA外膜蛋白的转录体的表达。
[0038] 在编码DNA序列中，本发明的启动子的下游DNA包括转录起始位点，之后是Y未 翻译区域（通常包括Shine-Dalgarno序列）然后是编码的感兴趣蛋白的起始密码子。
[0039] 在启动子来自rRNA基因的情况中，所转录序列的起始理想上源自编码蛋白的基 因而不是rRNA基因。因此，rRNA启动子（例如，SEQ ID N0 :18或变体）可以与来自脑膜 炎球菌蛋白编码基因的5' UTR融合。在一些实施方式中，rRNA启动子与来自porA基因的 5' UTR(58聚体）融合，并且该5' UTR然后与感兴趣基因的编码序列融合。5' UTR应该 包括翻译调节元件，其允许从蛋白编码基因翻译蛋白。因此，该实施方式使用rRNA启动子 来产生可以被翻译的蛋白编码转录体。启动子下游在5' UTR以内的序列对于下游基因的 表达的转录或转录后影响的调节是重要的。
[0040] 也可以使用porA基因的5' UTR与本发明的经修饰porA启动子联用，使得经修饰 的porA启动子与来自porA基因的5' UTR连接，后者再与感兴趣蛋白的编码序列融合。
[0041] 有用的porA 5' UTR可以包括SEQ ID N0 :39的核苷酸序列，S卩GTATCGGGTGTTTGC CCGATGrmTAGGnTTTATCAAAITTACAAAAGGAAGCC，或与 SEQ ID N0:39 存在最多 5 个（例如， 1、2、3、4或5个）单核苷酸插入、删除或取代的差异的序列。
[0042] 可以理解本文的启动子序列的讨论是指正义链。在发生转录的双链DNA中，启动 子具有互补链。在表述两个启动子元件由"η"个核苷酸隔开的情况中，这仍指正义链的核苷 酸的数目；在双链DNA中，由"η"个碱基对隔开元件。如果启动子表述为缺少鸟嘌呤残基， 这仍指正义链；在双链DNA中，例如无鸟嘌呤的启动子可以包括鸟嘌呤残基，但是仅在反义 链上作为正义链上胞嘧啶残基的互补碱基。虽然参照正义链描述了本发明，本发明的范围 包括包含这类正义链的双链核酸，以及包括这类正义链或包括这些正义链的反义形式的单 链核酸（这些反义链当然可以用于通过标准技术制备正义链）。
[0043] 囊泡
[0044] 当制备脑膜炎球菌囊泡，即通过从脑膜炎球菌外膜的破坏或出泡得到的任意蛋白 脂质体囊泡时，本发明是特别用于由此形成保留来自外膜的抗原的囊泡。因此该术语包括， 例如0MV(有时称为"小泡"）、微囊泡（MV[14])和"天然0MV"（ "N0MV" [15]))。
[0045] MV和N0MV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中。MV 可以通过以下方法获得：在肉汤培养基中培养奈瑟球菌，将全细胞与肉汤培养基中较小的 MV分离（例如，通过过滤或低速离心，只沉淀细胞而不沉淀较小囊泡），然后从细胞耗尽的 培养基中收集MV (例如，通过过滤、示差沉淀或MV聚集，通过高速离心沉淀MV)。一般可以 根据培养基中产生的MV的量来选择用于生产MV的菌株，例如，参考文献16和17描述了具 有高MV产量的奈瑟球菌。
[0046] 另一个用于自发外膜囊泡产生的技术是灭活脑膜炎球菌中的mltA基因，如参考 文献18所公开。这些突变细菌在生长中向其培养基释放囊泡。
[0047] 从细菌人工制备0MV，可以利用去污剂处理（例如用脱氧胆酸盐）或通过非去污 剂方式（例如参见参考文献19)进行制备。形成0MV的技术包括：用胆酸盐去污剂（例 如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸 钠[20和21]处理奈瑟球菌）在不会沉淀去污剂的充分高的pH下[22]处理细菌。其它 技术可以在基本没有去污剂存在的情况下[19]利用如超声、均化、微流化、空化、渗透压冲 击、研磨、法式压制、混合等技术进行。不使用或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原， 如NspA[19]。因此一种方法可以使用含有脱氧胆酸盐浓度约0. 5%或更低如约0. 2%、约 0. 1%、<0. 05%或0的0MV提取缓冲液。参考文献23描述了一种制备0MV的有用过程，涉 及对粗0MV进行超滤，代替高速离心。该过程可以涉及在超滤后进行超离心的步骤。
[0048] 一个纯化囊泡的便捷方法是在参考文献24中公开的双过滤方法。
[0049] 优选的囊泡是在细菌培养中自发形成的那些囊泡，而不是仅在细菌的物理或化学 处理之后释放的那些囊泡。具有灭活的MltA的脑膜炎球菌的生长是以这种方式产生囊泡 的优选方式。参考文献47公开了产生高出泡菌株的方式。对于自发释放的囊泡，优选使用 不产生完整L0S的细菌（去污剂-提取的囊泡具有降低水平的潜在反应原性L0S)。
[0050] 如果脂寡糖（L0S)存在于囊泡中，可以对囊泡进行处理，以将其L0S与蛋白质组分 连接起来（"泡内"偶联[48])。
[0051] 囊泡可能完全缺少L0S，或它们可能缺少六酰化L0S，例如，在囊泡中的L0S可能 每个L0S分子的二级酰基链数有减少[25]。例如，囊泡可以来自具有lpxLl删除或突变的 菌株，其导致产生五酰化的L0S [2,43]。在一个菌株中的L0S可能缺少乳糖-N-新四糖表 位，例如，其可以是1st和/或lgtB敲除的菌株[5]。L0S可以缺少至少一种野生型一级 0-连接的脂肪酸[26]。所述L0S可以没有α链。L0S可以包含GlcNAc-!fep 2磷脂酰乙醇 胺-1^02-脂质4[27]。
[0052] 囊泡可以包括一个、超过一个或（优选）零个PorA血清亚型。从例如参考文献 28 (其公开了从经修饰表达6种不同的PorA亚型的菌株构建囊泡）和参考文献29中获知 提供了多重-PorA 0MV的脑膜炎球菌的修饰。相反，也从参考文献5中获知去除PorA的修 饰。
[0053] 囊泡可能不含PorA和FrpB两者中的一种或两种。优选的囊泡是不含PorA的。
[0054] 囊泡可缺少荚膜糖。例如，它们可能衍生自具有一个或多个用于荚膜生物合成和 /或输出的基因（例如，synX)被灭活的菌株。
[0055] 本发明可与不同菌株的囊泡混合物一起使用。例如，参考文献30公开了含多价脑 膜炎球菌囊泡组合物的疫苗，含有第一囊泡和第二囊泡，衍生第一囊泡的脑膜炎球菌菌株 具有在使用国有普遍性的血清亚型，衍生第二囊泡的菌株无需具有在使用国有普遍性的血 清亚型。参考文献31也公开了不同囊泡的有用组合。在一些实施方式中，可使用各来自L2 和L3免疫型菌株的囊泡组合。
[0056] 过表达
[0057] 可以使用本发明的启动子来在脑膜炎球菌中过表达感兴趣的基因。在基因编码外 膜蛋白抗原的情况下，可以用这种过表达来提供有利地保留该抗原的囊泡。下面更详细地 讨论这类囊泡。作为过表达的结果，与相应的野生型脑膜炎球菌中所看到的相比，从经修饰 的脑膜炎球菌制备的囊泡含有较高水平的过表达的抗原。以每单位质量的囊泡中相关抗 原的质量测量，囊泡中的表达增加在至少10%时有益，并且在增加至少20%、30%、40%、 50%、75%、100%或更多时更有益。
[0058] 通过使用本发明的启动子可以用于过表达抗原的合适的重组修饰包括，但不限 于：（i)启动子取代；（ii)基因添加；和/或（iii)基因取代。如果需要，这三个技术可以 与（iv)抑制子敲除联用。
[0059] 在启动子取代中，用本发明的启动子取代细菌中控制抗原基因表达的启动子以提 供较高水平的表达。
[0060] 在基因添加中，已经表达抗原的细菌接受相关基因的第二拷贝。第二拷贝可以整 合进细菌染色体中或可以在诸如质粒的附加元件上。可以使用本发明的启动子表达第二拷 贝。基因添加的效果是增加抗原的表达量。在使用质粒的情况中，理想地是具有高拷贝数 的质粒，例如超过10个，或甚至超过100个。
[0061] 在基因取代中，发生基因添加但是伴随着删除所述基因的原有拷贝。例如，在参考 文献3中使用这种方法，其中删除了细菌的内源染色体fHbp基因并且用质粒编码的拷贝取 代（也参见参考文献32)。使用本发明的启动子，来自取代拷贝的表达高于之前的拷贝，因 此导致过表达。
[0062] 在一些实施方式中，发生基因取代，其中基因添加伴随着另一个基因的删除。例 如，当需要敲除内源基因但不是正由本发明的启动子过表达的感兴趣的基因时。
[0063] 在一些实施方式中，可以出现超过一个事件的基因添加或基因取代，使得能发生 通过本发明的启动子表达多重拷贝的感兴趣基因或通过本发明的启动子过表达感兴趣的 不同基因。
[0064] 至少一个抗原的过表达会使用本发明的启动子，但是这些启动子可以与其他技术 联用。例如，启动子可以与抑制物敲除联用，其中抑制感兴趣抗原的表达的蛋白被敲除。这 种敲除意味着不发生抑制并且可以更高的水平表达感兴趣的抗原。
[0065] 例如，在NadA过表达的情况中，nadA基因可以使用本发明的启动子，但是另外可 以删除编码NadR(NMB1843)的基因。NadR是一种转录抑制物蛋白[33]，其在所有测试的菌 株中下调或抑制NadA编码基因。NadR的敲除导致NadA的组成型表达。过表达NadA的另 一个方式是在培养基中加入4-羟基苯基乙酸。因此，本发明的启动子可以单独用作过表达 策略，或与其他方法结合。
[0066] 在一些实施方式中，细菌过表达NadA。
[0067] 在一些实施方式中，细菌过表达NHBA。
[0068] 在一些实施方式中，细菌过表达fHbp。
[0069] 在一些实施方式中，细菌过表达NHBA和NadA。
[0070] 在一些实施方式中，细菌过表达fHbp和NadA。
[0071] 在一些实施方式中，细菌过表达fHbp和NHBA。
[0072] 在一些实施方式中，细菌过表达fHbp、NHBA和NadA。
[0073] 除了过表达NHBA和/或NadA以外，细菌可以过表达一种或多种其他的抗原。例 如，细菌可以过表达以下的一种或多种：（a)NhhA ; (b) TbpA ; (c)HmbR ; (d) TbpB ; (e)NspA ; (f) Cu，Zn-超氧化物歧化酶；（g) Omp85 ; (h) App ;和/或⑴fHbp。已经在参考文献5和34 中报道了 NhhA的过表达。已经在参考文献5、34和35中报道了 TbpA的过表达。已经在参 考文献36中报道了 HmbR的过表达。已经在参考文献35中报道了 TbpB的过表达。已经在 参考文献37中报道了 NspA的过表达与porA和cps敲除的结合。已经在参考文献35中报 道了 Cu，Zn-超氧化物歧化酶的过表达。已经在参考文献1-3和32中报道fHbp的过表达 并且在参考文献38和39中以不同方法（表达组成型活性突变FNR)进行。在过表达超过 一种抗原的情况中，使用本发明的启动子过表达至少一种抗原，并且在一些情况中，会使用 本发明的启动子过表达超过一种抗原。
[0074] 在一些实施方式中，细菌过表达NHBA、NadA和fHbp。这三种抗原是在参考文献40 中公开的"通用疫苗"或"401161^"[41，42]的组分。在一个实施方式中，通过本发明的启动 子控制NHBA的表达，敲除NadR，并且该菌株表达组成型的活性突变FNR。在另一个实施方 式中，通过本发明的启动子控制NHBA的表达，通过本发明的启动子控制fHbp的表达，并且 敲除NadR。
[0075] 过表达型经修饰的菌株通常会是与其亲本菌株等基因，除了遗传修饰以外。作为 修饰的结果，（在相同条件下）感兴趣的抗原在经修饰的菌株中的表达高于在亲本菌株中。
[0076] 细菌
[0077] 如上述，从由于遗传修饰而过表达相关抗原的脑膜炎球菌制备本发明的囊泡，至 少包括使用本发明的启动子。本发明也提供了这些细菌。它们可用于制备本发明的囊泡。
[0078] 除了包括本发明的启动子以外，脑膜炎球菌可以包括一个或多个其他修饰。例如， 其可以敲除]^1!^1、]^七4、]^七13、口〇^、;1^1)13、871^、111]^4和/或181:中的一种或多种。例如， 参考文献43报道了从具有灭活的 SynX、lpxLl和lgtA基因的细菌制备的N0MV疫苗。敲除 至少lpxLl和synX是特别有用的。
[0079] 通过敲除参与LPS生物合成的酶，细菌可以具有低的内毒素水平[44,45]。
[0080] 细菌可以来自任意的血清组，例如A、B、C、W135或Y。优选血清组B或血清组W135。
[0081] 细菌可以是任何血清型（例如，l、2a、2b、4、14、15、16等）、任何血清亚型和任何免 疫型（例如，LI ;L2 ;L3 ;L3,3,7 ;L10 ;等）。可以从具有以下亚型之一的菌株有效地制备囊 泡：P1. 2 ;Ρ1· 2,5 ;Ρ1· 4 ;Ρ1· 5 ;Ρ1· 5,2 ;Ρ1· 5, c ;P1. 5c，10 ;Ρ1· 7,16 ;Ρ1· 7,16b ;P1. 7h，4 ; PL 9 ;Ρ1· 15 ;Ρ1· 9,15 ;Ρ1· 12,13 ;Ρ1· 13 ;Ρ1· 14 ;Ρ1· 21，16 ;Ρ1· 22,14。
[0082] 细菌可以来自任何合适的谱系，包括高侵袭性和超毒力谱系，例如下列7个超毒 力谱系中的任何一个：亚组I、亚组III、亚组IV-UET-5复合系、ΕΤ-37复合系、Α4簇、谱系 3。这些谱系通过多位点酶电泳（MLEE)确定，但也使用多位点序列分型（MLST)也已用于对 脑膜炎球菌分类[参考文献46]，例如ΕΤ-37复合系为由MLST所分的ST-11复合系，ΕΤ-5 复合系为ST-32 (ΕΤ-5)，谱系3为ST-41/44等。
[0083] 在一些实施方式中，细菌可以包括一个或多个在参考文献8、37、47和48中公开的 敲除和/或过表达突变。适于修饰的基因包括：（a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、 HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB [8] ; (b) CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Ope、 PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB ; (c)ExbB、ExbD、rmpM、 CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Ope、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB ;和（d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB 和 / 或 SynC〇
[0084] 如上述，脑膜炎球菌有利地不表达活性MltA (GNA33)，使其自发释放囊泡，例如，其 含有使用本发明的启动子表达的抗原。
[0085] 理想地，细菌并不表达天然LPS，例如，其具有LpxLl和/或LgtB的突变或敲除。
[0086] 在细菌具有敲除的情况中，这种敲除通过插入序列方便地实现，所插入的序列包 括控制感兴趣蛋白转录的本发明的启动子。例如，基因组synX或lpxLl基因可以通过在其 中插入序列来敲除，插入的序列包括控制外膜蛋白如fHbp的表达的本发明的启动子。因此 可以使用单个转化事件来实现两个目标。
[0087] 本发明的细菌可以包括选择标记物，例如抗生素耐受性标记物。
[0088] 细菌可以有以下的一种或多种或全部特征：（i)LgtB和/或GalE下调或敲除， 以截短脑膜炎球菌LOS ; (ii)TbpA上调；（iii)NhhA上调；（iv)0mp85上调；（v)LbpA上调； (vi)NspA上调；（vii)PorA敲除；（viii)FrpB下调或敲除；（ix)Opa下调或敲除；（x)0pc下 调或敲除；（xii) cps基因复合体缺失。截短的L0S可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表 位，例如，其可以为半乳糖缺陷型L0S。所述L0S可以没有α链。
[0089] 细菌可具有以下的一种或多种或全部特征：（i)LgtA下调或敲除；（ii)LpxLl下调 或敲除；（iii) SynX下调或敲除；（iv)超过一种PorA亚型，诸如两种不同的PorA亚型；和/ 或（v)上调的外膜抗原，诸如NadA或fHbp。
[0090] 菌株生产
[0091] 本发明提供了用于制备适于囊泡制备的脑膜炎球菌菌株的方法，该方法包含以下 步骤：（i)选择在特定培养条件下生长时表达第一个量的抗原的起始菌株，然后（ii)修饰 该起始菌株以提供包括本发明的启动子的经修饰的菌株，其中经修饰的菌株在相同的特定 培养条件下生长时表达第二个量的抗原，第二个量高于第一个量。以每单位质量的细菌中 相关抗原的质量测量，第二个量高于第一个量至少10%是有益的，并且高至少20%、30%、 40%、50%、75%、100%或更多是更有益地。
[0092] 该方法之后可以有步骤（iii)培养在步骤（ii)中得到的经修饰的细菌以得到细 菌培养物。
[0093] 该方法也可以包括在引入本发明的启动子之前或之后的其他步骤的遗传操作。本 发明的启动子引入细菌可以超过一次并可在超过一个位点上，例如有多个受控制的基因。 [0094] 本发明也提供了制备脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包含处理通过本发明的方法 所得的细菌培养物（如上述）的步骤，使其外膜形成囊泡。该处理步骤可以使用任意的上 述技术。
[0095] 本发明也提供了制备脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包含处理本发明的脑膜炎球 菌的步骤，使其外膜形成囊泡。该处理步骤可以使用任意的上述技术。
[0096] 本发明也提供了制备脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包含在外膜自发脱落囊泡的 条件下培养本发明的脑膜炎球菌的步骤。例如，该脑膜炎球菌可能不表达活性的MltA。
[0097] 可用的起始菌株是脑膜炎球菌血清组B。三种可用于制备过表达感兴趣的抗原的 细菌的起始脑膜炎球菌菌株是MC58、NZ98/254和H44/76。MC58具有PorA血清亚型1. 7， 16 ;NZ98/254具有血清亚型P1. 7-2,4 ;并且H44/76具有血清亚型1. 7,16。也可使用具有 这些血清亚型的其它菌株。
[0098] 载体等
[0099] 本发明提供了如上述的启动子。这些可以存在于细菌染色体，或染色体外或在附 加体核酸如质粒内。细菌可以包括一个或多个拷贝的本发明的启动子。在细菌包括2个拷 贝的情况中，这些可以在染色体和/或附加体中。
[0100] 因此，本发明提供的细菌包含：（i)包括至少一个本发明的启动子的染色体和/或 (ii)包括至少一个本发明的启动子的附加体，诸如质粒。
[0101] 本发明也提供了包含本发明的启动子的核酸载体，诸如细菌表达载体。
[0102] 这些载体或细菌中的这些启动子可以是没有任何下游可转录序列的"孤独"启动 子，但是它们通常会可操作地与转录的序列连接，并且转录的序列然后经翻译表达感兴趣 的蛋白。
[0103] 抗原
[0104] NHBA (奈瑟菌属肝素结合抗原）
[0105] NHBA[51]作为基因 NMB2l32(GenBank 登录号 GI :7227388 ;本文的 SEQ ID N0 :9) 包括在奈瑟球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌 株的NHBA序列。例如，NHBA(称为蛋白"287"）的等位基因形式可见参考文献49的图5和 15,以及例如文献50的实施例13和图21所示（其中的SEQ ID 3179到3184)。已报道了 各种NHBA的免疫原性片段。
[0106] 本发明优选使用的NHBA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID N0 :9有50 % 或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0:9的至少"n"个 连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250或更多）。（b)的优选片段包含来自SEQ ID Ν0:9的表位。
[0107] 最有用的NHBA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID Ν0 :9 组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NHBA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗 脑膜炎球菌抗体。
[0108] 已经通过各种方式实现了 NHBA的过表达，例如，引入NHBA基因到IPTG诱导型启 动子的控制下[51]。
[0109] NadA(奈瑟菌粘附素 A)
[0110] NadA抗原作为基因 NMB1994(GenBank 登录号 GI :7227256 ;本文的 SEQ ID N0 :10) 包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58 [78]的公开基因组序列中。迄今已公布了许多菌株 的NadA抗原序列，并详细记载了作为奈瑟菌粘附素的蛋白活性。已报道了许多NadA的免 疫原性片段。
[0111] 本发明所用的优选NadA抗原包含以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID N0 :10具 有 50%或更高的相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包含 SEQ ID N0 :10 的至少 "η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的优选片段包含来自 SEQ ID Ν0:10 的表位。
[0112] 最有用的NadA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO : 10组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NadA抗原可在给予对象后引起杀菌性 抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID N0 :6是一种这样的片段。
[0113] HmbR
[0114] 全长HmbR序列作为基因 NMB1668(本文的SEQ ID NO :7)包括在脑膜炎球菌血清 组B菌株MC58 [78]的公开基因组序列中。参考文献52报道了来自不同菌株的HmbR序列 (本文的SEQ ID N0:8)，并且参考文献36报道了其他的序列（本文的SEQ ID N0:19hSEQ ID NO :7和8差异为1个氨基酸并且具有94. 2%相同性。SEQ ID NO :19比SEQ ID NO :7 短一个氨基酸并且由CLUSTALW确定它们具有99%相同性（1个插入，7个差异）。本发明可 使用任何这种HmbR多肽。本发明可使用包含HmbR全长序列的多肽，但常用含有部分HmbR 序列的多肽。因此在一些实施方式中，按照本发明使用的HmbR序列可包含与SEQ ID NO :7 具有至少i%序列相同性的氨基酸序列，其中i值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其 它实施方式中，按照本发明使用的HmbR序列可包含SEQ ID N0 :7的至少j个连续氨基酸的 片段，其中 i 值为 7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更高。在其它实施方式中，按照本发明使用的HmbR序列可包含以下的氨基酸序列： ⑴与SEQ ID N0 :7具有至少i%序列相同性，和/或（ii)包含SEQ ID N0 :7中至少j个 连续氨基酸的片段。
[0115] 优选j个氨基酸的片段包含来自SEQ ID N0 :7的表位。这些表位通常包含位于 HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR与血凝素结合的氨基酸，因为与这些表位 结合的抗体能够阻断细菌与宿主血凝素结合的能力。HmbR的拓扑学及其关键功能性残基如 文献53所述。保留跨膜序列的片段是特别有用的，因为它们能够显示在细菌表面上，例如 囊泡中。HmbR的长片段的示例对应于SEQ ID N0 :21和22。然而，如果使用可溶性HmbR， 则可以使用省略跨膜序列但是通常保留来自胞外部分的表位的序列。
[0116] 本发明最有用的HmbR抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO :7组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选HmbR抗原可在给予对象后引发杀菌 性抗脑膜炎球菌抗体。
[0117] fHbp(H因子结合蛋白）
[0118] 已详细确定了 fHbp抗原的特征。它也被称为蛋白"741" [参考文献50的SEQ ID 2535 和 2536]、"MB1870"、"GNA1870" [54-56]、"P2086"、"LP2086" 或"0RF2086" [57-59]。 它是一种天然脂蛋白，在所有脑膜炎球菌血清组中有表达。已经通过NMR确定了 fHbp的 C-端免疫决定结构域（"fHbpC"）的结构[60]。蛋白的这个部分形成了 8-链的β-桶，其 链通过不同长度的环相连。桶之前是短α-螺旋和柔性的Ν-端尾部。
[0119] fHbp抗原分为三种不同变体[61]已发现对给定家族产生的血清对同一家族产 生杀细菌活性，但对表达另两个家族之一的菌株无活性，即存在家族内、而非家族间交叉保 护。本发明可以使用单个fHbp变体，但是可以有益地包括来自两种或三种变体的fHbp。因 此，其可以使用两种或三种选自以下的fHbp的组合：（a)第一蛋白，包含与SEQ ID N0 :1具 有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID N0 :1的至少X个连续氨 基酸的片段组成的氨基酸序列；(b)第二蛋白，包含与SEQ ID N0 :2具有至少b%的序列相 同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID N0 :2的至少y个连续氨基酸的片段组成的氨 基酸序列；和/或（C)第三蛋白，包含与SEQ ID NO :3具有至少c%的序列相同性的氨基酸 序列和/或包含由来自SEQ ID NO :3的至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。
[0120] a 值为至少 85,例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 或更 高。b 值为至少 85,例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 或更高。c 值为至少 85,例如 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99· 5 或更高。a、b 和 c 的值本质上彼此并不相关。
[0121] X 值为至少 7,例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。 y 值 为至少 7,例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z 值为至少 7,例如 8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y 和 z 的值本质上彼此并不相关。
[0122] 在本发明使用单个fHbp变体的情况下，组合物可以包括包含以下的多肽：(a)与 SEQ ID N0 :1具有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID N0 :1的 至少X个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；或（b)包含与SEQ ID N0 :2具有至少b% 的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO :2的至少y个连续氨基酸的片段 组成的氨基酸序列；或（c)包含与SEQ ID N0 :3具有至少c%的序列相同性的氨基酸序列 和/或包含由来自SEQ ID N0 :3的至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。
[0123] 在本发明使用来自变体中的两种或三种fHbp的情况下，组合物可以包括两种或 三种选自以下的不同fHbp的组合：（a)第一多肽，包含与SEQ ID N0 :1具有至少a%的序列 相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID N0 :1的至少X个连续氨基酸的片段组成的 氨基酸序列；(b)第二多肽，包含与SEQ ID N0 :2具有至少b%的序列相同性的氨基酸序列 和/或包含由来自SEQ ID N0 :2的至少y个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；和/或 (c)第三多肽，包含与SEQ ID N0 :3具有至少c %的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由 来自SEQ ID N0 :3的至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。第一、第二和第三多 肽具有不同的氨基酸序列。
[0124] 在本发明使用来自变体中的两种fHbp的情况下，组合物可以包括以下的两种： (a)第一多肽，包含与SEQ ID NO: 1具有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由 来自SEQ ID NO: 1的至少X个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；和（b)第二多肽，包 含与SEQ ID N0 :2具有至少b%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID N0: 2的至少y个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序 列。
[0125] 在本发明使用来自变体中的两种fHbp的情况下，组合物可以包括以下的两种： (a)第一多肽，包含与SEQ ID NO: 1具有至少a%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由 来自SEQ ID NO : 1的至少X个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含与 SEQ ID N0 :3具有至少c%的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID N0 :3的 至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。
[0126] 另一种可按照本发明使用的fHbp是在例如参考文献62中公开的经修饰形式中的 一种，例如，包含其中的SEQ ID N0 :20或23。这些经修饰的形式可以引发抗体应答，其对 脑膜炎球菌具有广泛的杀菌作用。参考文献62中的SEQ ID NO :77是另一个可以使用的 fHbp序列。
[0127] fHbp的可用修饰，包括上述序列，是一种突变，其降低或去除蛋白对因子Η的亲和 力。例如，参考文献63和64公开了根据它们的编号位于残基Glu-283和/或Glu-304的 这类突变（从这种编号方式中减去72来匹配本文的SEQ ID NO :1)。相似地，参考文献65 和66公开了变体1根据残基编号在位置Arg-41处（减去7来匹配SEQ ID NO :1)的突变 (例如，变为Ser)和变体2根据残基编号在位置80、211、218、220、222和/或236处（减去 7来匹配SEQ ID NO :2)的突变（例如，变为Ser)。比对会快速揭示任意感兴趣的fHbp序 列的相应残基。特别优选在变体1序列中的Arg-41-Ser突变。
[0128] 在0MV中的fHbp蛋白会通常在例如N端半胱氨酸处发生脂化。在其他实施方式 中，它们未发生脂化。
[0129] NspA (奈瑟菌表面蛋白A)
[0130] NspA 抗原作为基因 NMB0663(GenBank 登录号 GI :7225888 ;本文中的 SEQ ID N0 : 11)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58 [78]的公开基因组序列中。先前已从文献67和 68知晓该抗原。之后已公布了来自许多菌株的NspA抗原序列。还报道了许多NspA的免疫 原性片段。
[0131] 本发明优选使用的NspA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID N0 :11有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID N0 :11 的至少 "η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的优选片段包含来自 SEQ ID Ν0:11 的表位。
[0132] 本发明最有用的NspA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO :11组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NspA抗原可在给予对象后引起杀 菌性抗脑膜炎球菌抗体。
[0133] NhhA(奈瑟菌hia同源物）
[0134] NhhA抗原作为基因 NMB0992(GenBank 登录号 GI :7226232 ;本文的 SEQ ID N0 :12) 包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。自从例如文献49和69 已公开了来自许多菌株的NhhA抗原序列，也已报道了多种NhhA的免疫原性片段。它也被 称为Hsf。
[0135] 本发明优选使用的NhhA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO :12有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID NO :12 的至少 "η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的优选片段包含来自 SEQ ID Ν0:12 的表位。
[0136] 本发明最有用的NhhA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO :12组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NhhA抗原可在给予对象后引起杀 菌性抗脑膜炎球菌抗体。
[0137] App (粘附和渗透蛋白）
[0138] App 抗原作为基因 NMB1985(GenBank 登录号 GI :7227246 ;本文的 SEQ ID NO :13) 包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58 [78]的公开基因组序列中。之后已公布了来自许多 菌株的App抗原序列。它也被称为"0RF1"和"Hap"。还报道了许多App的免疫原性片段。
[0139] 本发明优选使用的App抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID N0 :13有50 % 或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0:13的至少"n"个 连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、 60、70、80、90、100、150、200、250或更多）。（b)的优选片段包含来自SEQIDN0 :13的表位。
[0140] 本发明最有用的App抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO : 13组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选App抗原可在给予对象后引起杀菌 性抗脑膜炎球菌抗体。
[0141] 0mp85 (85kDa 外膜蛋白）
[0142] 0mp85 抗原作为基因 NMB0182(GenBank 登录号 GI :7225401 ;本文的 SEQ ID N0 : 14)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已公布了来自许 多菌株的0mp85抗原序列。0mp85的其它信息可见文献70和71。还报道了许多0mp85的 免疫原性片段。
[0143] 本发明优选使用的0mp85抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID N0:14 有50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0:14的至少 "η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的优选片段包含来自 SEQ ID Ν0:14 的表位。
[0144] 本发明最有用的0mp85抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID N0 :14组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选0mp85抗原可在给予对象后引 起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
[0145] TbpA
[0146] TbpA 抗原作为基因 NMB0461(GenBank 登录号 GI :7225687 ;本文中的 SEQ ID NO : 23)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许 多菌株的TbpA序列。还报道了多种TbpA的免疫原性片段。
[0147] 本发明优选使用的TbpA抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID N0 :23有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID N0 :23 的至少 "η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的优选片段包含来自 SEQ ID Ν0:23 的表位。
[0148] 本发明最有用的TbpA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO :23组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选TbpA抗原可在给予对象后引起杀 菌性抗脑膜炎球菌抗体。
[0149] TbpB
[0150] TbpB 抗原作为基因 NMB1398(GenBank 登录号 GI :7225686 ;本文的 SEQ ID NO :24) 包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多 菌株的TbpB序列。还报道了多种TbpB的免疫原性片段。
[0151] 本发明优选使用的TbpB抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与SEQ ID N0 :24有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高）；和 / 或（b)包括 SEQ ID N0 :24 的至少 "η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的优选片段包含来自 SEQ ID Ν0:24 的表位。
[0152] 本发明最有用的TbpB抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO :24组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选TbpB抗原可在给予对象后引起杀 菌性抗脑膜炎球菌抗体。
[0153] Cu，Zn-超氧化物歧化酶
[0154] Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原作为基因 NMB1398(GenBank登录号GI :7226637 ;本 文的SEQ ID N0:25)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之 后已出版了来自许多菌株的Cu，Zn-超氧化物歧化酶序列。还报道了多种Cu，Zn-超氧化物 歧化酶的免疫原性片段。
[0155] 本发明优选使用的Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原包括以下的氨基酸序列：（a)与 SEQ ID N0 :25 有 50%或更高相同性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；和/或（b)包括SEQIDN0: 25的至少"η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多）。（b)的优选片段包含来自 SEQ ID N0 :25的表位。
[0156] 本发明最有用的Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原可引发抗体，其在给予对象后能与 由氨基酸序列SEQ ID N0:25组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选Cu，Zn-超氧 化物歧化酶抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
[0157] 药物组合物
[0158] 本发明的囊泡可用作给予患者的免疫原性药物组合物中的活性成分。这些通常会 包括药学上可接受的运载体，并且这类运载体的充分讨论见于参考文献72。
[0159] 可用常规方法确定有效剂量体积，但组合物的人用剂量一般为约0. 5ml体积，例 如用于肌内注射时。以0.5ml的体积通过向大腿或上臂肌肉内注射给予基于RIVM 0MV的 疫苗[73]。以0. 5ml通过向大腿前侧面或上臂的三角肌内肌肉内注射给予MeNZB?。对于 其他递送途径可以使用相似的剂量，例如雾化的基于0MV的鼻内疫苗可以具有每次喷雾约 100 μ 1或约130 μ 1的体积，4次喷雾给予约0. 5ml的总剂量。
[0160] 本发明的组合物的pH通常为6-8,并且更优选6. 5-7. 5 (例如，约7)。基于RIVM 0MV的疫苗的pH为7. 4 [74]，并且对于本发明的组合物优选pH < 7. 5。通过使用10mM Tris/ HC1缓冲液来维持基于RIVM 0MV的疫苗的pH，并且可以通过使用缓冲液（例如，Tris缓冲 液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液）来维持本发明的组合物中的稳定pH。 因此，本发明组合物通常会包括缓冲液。
[0161] 该组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明的组合物可以与人体等张。
[0162] 用于给予患者的本发明组合物有免疫原性，更优选是疫苗组合物。本发明的疫苗 可以是预防性（即预防感染）或治疗性（即治疗感染）疫苗，但通常是预防性疫苗。用作疫 苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。'免疫学有效量' 是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治 疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组（例如，非人的灵长动物、灵长动物 等）、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评 估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验可确定的相对较宽范围内。 本发明组合物的抗原含量通常以每剂量中蛋白的量表示。对于基于0MV的鼻内疫苗，通常 是约0. 9mg蛋白/ml的剂量。
[0163] 本发明的组合物可以包括免疫佐剂。因此，例如，它们可以包括铝盐佐剂或水包油 乳液（例如，水包鲨烯乳液）。合适的铝盐包括氢氧化物（例如，羟基氧化物）、磷酸盐（羟 基磷酸盐、正磷酸盐），（例如，参见参考文献75的第8和9章），或其混合物。这些盐可以 是任意合适的形式（例如，凝胶、结晶、无定形物等），优选抗原吸附于盐。给予患者的组合 物中 A1+++ 的浓度优选小于 5mg/ml，例如< 4mg/ml、i^ 3mg/ml、i^ 2mg/ml、i^ lmg/ml 等。优 选范围是0. 3-lmg/ml。优选最大值0.85mg/剂量。氢氧化铝佐剂特别适用于脑膜炎球菌疫 苗。
[0164] 脑膜炎球菌会影响身体的各个部分，因此本发明中的组合物可以制备成各种液体 形式。例如，可将所述组合物制备为溶液或悬浮液形式的注射剂。可制备所述组合物供肺 部给药，例如，通过吸入器，采用细雾进行所述给药。可制备所述组合物供鼻部、耳部或眼部 给药，例如，作为喷雾或滴剂进行所述给药。通常是供肌肉内给药的注射剂。
[0165] 本发明组合物可包含抗微生物剂，特别是以多剂量形式包装时。在疫苗中常见诸 如硫柳汞和2-苯氧乙醇的抗微生物剂，但是优选使用不含汞的防腐剂或完全不用防腐剂。
[0166] 本发明组合物可包含去污剂，如吐温（聚山梨酯），如吐温80。去污剂的含量水平 通常较低，如< 〇.〇1%。
[0167] 本发明的组合物可以包括来自0MV制剂的残留去污剂（例如，脱氧胆酸盐）。对于 每μ g的MenB蛋白，残留的去污剂的量优选为低于0. 4 μ g (更优选低于0. 2 μ g)。
[0168] 如果本发明的组合物包括L0S，对于每μ g的蛋白，LOS的量优选低于0. 12 μ g (更 优选低于〇. 05 μ g)。
[0169] 本发明组合物可含有钠盐（如氯化钠）以产生张力。NaCl浓度通常为10土2mg/ ml,例如，约 9mg/ml。
[0170] 除了本发明的囊泡以外，免疫原性组合物可以包括可溶的蛋白抗原。例如，可用的 组合物可以包括本发明的组合物联同以下的一种或多种：（i)NHBA抗原、（ii)NadA抗原和 (iii)fHbp抗原。例如，囊泡可以与"4CMenB"疫苗混合（参见上述）。在一个可用的实施方 式中，组合物同时包括可溶形式和过表达囊泡形式的fHbp，两种形式是不同的fHbp变体， 例如，可溶形式的变体1 (4CMenB)和囊泡表面上存在的变体2和/或3,其由从本发明的启 动子表达变体2或3序列的细菌制备。
[0171] 因此，本发明的一个组合物包括：⑴本发明的囊泡，诸如显示fHbp序列的自发释 放的囊泡；（ii)可溶的NHBA抗原，诸如SEQIDN0:4;(iii)可溶的fHbp抗原，诸如SEQID NO :5 ;和（iv)可溶的NadA抗原，诸如SEQ ID NO :6。
[0172] 治疗方法
[0173] 本发明还提供了一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包含将本发明的组合物 给予所述哺乳动物。免疫反应优选为保护性，优选涉及抗体。在已接受针对脑膜炎奈瑟球 菌的初免的患者中，该方法可产生加强应答。
[0174] 所述哺乳动物优选人。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童（例如，幼童或婴 儿）或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。为儿童准备的疫苗也可给予成年 人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。
[0175] 本发明也提供用作药物的本发明的囊泡。药物优选用于引起哺乳动物的免疫反应 (即，它是一种免疫原性组合物），并且更优选是疫苗。
[0176] 本发明也提供本发明的囊泡在制备引起哺乳动物免疫应答的药物中的应用。
[0177] 这些应用和方法优选用于预防和/或治疗由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病，例如， 细菌性（或者，更具体地，脑膜炎球菌）脑膜炎，或败血症。
[0178] 检测治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测奈瑟球菌感 染。监测预防性治疗的功效的一种方式包括监测给予该组合物后针对抗原产生的免疫应 答。本发明组合物的免疫原性可以通过给予受试对象（例如，12-16个月大的儿童或动物 模型[76])，然后测定标准参数，包括血清杀菌性抗体（SBA)和ELISA效价（GMT)来进行测 定。通常在给予该组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予该组合物之前测定的值作 比较。优选至少4倍或8倍的SBA增长。给予一个以上剂量的组合物时，可以进行超过一 次的给药后测定。
[0179] 通常，在给予对象之后，本发明的组合物能够诱导血清杀菌活性抗体应答。这些应 答可以在小鼠中方便地测得，并且是疫苗效力的标准指标。血清杀菌活性（SBA)测量由补 体介导的细菌杀伤，并且可以使用人或幼兔补体进行试验。WHO标准要求疫苗在超过90% 的接受者中诱导至少4-倍的SBA上升。在给予第三次剂量4-6周之后，MeNZB?引起4-倍 的SBA上升。
[0180] 优选的组合物可以在人对象患者中对于可接受百分比的对象产生优于血清保护 标准的抗体效价。众所周知抗原的关联抗体效价，高于该效价就认为宿主针对所述抗原发 生血清转化，该类效价由诸如WHO的组织公布。优选多于80%的具有统计学显著性的对象 样品发生血清转化，更优选多于90%，更优选多于93%，最优选96-100%。
[0181] 本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠道外注射（例如，皮下、腹膜 内、静脉内、肌肉内或递送至组织间隙），或通过任意其他合适的途径实现直接递送。本发明 可用来引发全身和/或粘膜免疫。优选肌肉内给予到大腿或上臂。注射可以通过针头（例 如皮下针头）进行，但也可以采用无针注射。肌内剂量通常是〇.5ml。
[0182] 剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加 强的免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以常规确定初次剂量之间 (例如4-16周）以及初次和加强剂量之间的适当时机。使用3-或4-剂量初免方案测试基 于0MV的RIVM疫苗，在0、2和8个月或0、1、2和8个月时接种疫苗。以三次间隔6周的剂 量给予MeNZB?。
[0183] 可以使用本发明的组合物来诱导针对超过一种的脑膜炎球菌超毒力谱系的杀菌 性抗体应答。具体地，它们可以优选诱导针对以下三种超毒力谱系中的两种或三种的杀菌 应答：（i)A4簇；（ii)ET5复合系；和（iii)谱系3。它们可以另外诱导针对超毒力谱系血 清组I、血清组III、血清组IV-1或ET-37复合系中的一种或多种和其他谱系如高侵袭性谱 系的杀菌性抗体应答。这并不一定表示所述组合物可以诱导针对这些超毒力谱系中各个和 每个脑膜炎球菌菌株的杀菌性抗体，例如，相反，对具体超毒力谱系内脑膜炎球菌菌株中的 4种或更多种菌株的任何给定组来说，所述组合物诱导的抗体对所述组的至少50% (例如， 60%、70%、80%、90%或更多）具有杀菌作用。优选的菌株组包括以下国家中的至少4个中 分离到的菌株 ：68、4104、勵、11\旧、似、1、81?和(^。所述血清优选具有至少为1024(例 如，21°、2 11、212、213、214、215、2 16、217、218或更高，优选至少为214)的杀菌效价，例如所述血清可 以在以1 : 1024稀释时杀死特定菌株中至少50%的测试细菌。
[0184] 可用的组合物可以诱导针对血清组B脑膜炎球菌的以下菌株的杀菌性应答：（i) 来自 A4 簇，菌株 961-5945(B :2b :PL 21，16)和 / 或菌株 G2136(B :-) ;(ii)来自 ET-5 复 合系，菌株此58出：15屮1.7，1613)和/或菌株44/76(8:15屮1.7，16) ;出1)来自谱系3， 菌株394/98 (B :4 :P1. 4)和/或菌株BZ198 (B :NT :-)。更优选的组合物可以诱导针对菌株 961-5945、44/76和394/98的杀菌性应答。
[0185] 菌株961-5945和G2136都是奈瑟球菌MLST参比菌株（参考文献77中的编号638 和1002)。菌株MC58是广泛可得的（例如，ATCC BAA-335)并且是在参考文献78中测序的 菌株。菌株44/76已被广泛使用并表征（例如，参考文献79)并且是奈瑟球菌MLST参比菌 株中的一种（参考文献77中的编号237 ;参考文献46中表2第32行）。菌株394/98原始 于1998年在新西兰分离，并且存在几个使用该菌株的公开研究（例如，参考文献80和81)。 菌株BZ198是另一种MLST参比菌株（参考文献77中编号409 ;参考文献46中表2第41 行）。
[0186] 其它抗原组分
[0187] 除了本发明的囊泡以外，免疫原性组合物可以包括其他非囊泡抗原。
[0188] 在一些实施方式中，组合物包括一种或多种来自脑膜炎球菌的荚膜糖，例如来自 血清组A、C、W135和/或Y。这些糖通常与蛋白运载体偶联。本发明的组合物可以包括来 自脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y的1、2、3或4种的荚膜糖的一种或多种偶联物，例如， A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y 等。包含 来自所有四种血清组A、C、W135和Y中的糖的组分是理想的。
[0189] 除了含有来自脑膜炎奈瑟球菌的抗原以外，组合物可以包括来自其他病原体的抗 原。例如，所述组合物可以包含一种或多种下列其它抗原：
[0190] -来自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)的抗原，诸如糖（通常是偶联 的）。
[0191] -来自乙型肝炎病毒的抗原，诸如表面抗原HBsAg。
[0192] -来自百日咳博德特菌（Bordetella pertussis)的抗原，诸如百日咳博德特菌的 百日咳全毒素（PT)和丝状血凝素（FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素（百日咳杆菌粘附 素）和/或凝集原2和3的组合。
[0193] -白喉抗原，诸如白喉类毒素。
[0194] -破伤风抗原，诸如破伤风类毒素。
[0195] -来自B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae B) (Hib)的糖抗原，通常是偶 联的。
[0196] -灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。
[0197] 所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，包 含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，包含百日咳抗原时，也优选包含 白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。
[0198] 如果包括Hib糖（通常是偶联物），糖部分可以是多糖（例如，从细菌中纯化的全 长磷酸多核糖基核糖醇（PRP))，但也可能将纯化的糖片段化来制备寡糖（例如，约1-约 5kDa的MW)，例如通过水解。组合物中Hib偶联物的浓度通常范围为0. 5 μ g-50 μ g，例如 1-20 μ g、10-15 μ g、12-16 μ g等。在一些实施方式中，这个量为约15g，或约12. 5 μ g。小于 5 μ g的质量也是合适的[82]，例如1-5 μ g，2-4 μ g，或约2. 5 μ g。如上述，在包括Hib糖和 脑膜炎球菌糖的组合中，可以基于后者的剂量（具体地，有多种脑膜炎球菌血清组时，它们 的平均质量）选择前者的剂量。Hib偶联物的其他特征如以上就脑膜炎球菌偶联物所述，包 括运载体蛋白的选择（例如，CRM197或破伤风类毒素）、连接、比率等。
[0199] 如果包括肺炎链球菌（S. pneumoniae)抗原，这可以是多肽或糖。偶联物荚膜糖特 别用于针对肺炎球菌（pneumococcus)的免疫。所述糖可以是多糖，其大小是在从细菌纯化 该糖期间形成，或者可以是这种多糖片段化产生的寡糖。例如，在7价PREVNAR产品中，6种 糖是完整多糖，而1种（18C血清型）是寡糖。一种组合物可包含来自以下一种或多种肺炎 球菌血清型的荚膜糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、 19卩、20、22?、23?和/或33?。组合物可包含多种血清型，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种血清型。本领域已知7价、9价、10价、11价 和13价偶联物组合，也了解23价非偶联组合。例如，10价组合可包含来自血清型1、4、5、 68、7?、听、14、18(：、19?和23?的糖。11价组合还可包含来源于血清型3的多糖。12价组合 可向10价混合物加入：血清型6A和19A ;6A和22F ; 19A和22F ;6A和15B ; 19A和15B ;r22F 和15B ;13价组合可向11价混合物加入：血清型19A和22F ;8和12F ;8和15B ;8和19A ;8 和22F ;12F和15B ;12F和19A ;12F和22F ;15B和19A ;15B和22F ;等等。肺炎球菌偶联物 的其他特征如以上脑膜炎球菌偶联物就所述，包括运载体蛋白的选择（例如，CRM197或破 伤风类毒素）、连接、比率等。当组合物包含超过一种偶联物时，每种偶联物可使用相同的载 体蛋白或不同的载体蛋白。参考文献83描述了在多价肺炎球菌偶联物疫苗中使用不同载 体蛋白的潜在优点。
[0200] 概述
[0201] 除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理 学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见，例 如，参考文献84-90等。
[0202] 术语"包含"涵盖"包括"以及"由……组成"，例如，"包含"X的组合物可以仅由X 组成或可包括其它物质，例如X+Y。
[0203] 与数值X相关的术语"约"是可任选的，并且表示，例如x± 10%。
[0204] 当本发明涉及"表位"时，该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位，但通常是 B-细胞表位。这类表位可凭经验确定（例如，使用PEPSCAN[91，92]或相似方法），或它们 可被预测（如利用Jameson-Wolf抗原性指数[93]、基于矩阵的方法[94]、MAPIT0PE[95]、 TEPIT0PE[96,97]、神经网络[98]、OptiMer 和 EpiMer[99，100]、ADEPT[101]、T 位点 (Tsites) [102]、亲水性[103]、抗原性指数[104]或参考文献105-106、107、108、109公开的 方法等）。表位是由抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并与之结合的抗原某部分，它们 也称作"抗原决定簇"。
[0205] 两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相 同氨基酸的百分数。这种比对和同源性百分数或序列相同性百分数可利用本领域所知软 件程序来确定，例如用参考文献110的7. 7. 18部分所描述的那些。优选的比对通过史密 斯-沃特曼（Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12 分，缺口延伸罚2分，BL0SUM矩阵计62分。参考文献111中公开了史密斯-沃特曼同源性 搜索算法。
[0206] 术语"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的组合物可能完全不含Y。如有 需要，"基本上"一词可从本发明的定义中省略。

【专利附图】

【附图说明】
[0207] 图1说明在相同背景中使用5种不同的启动子在相同背景菌株（NZ98/254)和过 表达相同fHbp等位基因的基准菌株[112,113]中的fHbp表达水平。如图所示，fHbp的变 体2等位基因在基准菌株中或来自在间隔区（spacer tract)中具有11个G或13个G的 P〇rA启动子的2个野生型相变体或由修饰的ST1、ST2和ST3 porA启动子过表达。如图所 示，从0. 5倍到2倍上样对各菌株进行等当量总蛋白的Western印迹，并且箭头表示fHbp。
[0208] 图2表示来自porA和16S修饰的启动子的fHbp表达的比较分析。在所示的启动 子控制下表达fHBP变体2的NZ98/254菌株生长在板上（A)和在液体中生长到对数期（B) 和稳定期（C)，并且通过western印迹测量来自重复培养基（#1，#2)或来自基准过表达菌 株的fHBP表达水平。实线箭头指示fHbp，而较低的虚线箭头指示上样对照。
[0209] 图3显示来自以下3种菌株的fHbp的表达：（a) Δ lpxLl敲除；(b) Δ synX敲除；和 (c) Δ lpxLl Δ synX双敲除。在所有情况中，由经修饰的PorA启动子控制下的fHbp取代敲 除的基因。通过在细胞粗提取物上使用抗-fHbp血清的western印迹来评价fHbp的表达， 并且与作为对照的Hfq比较。图3A显示western印迹，并且图3B以人为单位（arbitrary unit)来定量表达。
[0210] 图4显不在分离自⑴Δ lpxLl Δ synX和（ii) Δ lpxLl Δ synX ΔmltA敲除菌株的 囊泡中的fHbp水平。图4A以mg/OD显示产量，并且图4B是0. 5 μ g囊泡的western印迹。
[0211] 图5显示fHbp在两个在不同基因座中过表达变体1或变体2fHbp的菌株中的表 达（泳道c和d)和在相应的基因座中同时过表达变体1和变体2的菌株中的表达（泳道 e)。泳道a是野生型菌株，并且泳道b是该菌株的Λ fHbp敲除。
[0212] 图6显示了从三敲除纯化的囊泡的银染SDS-PAGE。

【具体实施方式】
[0213] 经修饰的PorA启动子
[0214] 转录起始位点上游在间隔子区域中含有11和13个连续G的野生型脑膜炎球菌 P〇rA启动子的2个相变体的序列如下，用下划线表示-35和-10区域：
[0215] AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC(SEQ ID NO ：31)
[0216] AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC(SEQ ID NO :40)
[0217] 在-35和-10区域之间的间插序列包括Gn聚-G序列，其与PorA表达的相转变有 关系。为了稳定来自这种启动子的表达，测试了 3种修饰（小写字母表示修饰）：
[0218] AAAAATGGTTTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC( "ST1" ；SEQ ID NO :32)
[0219] AAAAATtGacaTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC( "ST2" ；SEQ ID NO :33)
[0220] AAAAtTGacaTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC ( "ST3" ；SEQ ID NO :34)
[0221] 因此，在"ST1"中，Gn序列在3个位置上被间断，留下不超过3个连续的G残基。 在"ST2"中，使用相同的间插序列，但是用共有的-35区域TTGACA取代-35区域。在"ST3" 中，额外的T残基插入紧接-35区域的下游。
[0222] 使用这三种启动子来驱动NZ98/258菌株中fHbp序列的表达（fHbp变体2)。当与 已经在文献[112,113]中报道的同等过表达菌株比较时，所有的3个修饰的启动子在菌株 中导致fHBP的高水平过表达。在ST2中看到最佳的表达（图1和2)。
[0223] 经修饰的rRNA启动子
[0224] 在进一步的实验中，16S rRNA启动子与以下porA基因的5' UTR融合：
[0225] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATAATTCGCAAC. . . (SEQ ID NO ：35)
[0226] 该启动子经过突变并且3种在-35区域的下游的变体的测序结果如下：
[0227] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATAATTCGCAAC( "wt" ；SEQ ID NO :35)
[0228] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATATTCGCAAC. · · ( "#5" ；SEQ ID NO :36)
[0229] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTTAATTCGCAC. · · ( "#6" ；SEQ ID NO :37)
[0230] ATATCTTGACAGGCGGAAGGAAACTTTATAATTCGCAAC. · · ( "#8" ；SEQ ID NO :38)
[0231] 因此，在变体#5和#6中，-10序列是5聚体，并且变体#6也在-10区域和转录起 始位点之间丢失了一个核苷酸。在变体#8中，-10区域及其下游序列与野生型相同，但是 在-35和-10区域之间的间插序列比野生型短一个核苷酸。
[0232] 来自经修饰启动子的fHbp表达
[0233] 这些启动子与porA基因的5' UTR区域融合并且用于驱动fHbp编码序列的表达。 如图2所见，变体#5和#6,变体#5和#6显示出最强的表达，接近ST2所见的水平。
[0234] 横跨野生型启动子（SEQ ID NO :35)，向下游延伸至转录区域并且向上样延伸的全 区域如下（SEQ ID N0:41;358聚体），用下划线表示-35和-10区域，并且用双下划线表示 核苷酸+1 (按照参考文献10):
[0235] · · ·CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGGA AAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTCCCCA AAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAGTGG CGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTA TAATTCGCAAC Q TATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCC. . . (SEQ ID NO ：41)
[0236] 相似地，变体#5和#6的周围序列如下：
[0237] #5 ：...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAG AGGAAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTC CCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAG TGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACT TTATATTCGCAAC Q TATCGGGTGTTTGCCNNANGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTCAAAAGGAAGCC. . . (SEQ ID NO ：42)
[0238] #6 ：...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAG AGGAAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTC CCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAG TGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACT tttaattcgcacG tatcgggtgtttgcccgatgtttttaggtttttattaaatttacaaaaggaagcccatangaa TCGAACTGC. . . (SEQ ID NO ：43)
[0239] 任意的这些较长序列可以用于本发明，虽然当然可以如本文所述作出修饰。
[0240] 在变体启动子控制下的fHbp基因在内源lpxLl和/或synX基因的位置上稳定地 插入脑膜炎球菌（菌株NZ98/254)的染色体中。可以在synX基因座上看到稍高的表达水 平，并且具有两种插入的菌株（AlpxLlAsynX双敲除）的表达是来自个体基因座的表达之 和（图3)。
[0241] 也制备如下菌株，其中2个不同的fHbp变体（1和2)在经修饰的PorA启动子的 控制下表达。两个变体的共表达对来自各自不同的基因座的表达没有明显的负面影响，而 是产生叠加作用（图5)。
[0242] 在AlpxLlAsynX双敲除中内源mltA(GNA33)基因的敲除进一步增加了表达水 平，并且对于fHbp蛋白定位于菌株的囊泡中没有负面影响。图4显示了从这些菌株中分离 的囊泡中的fHbp水平，显示了（A)相对于培养基的光密度（0D)的蛋白产量（mg)，和（B)针 对0. 5 μ g囊泡的抗-fHbp western印迹。SDS-PAGE显示在三敲除菌株中的fHbp条带与 PorA和PorB -起是囊泡中最丰富的蛋白之一（图6)。
[0243] 应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和 精神内。
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[0002] <400 2 Val Ala Ala Asp lie GIv Ala Glv Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro 15 10 15 Leu Asp His Lvs Asp Lvs Ser Leu Gin Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser 20 ' 25 30 Val Arg Lvs Asn Glu L^s Leu Lys Leu Ala Ala Gin Glv Ala Glu Lvs 35 40 45' ' Thr Tvr Glv Asn Glv Asp Ser Leu Asn Thr Glv Lys Leu Lys Asn Asp 50 55 60 Lvs Val Ser Arg Phe Asp Phe lie Arg Gin Tie Glu Val Asp Glv Gin 65 70 75 80 Leu lie Thr Leu Glu Ser Glv Glu Phe Gin lie Tvr Lvs Gin Asp His 85 90 * 95 Ser Ala Val Va丄 Ala Leu Gin He G丄u Lys 丄丄e Asn Asn Pro Asp Lvs 100 105 110 lie Asp Ser Leu lie Asn Gin Arg Ser Phe Leu Val Ser Glv Leu Glv 115 120 125 Glv Glu His Thr Ala. Phe A.sn Gin I.bii Prn Asp Glv Lvs Ala Gin Tvr 130 135 140 ' His Glv Lvs Ma Phe Ser Ser Asp Asp Ala Glv Glv Lys Leu Thr TVr 145 ' 150 155 160 Thr lie Asp Phe Ala Ala Lys Gin Gly His Glv Lvs lie Glu His Leu 165 ^ ^ 170 175 Lvs Thr Pro Glu Gin Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lvs Ala 180 185 190 Asp Glu Lys Ser His Ala Val lie heu Glv Asp Thr Arg Tvr Glv Ser 195 2Q0 ' 205 ' Glu Glu Lvs Gly Thr Tvr His Leu Ala Leu Phe Glv Asp Arg Ala Gin 210 ^ 215 220 Glu lie Ala Gly Ser Ala Thr Vnl Lys lie Gly Glu Lvs Val His Glu 225 230 235 240 He Glv He Ala Glv Lvs Gin 245 <210> 3 <211> 250 <212> PRT <213，脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis ) <400〉 3 Val Ala Ala Asp lie Gly Thr Glv Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro 1 5 10 15 Leu Asp His Lys Asp Lvs Glv Leu Lvs Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser 20 25 30 lie Pro Gin Asn Glv Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gin Glv Ala Glu Lvs 35 ' 40 45' ' Thr Phe Lvs Ala Glv Asp Lvs Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lvs Leu 50 55 60 Lvs Asn Asp Lvs lie Ser Arg Phe Asp Phe Val Gin Lys Tie Glu Val 65 70 75 80 Asp Glv Gin Thr lie Thr Leu Ala Ser Glv Glu Phe Gin lie Tvr Lvs 85 90 % ' Gin Asn His ber Ala Val Val Ala Leu Gin He Glu Lvs lie Asn Asn 100 105 110
[0003] Pro Asp Lvs Thr Asp Ser Leu lie Asn Gin Arg Ser Phe Leu V Tal Ser 115 120 125 Glv Leu G1y Glv Glu Ills Thr Ala Phe Asn Gin Leu Pi'〇 GJ v Gly L\rs 130 135 140 Ala Glu Tvr His Glv Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Glv Arg 145 " 150 155 160 Leu His Tvr Ser lie Asp Phe Thr Lvs Lvs Gin Glv Tvr Glv Arg lie " .165 170 ' 175 Glu His Leu Lvs Thr Leu Glu Gin Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu 180 185 19Q Leu Lvs Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Yal lie Leu Glv Asp Thr Arg ' 195 ' 200 205 Tvr G1y Ser Glu Glu Lys Glv Thr Tvr His Leu Ala Leu Phe Glv Asp '210 215 ' 220 ' Arg Ala Gin Glu lie Λ]η Glv Ser Λ]η Thr Val Lvs lie Glv Glu Lvs 225 230 235 240 Val His Glu lie Glv lie Ala Glv Lys Gin 245 ^ 250 <210 4 <211 644 <212 PR丁 <213 人工序列 <220 <223 杂交脑膜炎球菌抗原 <400> 4 Mel Ala Ser Pro Asp Val Lvs Ser Ala Asp Thr Leu. Ser Lva Pro Ala 15 10 15 Ala Pro Val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys G]u Asp Ala Pro 20 25 30 Gin Ala Glv Ser Gin Glv Gin Glv Ala Pro Ser Ala Gin Gly Glv Gin 35' ' 40' 45 ' ' Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr Glv Asn Glv Glv Ala Ala 50 55 60 ' ' Ala Thr Asp Lys Pro Lvs Asn Glu Asp Glu Glv Ala Gin Asn Asp Met 65 70 75 80 Pro Girt Asn Ala Ala Asp Thr Asp Ser Leu Thr Pro Asn His Thr Pro 85 90 95 Ala Ser Asn Met Pro Ala Glv Asn Met Glu Asn Gin Ala Pro Asp Ala 100 ' 105 110 Glv G]\l Ser Glu Gin Pro Ain Asn Gin Prn Asp Met A]a Asn Thv A] a 115 120 125 Asp Glv Met Gin Glv Asp Asp Pro Ser Ala Glv Glv Glu Asn Ala Gly 130 ' 135 14t) - Asn Thr Ala Ala Gin Glv Thr Asn Gin Ala Glu Asn Asn Gin Thr Ala 145 150 155 160 Glv Ser Gin Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asn Pro Ser Ala Thr Asn Ser ' 165 170 175 Glv Gly Asp Phe Glv Arg Thr Asn Val Glv Asn Ser Val Val lie Asp ' 180 ' 185 ' 190 Gly Pro Ser Gin Asn lie Thr Leu Thr His Cys Lvs Glv Asp Scr Cvs 195 200 ' 205 '
[0004] Ser Glv Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val Gin Leu Lys Ser Glu Phe 210 215 220 Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lvs lie Ser Asn Tvr Lvs Lvs Asp Glv 225 230 ^ 235 ' 240 Lys Asn Asp Glv Lys Asn Asp Lys Phe Val Glv Leu Val Ala Asp Ser 245 250 255 Val Gin Met Lvs Glv lie Asn Gin Tvr lie lie Phe Tvr Lys Pro Lvs 260 ' 265 " 270 ' Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser 275 280 285 Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu lie Pro Val Asn Gin Ala Asp Thr Leu 290 295 300 Tie Val Asp G]v Glu Ala Val Ser Leu Thr Glv His Ser Gly Asn Tie 305 310 315 3*20 Phe Ala Pro Glu Glv Asn Tvr Arg Tvr Leu Thr Tyr Glv Ala Glu Lvs 325 ' ' 330 ' 335 Leu Pro Glv Glv Ser Tvr Ala Leu Arg Val Gin Glv Glu Pro Ser Lvs 340 " 345 - 350 ^ Glv Glu Met Leu Ala Glv Thr Ala Vai Tvr Asn Gly Glu Val Leu His 355 360 365 Phe His Thr Glu Asn Glv Arg Pro Ser Pro Ser Arg Glv Arg Phe Ala 370 375 380 ' Ala Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Glv lie He Asp Ser 385 390 ^ 395 ' 400 Glv Asp Glv Leu His Met Glv Thr Girt Lys Phe Lvs Ala Ala lie Asp ' ' 405 ' 410 ' 415 Glv Asn Glv Phe Lvs Gly Thr Trp Thr Glu Asn Glv Civ Glv Asp Va] 420 425 430 Ser Gly Lvs Phe Tvr Glv Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly Lvs Tvr 435 440 445 Ser TVr Arg Pro Τ--γ Asp Ala Glu Lvs Giv Glv Phe (Uv Val Phe Als 450 455 460 ' Glv Lys Lys Glu Gin Asp Glv Ser Gly Glv Glv Glv Ala Thr Tyr Lys 465 470 475 ' ' 480 Val Asp Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala lie Asp His Phe Asn ' 485 490 495 Thr Ser Thr Asn Val Gly Glv Phe Tvr Glv Leu Thr Glv Ser Val Glu 500 ' 505 ' 510 Phe Asp Gin Ala Lvs Arg Asp Glv Lvs lie Asp lie Thr lie Pro Val 515 ' 520 525 Ala Asn Leu Girt Ser Gly Ser Gin Hig Phe Thr Asp His Leu Lys Ser 530 535 540 Ala Asp lie Phe Asp Ala Ala Gin Tvr Pro Asp He Arg Phe Val Ser 545 550 555 560 Thr Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys Lvs Leu Va] Ser Val Asp Glv Asn 565 570 575 Leu Thr Met His Glv Lvs Thr Ala Pro Val Lys Leu Lvs /lla Glu Lvs 580 ' 5B5 > 590 ' Phe Asn Os Tyr Gin Ser Pro Met Ala Lys Thr G丄u Vai Cvs Gly Glv 595 600 605 ' Asp Phe Ser Thr Thr He Asp Arg Thr Lys Trp Gly Val Asp Tyr Leu
[0005] 610 615 620 Val Asn Val Gly Met Thr Lvs Ser Val Arg lie Asp lie Gin lie Glu 625 " 630 635 640 Ala Ala Lys Gin <210 5 <211 434 <212 PRT <213 人工序列 <220'> <223 杂交脑膜炎球菌抗原 <400 5 Met Val Ser Ala Val lie Glv Ser Ala Ala Val Glv Ala Lvs Ser Ala 15 10 15 Val Asp ArR Arg Thr Thr Gly Ala Gin Thr Asp Asp Asn Val Met Ala 20 25 30 Leu Arg lie Glu Thr Thr Ala Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Asn Asn Gin 35 40 45 Thr L\rs GUr Trr Thr Pro Gin lie Ser Val Val Glv Tvr Asp Arg His 50 55 60 Leu Leu Leu Leu Glv Gin Val Ala Thr Glu Glv Glu Lvs Gin Phe Val 65 70 75 80 Glv Gin lie Ala ArR Ser Glu Gin Ala Ala Glu Glv Val Tvr Asn Tvr 85 90 9d lie Thr Val Ala Ser Leu Pro Arg Thr Ala Glv Asp lie Ala G1y Asp 100 105 ' 110 Thr Trp Asn Thr Ser Lvs Val Arg Ala Thr Leu Leu Glv lie Ser Pro 115 120 125 Ala Thr Arg Ala Arg Val Lvs Tie Val Thr Tvr Glv Asn Val Thr Tyr 130 135 140 Val Met Gly He Leu Thr Pro Glu Glu Gin Ala Gin lie Thr Gin Lvs 115 150 155 160 Val Ser Thr Thr Val Giv Va_L Gin Lvs Val lie Thr Leu Tvr Gin Asn 165 170 175 Tyr Val Gin Arg Glv Ser Glv Glv Glv Glv Val Ala Ala Asp lie Gly ' 180 ' 185 190 Ala Glv Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lvs Asp Lvs 135 200 205 Glv Leu Gin Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser Val Arg Lvs Asn Glu Lys 210 215 220 Leu Lvs Leu Ala Ala Gin Glv Ala Glu Lvs Thr T?r Glv Asn Glv Asp 225 230 235 240 Ser Leu Asn Thr Glv Lys Leu Lvs Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp 245 250 255 Phe He Arg Gin lie Glu Val Asp G1y Gin Leu He Thr Leu Glu Ser 260 265 270 Glv Glu Phe Gin Val Tvr Lvs Gin Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe 275 280 285 Gin Thr Glu Gin lie Gin Asp Ser Glu His Ser Glv Lvs Met Val Ala 290 295 300 Lvs Arg Gin Phe Arg lie filv Asp He Ala Glv (Uu His Thr Ser Phe 305 310 3?5 320
[0006] Asp Lys Leu Pro Glu Glv Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe 325 330 335 Glv Ser Asp Asp Ala Glv Glv Lys Leu Thr Tvr Thr lie Asp Phe Ala ' 340 ' 345 ' 350 Ala Lvs Gin Glv Asn Glv Lvs lie Glu His Leu Lvs Ser Pro Glu Leu 355 ' 360 ' 365 Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp lie Lvs Pro Asp Gly Lvs Arg His 370 375 " 380 ' Ala Val lie Ser Glv Ser Val Leu Tvr Asn Gin Ala Glu Lvs Glv Ser 385 390 ' 395 ' 400 Tvr Ser Leu Olv lie Phe Glv Glv Lvs Ala Gin Crlu Val Ala Glv Ser ^ 405 ' 410 415 Ala G]u Val Lvs Thr Val Asn Gly He Arg His Tie G]v Leu Ala Ala 420 425 430 Lvs Gin <210 6 <211 327 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400 6 Ala Thr Asn Asp Asp Asp Val Lvs Lys Ala Ala Thr Val Ala lie Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tvr Asn Asn Gly Gin Glu He Asn Gly Phe Lvs Ala Gly Glu 20 25 30 Thi- I]e Tyr Asp lie Asp Glu Asp Glv Tbi lie Tiu L\ s Lvy Asp Ala 35 40 45 Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala Asp Asp Phe Lys Glv Leu Gly Leu Lys 50 55 60' Lvs Val Val Thr Asn Leu Thr Lys Thr Val Asn Glu Asn Lvs Gin Asn 65 70 75 ' 80 Val Asp Ala Lvs Val Lvs Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Lvs Leu Thr 85 ' 90 95 Thr Lvs Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala ' 100 105 110 Leu Asp Ala. Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lvs Leu Gly Glu Asn lie Thr 115 120 125 Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lvs Thr Asn He Val Lvs I]e Asp Glu Lys 130 135 140 Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr Val Asp Lvs His A丄a Glu Ala Phe Asn 145 150 ' 155 160 Asp lie Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr Asn Thr Lvs Ala Asp Glu Ala 165 170 175 Val Lvs Thr Ala Asn Glu Ala Lvs Gin Thr Ala Glu Glu Thr Lvs Gin ' 180 ' 185 190 Asn Val Asp Ala Lvs ￥al Lvs Ala Ala Glu Thr Ala Ala Glv Lvs Ala 195 ' ' 200 205 ' ' Glu Ala Ala Ala Gly Thr Ala Asn Thr Ala Ala Asp Lys Ala Glu Ala 210 ' 215 220 Val Ala Ala Lvs Val Thr Asp lie Lys Ala Asp Tic Ala Thr Asn Lvs 225 230 235 240
[0007] Asp Asn lie Ala Lvs Lvs Aia Asn Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg Glu 245 250 255 Glu Ser Asp Ser Lvs Phe Val Arg lie Asp G1y Leu Asn Ala Thr Thr 260 265 ' 270 Glu Lys Leu Asp Thr Arg Leu Ala Ser Ala Glu Lvs Ser lie Ala Asp 275 280 285 His Asp Thr Arg Leu Asn Glv Leu Asp Lvs Thr Val Ser Asp Leu Arg 290 " 295 ' 300 Lvs Glu Thr Arg Gin Glv Leu Ala (ilu Gin Ala Ala Leu Ser GLv Leu 305 310 315 320 Phe Gin Pro Tvr Asn Val Glv 325 ^ <210 7 <211 792 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 7 Met Lvs Pro Leu (iln Met Leu Pro lie Ala Ala Leu Val Glv Ser lie 1 ' 5 10 15 Phe Glv Asn Pro Val Leu Ala Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thx- 20 25 30 Pro Val Lvs Ala (ilu lie Lys Ala Vai Arg Val L^s Glv Gin Arg Asn 35 40 45' Ala Pro Ala Ala Val Glu Arg Val Asn Leu Asn Arg lie Lys Girt Glu 50 55 60 ' Met lie Arg Asp Asn Lvs Asp Leu Vai Arg Tyr Ser Thr Asp Val Gly 65 70 75 80' Leu Ser Asp Ser Gly Arg His Gin Lvs Glv Phe Ala Val Arg 〇]y Va] 85 90 95 Glu Gly Asn Arg ￥al Glv Val Ser lie Asp Glv Val Asn Leu Pro Asp ' 100 105 110 Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser 115 ' 120 ' ' 125 Arg Leu Ser lie Asp Pro Glu Leu Val Arg Asn lie Glu He Val Lys 130 135 140 Glv Ala Asp Ser Phe Asn Thr Glv Ser Glv Ala Leu Civ Glv G1y Val 145 150 ' 155 160 Asn Tyr Gin Thr Leu Gin Glv Arg Asp Leu Leu Leu Asp Asp Arg Gin 165 ' ' 170 175 Phe Glv Val Met Met Lvs Asn Glv Tyr Ser Thr Arg Asn Arg Glu Trp ' 180 _ 185 190 Thr Asn Thr Leu Gly Phe Glv Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala 195 ' 200 205 Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Gl? His Glu Thi" Glu Ser Ala G1y Asn 210 215 220 Arg Glv Tvr Ala Val Glu Glv Glu Glv Ser Gly Ala Asn lie Ai'g Glv 225 230 ' 235 240 Ser Ala Arg Gly lie Pro Asp Ser Ser Lys His Lvs Tvr Asn His His 245 250 ' > 255 Ala Leu Gly Lys lie Ala Tyr Gin lie Asn Asp Asn His Arg lie Glv ^60 265 270 ' Λ?α Ser Leu Asn Gly Gin Gin Gly His Asn T>r Thr Val Glu Glu Ser
[0008] 275 280 285 Tvr Asn Leu Thr Ala Ser Ser Trp Arg Glu Ala Asp Asp Val Asrt Arg 290 295 300 Arg Arg Asn Ala Asn Leu Phe Tyr Glu Trp Met Pro Asp Ser Asn Trp 305 310 315 320 Leu Ser Ser Leu Lvs Ala Asp Phe Asp Tvr Gin Lys Thr Lvs Val Ala 325 330 335 Ala Val Asn Asn Lvs Glv Ser Phe Pro Met Asp T?r Ser Thr Trp Thr 340 345 350 Arg Asn TVr Asn Gin Lvs Asp Leu Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser Met 355 " 360 365 Asp Thr Arg Phe Lys Arg Phe Thr Leu Arg Leu Asp Ser His Pro Leu 370 375 380 Gin Leu Gly Gly Gly Arg His Arg Leu Ser Phe Lvs Thr Phe Val Ser 385 390 395 400 Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp Tvr Tvr Phe Ser Glv 405 410 415 Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His Pro Val Lvs Thr Thr 420 425 430 Asn Tyr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin Tie Gin Trp Asn Asp Val Phe 435 440 445 Ser Ser Arg Ala Gly lie Arg Tvr Asp His Thr Lvs Met Thr Pro Gin 450 455 460 Glu Leu Asn Ala Glu Os His Ala Os Asp Lvs Thr Pro Pro Ala Ala 465 470 ' 475 480 Asn Thr Tvr Lvs Civ Trp Ser Gly Phe Val Gly Leu Ala Ala Gin Leu 485 490 495 Asn Gin Ala Trp Arg Val Glv Tyr Asp He Thr Ser Glv Tvr Arg Val 500 ' ' 505 5?0 Pro Asn Ala Ser Glu Val Tyr Phe Thr Τυγ Asn His Glv Ser Gly Asn 515 520 ' 525 Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvy Ala Glu Arg Ser Ttir Tlir His Thr 530 535 540 Leu Ser Leu Gin Glv Arg Ser Glu Lys Glv Met Leu Asp Ala Asn Leu 545 550 555 560 Tvr Glu Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu Glu Gla Lvs Leu Thr 565 570 575 Thr Ser Glv Thr Pro Glv Cys Tht Glu Glu Asn Ala Tyr T>r Gly lie 580 585 590 Cvs Ser A^p Pro Tvr Lvs Glu Lvs Leu Asp Trp Gin Mel Lvs Asn lie 595 ' " 600 605 Asp Lvs Ala Arg lie Arg Glv He Glu Leu Thr Glv Arg Leu Aan Val 6?0 615 620 Asp Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu Glv Trp Lvs Leu Phe Glv Ser 625 630 635 640 Leu Glv Tvr Ala Lvs Ser Lvs Leu Ser Glv Asp Asn Set Leu Leu Set 645 ' 650 655 Thr Gin Pro Leu Lvs Val lie Ala G1y lie Asp Tyr Glu Ser Pro Ser 660 665 ' 670 Glu Lvs Trp Glv Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr Leu Glv Ala Lva Lvs ' 675 ' 680 ' 685 '
[0009] Val Lys Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tyr Glu Asn Lvs Gly Trp Gly Thr 690 ' 695 700 Pro Leu Gin Lys Lvs Val Lys Asp TVr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser A]a 705 710 715 ' 720 Tvr Val Phe Asp Met. Tyr Glv Phe Tvr Lvs Pro Ala Lys Asn Leu Thr " 725 ' ^ 73〇 735 Leu Arg Ala filv Val Tyr Asn Leu Phe Asn Arg Lvs Tvr Thr Thr Trp 740 ^ 745 " ' 750 Asp Ser Leu Arg Gly Leu Tvr Ser Tyr Ser Thr Thr Asn Ala Val Asp 755 760 765 Arg Asp Glv Lys Glv Leu Asp Arg Tvr Arg Ala Pro Glv Arg Asn Tvr 770 ' 775 ' 780 . Ala Val Ser Leu Glu Trp Lvs Phe 785 790 <210 8 <211' 793 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌〔Neisseria i丨丨eningitidis) <400 8 Met Lvs Pro Leu Gin Met Leu Pro lie Ala Ala Leu Val Glv Ser lie 1 ' 5 10 15 Phe G1y Asn Pro Val Phe Ala Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr 20 25 30 Pro Val Lys Ala Glu Val Lvs Ala Val Arg Val Lvs Gly Gin Arg Asn 35 40 45^ Ala Pro Ala Ala Val Glu Arg Val Ayri Leu Asn Arg lie Lva Gin Glu 50 55 60 ' Met lie Arg Asp Asn Lvs Asp Leu Val Arg Tvr Ser Thr Asp Val GJ v 65 70 75 80 Leu Ser Asp Ser G1y Arg His Gin Lvs Glv Phe Ala Val Arg Glv Val 85' 90' 95' Glu Gly Asn Arg Val Glv Val Ser lie Asp Glv Val Asn Leu Pro Asp 100 105 110 Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser 115 120 125 Arg Leu Ser lie Asp F^ro Glu Leu Val Arg Asn lie Asp lie Val Lvs 130 135 140 ' Gly Ala Asp Ser Phe Asn Thr Glv Ser Glv Ala Leu Glv Glv Glv Val 145 150 ' 155 160 Asn Tvr Gin Thr I.eu Gin Glv Arg Asp Leu Leu Leu Pro Glu Arg Girt 165 170 175 Phe Glv Val Met Met Lvs Asn Glv Tyr Ser Thr Arg Asn Arg Glu Trp ' 180 ' 185 190 Thr Asn Thr Leu Glv Phe Glv Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala 195 ' 200 205 Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Glv His Glu Thr Glu Ser Ala Glv Lvs 210 215 220 Arg Gly Tvr Pro Val Glu Glv Ala Glv Ser Glv Ala Asn lie Arg Glv 225 ' 230 ' 235 240 Scr Ala Arg Glv lie Pro Asp Pro Scr Gin His Lvs Tvr Asn His His 245 250 ' ' 255
[0010] Ala Leu Gly Lvs lie Ala Tyr Gin lie Asn Asp Asn Ills Arg lie Gif 260 265 270 Ala Ser Leu Asn Gly Gin Gin Glv His Asn Tyr Thr Val Glu Cilu Ser 275 ^ 280 ^ 285 Tvr Asn Leu Leu Ala Ser Tvr Trp Arg Glu Ala Asp Asp Val Asn Arg ^ 290 295 300 Arg Arg Asn Thr Asn Leu Phe Tyr Glu Trp Thr Fro Glu Ser Asp Arg 305 310 - 315 320 Leu Ser Met Val Lvs Ala Asp Val Asp Tyr Gin Lys Thr Lys Val Ser 325 330 ' 335 Ala Val Asn Tvr Lvs GIy Ser Phe Pro He Glu Asp Ser Ser Thr Leu 340 345 350 Thr Arg Asn Tyr Asn Gin Lvs Asp Leu Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser 355 360 365 Met Asp Thr Arg Phe Lvs Arg He Thr Leu Arg Leu Asp Ser His Pro 370 ' 375 380 Leu Gin Leu Gly Glv Gly Arg His Arg Leu Ser Phe Lvs Thr Phe Ala 385 390 395 ' 400 Ser Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp Tvr Tyr Phe Ser 405 410 415 Glv Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His Pro Val Lys Thr ' 420 425 430 Thr Asn Tvr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin lie Gin Trp Asn Asp Val 435 ' 440 445 Phe Ser Ser Arg Ala GIy lie Arg Tvr Asp His Thr Lvs Met Thr Pro 450 455 ' 460 Gin Glu Leu Asn Ala Glu Cvs His Ala Cvs Asp Lys Thr Pro Pio A]a 465 470 475 480 Ala Asn Thr Tvr Lvs GIy Trp Ser Gly Phe Val Glv Leu Ala Ala Gin 485 490 495 Leu Asn Gin Ala Trp Arg Val Glv Tvr Asp lie Thr Ser Glv TVr Arg 500 505 510 Val Pro Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe Thr Tyr Asn His Glv Ser Gl^ 515 520 525 ' ' Asn Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs Ala Glu Arg Thr Thr Thr His 530 535 ' 540 Thr Leu Ser Leu Gin Gly Arg Ser Glu Lys Gly Thr Leu Asp Ala Asn 545 550 555 560 Leu Tyr Gin Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu Glu Gin Lvs Leu - 565 570 575 Thr Thr Ser Glv Asp Val Ser Cys Thr Gin Met Asn Tvr Tyr Tyr Gly 580 ' 585 ' 590 Met Cys Ser Asn Pro Tyr Ser Glu Lvs Leu Glu Trp Gin Met Gin Asn 595 600 605 lie Asp Lys Ala Arg lie Arg Gly He Glu Leu Tin' Civ Arg Leu Asn 610 615 620 Val Asp Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu Glv Trp Lvs Leu Phe Glv 625 630 635 > 640 Ser Leu Gly Tyr Ala Lvs Ser Lvs Leu Ser Gly Asp Asn Ser Leu Leu ' ' 645 ' 650 ' 655 Ser Thr Gin Pro Leu Lys Val lie ALa Gly He Asp Tyr Glu Ser Pro
[0011] 660 66δ 670 Ser Glu Lys Trp Glv Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr Leu Glv Ala Lys 675 680 685 " Lys Val Lys Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tvr Glu Asn Lys Glv Trp Glv 690 695 700 Thr Pro Leu Gin Lvs Lvs Val Lys Asp Tvr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser 705 710 T15 720 Ala Tyr Val Phe Asp Met Tvr Glv Phe Tvr Lvs Pro Val Lys Asn Leu 725 730 735 Thr Leu Arg Ala Gly Val Tyr Asn Val Phe Asn Arg Lvs Tvr Thr Thr 740 745 ' 750 Trp Asp Ser Leu Ar^ G1y Leu Tyr Ser Tvr Ser Thr Thr Asn Ser Val 755 760 765 Asp Arg Asp Glv Lys Glv Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Pro Ser Arg Asn 770 775 780 Tvr Ala Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe 785 790 <210 9 <211 ' 488 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis) <400 9 Met Phe Lys ArR Ser Val He Ala Met Ala Cys He Phe Ala Leu Ser 15 10 Id Ala Cvs Gly Glv Gly Glv Gly Glv Ser Pro Asp Val Lvs Ser Ala Asp 20 25 30 Thr Leu Ser Lvs Pro Ala Ala Pro Val Val Ser Glu Lvs Glu Thr Glu 35 40 45 Ala Lvs Glu Asp Ala Pro Gin Ala Gl'r Ser Gin Glv Gin Glv Ala Pro 50 55 60 Ser Ala Gin Gly Ser Gin Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr 65 70 75 80 G丄v Asn Glv Glv Ala Val Thr Ala Asp Asn Pro Lvs Asn Glu Asp Glu 85 90 95 Val Ala Gin Asn Asp Met Pro Gin Asn Ala Ala GW Thr Asp Ser Ser 100 105 ^ 110 Thr Pro Asn His Thr Pro Asp Pro Asn Met Leu Ala G1y Asn Met Glu 115 120 125 Asn Gin Ala Thr Asp Ala Glv Glu Ser Ser Gin Pro Ala Asn Gin Pro 130 135 140 Asp Met Ala Asn Ala Ala Asp Glv Met Gin Gly Asp Asp Pro Ser Ala 145 150 155 160 Glv Glv Gin Asn Ala Gly Asn Thr Ala Ala Oln Glv Ala Asn Girt Ala 165 170 175 Gly Asn Asn Gin Ala Ala Glv Ser Ser Asp Pro lie Pro Ala Ser Asn 180 185 190 Pi'〇 Ala Pro Ala Asn Glv Glv Sei" Asn Phe Glv Arg Val Asp Leu A] a 195 200 205 Asn Glv Val Leu lie Asp Glv Pro Ser Oln Asn lie Thr Leu Thr His 210 215 220 Cvs Lys Glv Asp Ser Cvs Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val 225 230 235 240
[0012] Gin Leu Lys Ser Glu Phe Glu Lys Leu $er Asp Ala Asp Lvs lie Ser 245 250 ' 255 Asrt Tvr Lys Lvs Asp Glv Lys Asn Asp Lvs Phe Val G]v Leu Val Ala 260 265 270 Asp Ser Val Gin Met. Lys Glv lie Asn Gin Tvr lie lie Phe Tyr Lvs 275 280 ^ 285 ' Pro Lvs Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg 290 295 300 Arg Ser Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu lie Pro Val Asn Gin Ala Asp 305 310 315 320 Thr Leu lie Val Asp Glv Glu Ala Val Ser Leu Thr Glv His Ser Glv 325 > 330 > 335 ' Asn lie Phe Ala Pro Glu Glv Asn Tvr Arg Tvr Leu Thr Tyr Glv Ala 340 ' 345 ' 350 ' Glu Lvs Leu Pro Glv Glv Ser Tvr Ala Leu Arg Val Gin Glv Glu Pro 355 360 365 Ala Lvs Glv Glu Met Leu Ala Glv Ala Ala Val Tvr Asn Glv Glu Val 370 375 380 Leu His Phe His Thr Glu Asn Glv Arg Pro Tvr Pro Thr Arg Γτ?ν Arg 385 390 ' 395 400 Phe Ala Ala Lvs Val Asp Phe Glv Ser Lvs Ser Val Asp Glv lie lie 405 4?0 415 Asp Ser Glv Asp Asp Leu His Met Glv Thr Gin Lvs Phe Lvs Ala Ala 420 425 - 430 lie Asp Glv A別i (ily Phe Lvs Glv Thr Trp Thr Glu A別i Glv Ser Gly 435 440 445 Asp Val Ser Gly Lys Phe Tvr Glv Pro Ala Glv Glu G]u Val Ala Gly 450 455 460 Lvs Tvr Ser Tvr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lvs Gly Glv Phe Glv Val 465 ' 470 475 ' 480 Phe Ala Gly Lvs Lys Glu Gin Asp 485 <210、 10 <211 364 <212 PRT <2131 脑膜炎佘瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400 10 Met Ser Met Lys His Phe Pro Ser Lys Val Leu Thr Thr Ala lie Leu 1 5 10 15 Ala Thr Phe Cvs Ser Gly Ain Leu Ala Ala Thr Ser Asp Asp Asp Val 20 25 30 Lvs Lvs Ala Ala Thr Val Ala lie Val Ala Ala Tvr Asn Asn Glv Gin ' 35 40 45 Glu lie Asn Glv Phe Lys Ala Glv Glu Thr lie Tvr Asp lie Γτ?ν Glu 50 " 55 ' 60 " Asp Glv Thr lie Thr (Jin Lvs Asp Ala Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lvs Glv Leu Glv Leu Lvs Lvs Val Val Thr Asn Leu Thr 85' ' 90 95 Lys Thr Val Asn Glu Asn Lys Gin Asn Val Asp Ala Lvs Val Lvs Ala 100 105 ' 110
[0013] Ala Glu Ser Glu lie Glu Lvs Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp 115 ' 120 125 Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Glu Thr Thr Asn Ala 130 135 140 Leu Asn Lvs Leu Glv Glu Asn lie Thr Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lvs 145 ' 150 155 160 Thr Asn lie Val Lvs lie Asp Glu Lvs Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr 165 ' 170 175 Val Asp Lvs Ills Ala Glu Ala Phe Asn Asp lie Ala Asp Ser Leu Asp "180 185 190 Glu Thr Asn Thr Lvs Ala Asp Glu Ala Val Lvs Thr Ala Asn Glu Ala 195 200 205 Lys Gin Thr Ala Glu Glu Thr Lys Gin Asn Va] Asp Ala Lys Val Lys 210 215 *220 Ala Ala Glu Thr Ala Ala Glv Lvs Ala Glu Ala Ala Ala Glv Thr Ala 225 230 > ' 235 ' 240 Asn Thr Ala Ala Asp Lvs Ala Glu Ala Val Ala AJ_a Lvs Val Thr Asp 245 250 ' 255 lie Lvs Ala Asp lie Ala Thr Asn Lvs Ala Asp He Ala Lys Asn Ser 260 265 270 Ala Arg lie Asp Ser Leu Asp Lvs Asn Val Ala Asn Leu Arg Lys Glu 275 280 285 Thr Arg Gin Glv Leu Ala Glu Gin Ala Ala Leu Ser Civ Leu Phe Gin 290 ' 295 300 ' Pro Tvr Asn Val Gly Arg Phe Asn Vai Thr Ala Ala Val Glv Glv Tvr 305 310 315 ' 320 Lvs Ser Glu Ser Ala Val Ala lie Glv Thr Γ.]ν Phe Arg Phe Thr G] u 325 330 335 Asn Phe Ala Ala Lvs Ala Gly Val Ala Val Glv Thr Ser Ser Gly Ser 340 345 350 Ser Ala Ala Tvr His Val filv Vai Asn Tvr Glu Trp 355 360 <210 11 <21] 171 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 11 Met Lys Lvs Ala Leu Ala Thr Leu lie Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala 1 ' 5 10 15 Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Glv Phe Tvr Val Gin Ala Asp Ala Ala 20 25 30 His Ala Lvs Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lvs Civ Phe Ser Pro 35 40 ' 45' Arg He Ser Ala Glv Tyr Arg lie Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Arg Tyr Lvs Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thi' Asp Phe Lvs Leu 65 " 70 75 ' 80 Tvr Ser lie Gly Ala Ser Ala He Tvr Asp Phe Asp Thr Gin Ser Pro > 85 90 95 Val Lvs Pro Tyr Leu Glv Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val ' 100 ' Ι?δ 110 Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gin Thr Ser lie Gly Leu Glv
[0014] 115 120 125 Val Leu Thr Gly Val Ser Tvr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 130 135 140 Ala Glv Tvr Arg Tvr Asn Tvr lie Gly Lvs Val Asn Thr Val Lvs Asn 145 150 155 160 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Glv Val Arg Val Lys Phe 165 170 <210 12 <211 591 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis) <400 12 Met Asn Lvs lie Tvr Ar^ lie lie Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 1 5' 10 15 Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 Thr Val Lvs Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45 Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gin Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 50 55 60 Val Gin Arg Thr Val Ala Val Leu lie Val Asn Ser Asp Lvs Glu Glv 65 70 75 80 Thr Glv Glu Lvs Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tvr 85 90 95 Phe Asn Glu Urs Glv Val I」cu Thr A1 a Arg Glu lie Thr Leu Lvs Ala 100 105 110 Glv Asp Asn Leu Lys He Lvs Gin Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tvr Ser 115 120 125 Leu Lvs hys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Glv Thr Glu Lvs Leu 130 135 140 Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn lie Thr Ser Asp Thr Lvs 145 150 155 160 Glv Leu Asn Phe Ala Lvs Glu Thr Ala Glv Thr Asn Glv Asp Thr Thr .165 170 175 Val His Leu Asn Gly He Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190 Thr Glv Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205 Lvs Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Glv Trp Asn 2i〇 215 220 lie Lvs G1y Val Lys Pro Glv Thr Thr Ala Ser Asp Asn Yal Asp Phe 225 230 235 240 Va]紅g Thr Tvr Asp Thr Val G]u Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lvs Thr 245 250 255 Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lvs Asp Asn Glv Lys Lvs Thr Glu Val 260 265 ' 270 Lys He Glv Ala Lvs Thr Ser Val lie Lvs Glu Lvs Asp Glv Lvs Leu 275 280 ^ ' 285 Val Thr Glv Lys Asp Lvs Glv Glu Asn Gly Ser Sex- Thr Ayp Glu Glv 290 295 300 Glu Glv Leu Val Thr Ala Lvs Glu Val lie Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 ' 310 315 ' 320
[0015] Gly Trp Arg Met Lvs Thr Thr Thr Ala Asn Olv Gin Thr Glv Gin Ala 325 330 ' 335 Asp Lvs Phe Glu Thr Val Thr Ser Glv Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350 Glv Lvs Glv Thr Thr Ala Thr Val Ser Lvs Asp Asp Gin Glv Asn lie ' ' 355 360 " 365 ' Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 ' 375 ^ 380 Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lvs Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400 Ser Gly Lvs Val lie Ser Glv Asn Val Ser Pro Ser Lvs Glv Lvs Met ' - 405 ' 410 4?5 Asp Glu Thr Val Asn lie Asn Ala Glv Asn Asn lie Glu lie Thr Arg 420 425 430 Λ?^η Glv Lvs Asn He Asp He Ala Thr Ser Met Thr Pro G]n Phe Ser 435 440 445 Ser Val Ser Leu Glv Ala Glv Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 ' 455 460 Glv Asp Ala Leu Asn Val Glv Ser Lvs Lvs Asp Asn Lvs Pro Val Arg 465 470 ' 475 ' 480 lie Thr Asn Val Ala Pro Glv Val Lvs Glu Glv Asp Val Thr Asn Val 485 490 495 Ala Gin Leu L?s Glv Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg lie Asp Asn 500 ' 505 510 Val Asp Glv A別i Ala Arg Ala Glv lie Ala Gl[i Ala lie Ala Thr Ala 515 520 525 Glv Leu Val Gin Ala Tvr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala lie Gly 530 535 540 Glv Glv Thr Tvr Arg Glv Glu Ala Glv Tvr Ala lie Glv Tvr Ser Ser 545 ' ' 550 ' ' 555 ' ' 560 lie Ser Asp Glv Glv Asn Trp lie lie Lvs Glv Thr Ala Ser Glv Asn 565 570 575 Ser Arg Gly His Phe Glv Ala Ser Ala Ser Val G1y Tvr Gin Trp 580 585 ' 590 <210' 13 <211 1457 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400 13 Met Lvs Thr Thr Asp Lvs Arg Thr Thr Glu Thr His Arg Lvs Λ1 a Prn 1 5 10 15 Lvs Thr Glv Arg lie Arg Phe Ser Pro Ala Tvr Leu Ala lie Cvs Leu ' 20 25 30 Ser Phe Glv lie Leu Pro Gin Ala Trp Ala Gly His Thr Tyr Phe Glv 35' 40 45 ' lie Asn Tvr Gin Tvr Tyr Arg Asp Phe Ala Glu Asn Lvs Gly Lys Phe 50 55 60 ~ ' Ala Val Glv Ala Lvs Asp lie Glu Val Tvr Asn Lvs Lvs Glv Glu Leu 65 ' 70 ' 75 > ' ' 80 Val Gly Lys Scr Met Thr Lys Ala Pro Met lie Asp Phe Scr Val Val 85 90 95
[0016] Ser Arg Asn Glv Val Ala Ala Leu Val Glv Asp Gin Tyr He Val Ser 100 105 110 Val Ala Ills Asn Gly Glv Tyr Asn Asn Val Asp Phe Glv Ala Glu Glv 115 - 12〇 125 ' Arg Asn Pro Asp Gin His Arg Phe Thr Tvr Lys lie Val Lys Arg Asn 130 135 140 Asn Tyr Lys Ala Gly Thr Lvs Glv Ilis Pro Tyr Glv Glv Asp Tyr Ills 145 150 155 ' 160 Met. Pro Arg Leu Ills Lys Phe Val Thr Asp Ala Glu Pro Val GIu Met 165 170 175 Thr Ser Tvr Met Asp G1y Arg Lvs Tvr He Asp Gin Asn Asn Tvr Vro 180 185 190 Asp Arg Val Arg He Gly Ala Gly Arg Gin Tyr Trp Ai'g Ser A.sp Glu 195 200 205 Asp Glu Pro Asn Asn Arg Glu Ser Ser Tvr His lie Ala Ser Ala Tvr 210 215 ' 220 ' Ser Trp Leu Val (ilv (Uv Asn Thr Phe Ala Gin Asn Glv Ser (Uy Glv 225 230 235 ' 240 Glv Thr Val Asn Leu Glv Ser Glu Lvs He Lys His Ser Pro Tvr Glv 245 250 255 Phe Leu Pro Thr (ily Glv Ser Phe Gly Asp Ser Glv Ser Pro Met Phe 260 ^ " 265 ' 270 lie Tvr Asp Ala Gin Lys Gin Lys Trp Leu lie Asn G1y Val Leu Gin ' 275 - 280 285 Thr Glv Asn Pro Tyr lie Glv Lvs Ser Asn Glv Phe Gin Leu Val Arg 290 295 300 Lvs Asp Trp Phe Tvr Asp Glu lie Phe Ala CAv Asp Thr His Ser Va] 305 310 3?5 320 Phe Tvr Glu Pro Αγκ Gin Asn Glv Lvs Tvr Ser Phe Asn Asp Asp Asn 325 330 335 Asn Glv Thr Glv Lvs lie Asn Ala Lvs His Glu His Asn Ser Leu Pro ' 340 345 350 Asn Arg Leu Lvs Thr Arg Thr Val Gin Leu Phe Asn Val Ser Leu Ser 355 360 365 Glu Thr Ala Arg Glu Pro Val Tvr His Ala Ala Glv Civ Val Asn Ser 370 375 380 ' Tvi' Arg Pro Arg Leu Asn Asn Glv Glu Asn lie Ser Phe lie Asp Glu 385 390 ^ 395 400 Glv Lys Glv Glu Leu lie Leu Thr Ser Asn lie Asn Gin Glv Ala Glv '^ ' 405 410 415 ' Gly Leu Tyr Phe Gin Gly Asp Phe Thr Val Ser Pro Glu Asn Asn Glu "420 ' 425 430 Thr Trp Gin Glv Ala Glv Val His lie Ser Glu Asp Ser Thr Val Thr 435 440 445 Trp Lys Val Asn Gly Val A]a Asn Asp Arg Leu Ser Lys lie Glv Lvs 450 455 460 Gly Thr Leu His Val Gin Ala Lvs 〇1y Glu Asn Gin Glv Ser lie Ser 465 470 ' > 475 ' 480 Val Gly Asp Glv Thr Val lie Leu Asp Gin (Un Ala Asp Asp Lvs Gly 485 490 495 Lys Lys Gin Ala Phe Ser Glu He Gly Leu Val Ser Glv Arg Glr Thr
[0017] 500 505 510 Val Gin Leu Asn Ala Asp Asn Gin Phe Asn Pro Asp Lys Leu Tvr Phe 515 520 525 Gly Phe Arg Gly Glv Arg Leu Asp Leu Asn Glv His Ser Leu Ser Phe 530 ' ' 535 540 His Arg lie Gin Asn Thr Asp Glu Gly A丄a Met lie Val Asn His Asn 545 550 555 560 (--η Asp Lvs Glu Ser Thr Val Thr lie Thr Glv Asn Lys Asp lie Ala ' 565 570 ' ' 575 Thr Thr Glv Asn Asn Asn Ser Leu Asp Ser Lys Lys Glu lie Ala Tyr 580 585 590 Asn Glv Trp Phe Glv Glu Lvs Asp Thr Thr Lys Thr Asn G1v Arg Leu 595 600 605 Asn Leu Val l>r Gin Pro Aia A丄a Giu Asp Arg Thr Leu Leu Leu Ser 610 ' 615 620 Gly Γτ?ν Thr Asn Leu Asn Gly Asn lie Thr Gin Thr i\sn Gly Lys Leu 625 " 630 ^ 635 ^ ' 640 Phe Phe Ser G1y Arg Pro Thr Pro His Ala Τυγ Asn His Leu Asn Asp 645 650 655 His Trp Ser (Un Lvs Glu G丄v He Pro Arg Glv Giu 丄ie Vai F'rp Asp 660 ' 665 - 670 Asn Asp Trp lie Asn Arg Thr Phe Lvs Ala Glu Asn Phe G]n He Lvs 675 680 6B5 Glv Glv Gin Ala Val Val Ser Arg Asn Val Ala Lvs Val Lvs G1y Asp 690 695 700 Trp His Leu Ser Asn His A丄a G丄n Aia Va丄 Phe (Uv Val Ala Pro His 705 710 715 ' 720 Gin Ser His Thr lie Cvs Thr Arg Ser Asp Trp Thr Gly Leu Thr Asn 725 730 ' 735 Cys Val Glu Lys Thr lie Thr Asp Asp Lvs Val He Ala Ser Leu Thr 740 745 750 Lys Thr Asp lie Ser (Uv Asn Val Asp Leu Ala Asp His Aia tiis Leu 755 ' 760 765 Asn Leu Thr Gly Leu Ala Thr Leu Asn Glv Asn Leu Ser Ala Asn Gly 770 ' 775 780 Asp Thr Atr Τυγ Thr Val Ser His Asn Ala Thr Gin Asn Glv Asn Leu 785 790 795 800 Ser Leu Val Gly Asn Ala Gin Ala Thr Phe Asn Gin Ala Thr Leu Asn 805 810 815 Glv Asn Thr Ser Ala Ser Glv Asn Ala Ser Phe Asn Leu Ser Asp His 820 825 830 Ala Val Gin Asn Glv Ser Leu Thr Leu Ser Glv Asn Ala Lvs Ala Asn 835 840 845 Val Ser Mis Ser A_La· Leu Asn (iiv Asn Va丄 Sef Leu Aia Asp Lvs A丄a 850 855 ' 860 ' Val Phe His Phe Glu Ser Ser Arg Phe Thr Gly Gin lie Ser Gly Glv 865 870 875 880 Lys Asp Thr Ala Leu His Leu Lys Asp Ser Glu Trp Thr Leu Pro Ser 885 890 895 Gly Thr Glu Leu Gly Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ala Thr lie Thr Leu 900 905 910
[0018] Asn Ser Ala Tvr Arg His Asp Ala Ala Gly Ala Gin Thr Gly Ser A.la 915 920 925 Thi' Asp Ala Pro Arg Arg Arg Scr Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Leu 930 935 940 Ser Val Thr Pro Pro Thr Ser Val Glu Ser Arg Phe Asn Thr Leu Thr 945 950 955 960 Val Asn G1y Lys Leu Asn Glv Gin Glv Thr Phe Arg Phe Met Ser Glu "' 965 ' 970 975 Leu Phe G1y Tvr Arg Ser Asp L}^s Leu Lvs Leu Ala Glu Ser Ser Glu 980 985 990 Glv Thr Tvr Thr Leu Ala Val Asn Asn Thr Glv Asn Glu Pro Ala Ser . 995 1000 ' 1005 Leu Glu Gin Leu Thr Val Val Glu Gly Lvs Asp Asn Lvs Pro Leu Ser 1010 1015 - ' 1020 ' Glu Asn Leu Asn Phe Thr Leu Gin Λ?^η Glu His Val Asp Ain Glv ΛΙα 1025 1030 1035 1040 Trp Arg Tyr Gin Leu lie Arg Lvs Asp Glv Glu Phe Arg Leu His Asn ^ 1045 ' 1050 1055 Pro Val Lvs Glu Gin Glu Leu Ser Asp Lvs Leu Glv Lvs Ala Glu Ala "1060 1065 " ' ' 1070 Lvs Lvs Gin Ala Glu Lys Asp Asn Ala Gin Ser Leu Asp Ala Leu lie 1075 1080 1085 Ala Ala Glv Arg Asp Ala Val Glu Lys Thr Glu Ser Val Ala Glu Pro 1090 1095 1100 Ala Arg Gin Ala Glv Glv Glu Asn Val Gly lie MeL Gla Ala Glu Glu 1105 1Π 0 1115 1120 Glu Lvs Lys Arg Val Gin Ala Asp Lvs Asp Thi' Ala Leu Ala Lvs Qln 1125 1130 1135 Arg Glu Ala Glu Thr Arg Pro Ala Thr Thr Ala Phe Pro Arg Ala Arg 1140 1145 1150 Arg Ala Arg Arg Asp Leu Pro Gin Leu Gin Pro Gin Pro Gin Pro Gin 1155 1160 1165 Pro Gin Arg Asp Leu lie Ser Arg Tvr Ala Asn Ser Glv Leu Ser Glu 1170 1175 ~ 1180 Phe Ser Ala Thr Leu Asn Ser Val Phe Ala Val Gin Asp Glu Leu Asp 1185 1190 1195 1200 Arg Val Phe Ala Glu Asp Arg Arg Asn Ala Val Trp Thr Ser Glv lie 1205 1210 1215 Arg Asp Thr Lvs His Tvr Arg Ser Gin Asp Phe Arg Ala Tvr Arg Gin 1220 1225 1230 Gin Thr Asp Leu Arg Gin lie Glv Met Gin Lvs Asn Leu Glv Ser Glv 1235 1240 ' 1245 ' Arg Val GIy lie Leu Phe Ser His Asn Arg Thr Glu Asn Thr Phe Asp 1250 1255 1260 Asp Glv lie Glv Asn Ser Ala Arg Leu Ala His Glv Ala Val Phe Glv 1265 * 1270 1275 1280 Gin Tvr Glv lie Asp Arg Phe Tvr lie Glv lie Ser Ala Glv Ala Glv ' > 1285 ' 1290 1295 Phe Scr Scr Glv Scr Leu Scr Asp Glv lie Olv Gly Lvs lie Arg Arg 1300 1305 ' ' 1310
[0019] Arg Val Leu His Tyr Gly lie Gin Ala Arg Tyr Arg Ala Gly Phe Gly 1315 1320 1325 GW Phe Γτ?γ lie Glu Pro His lie Glv Ala Thr Arg Tvr Phe Val (lln 1330 1335 ' 1340 ^ Lys Ala Asp Tyr Arg Tvr Glu Asn Val Asn He Ala Tbr Pro Glv Leu 1345 1350 1355 1360 Ala Phe Asn Arg Tvr Arg Ala Glv lie Lvs Ala Asp Tvr Ser Phe Lys 1385 " 1370 ' 1375 ' Pro Ala Gin His lie Ser lie Thr Pro Tvr Leu Ser Leu Ser Tyr Thr 1380 1385 ' 1390 Asp Ala Ala Ser Gly Lvs Val Arg Thr Arg Val Asn Thr Ala Val Leu 1395 1400 1405 Ala Gin Asp Phe Glv Lys Thr Arg Ser Ala Glu Trp Gly Val Asn Ala 1410 1415 1420 Glu lie Lys G1y Phe Thr Leu Ser Leu His Ala Ala Ala Ala Lvs Glv 1425 ' ^ 1430 1435 ' 1440 Pro Gin Leu G丄u Ala Gin His Ser Ala Gly lie Lys Leu Glv Tvr Arg 1445 1450 ' 1455 Trp <210 14 <211, 797 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 14 Met Lys Leu Lys Gin lie Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Glv lie Ser 1 ' '5 10 15 Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Tie Gin Asp lie Arg Val Glu OU 20 25 30 Leu Gin Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tvr Leu Pro Val Lys 35 40 45 Val Giv Asp Thr Tvr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala lie lie Lvs Ser 50^ ' 55 ' 60 ' Leu Tyr Ala Thr Glv Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp 65 70 75 80 Glv Gin Leu Leu Leu Thr Val lie Glu Arg Pro Thr lie Glv Ser Leu " 85 90 95 Asn lie Thr Gly Ala Lvs Met Leu Gin Asn Asp Ala lie Lvs Lvs Asn 100 105 110 Leu Glu Ser Phe Glv Leu Ala Gin Ser Gin Tvr Phe Asn Gin Ala Thr 115 - 120 ' 125 Leu Asn Oln Ala Val Ala Glv Leu Lvs Glu Glu Tyr Leu Civ Arg Gly 130 135 ' 140 ' Lys Leu Asn He Gin lie Thr Pro Lvs Val Thr Lys Leu Λ?α Arg Asn 145 150 155 160 Arg Val Asp lie Asp lie Thr Tie Asp Glu Glv Lvs Ser A]a Lvs lie 165 170 175 Thr Asp lie Glu Phe Glu Glv Asn Oln Va.1 Tvr Ser Asp Arg Lvs Leu 180 ' 185 ' 190 Met Arg Gin Met Ser Leu Thr Glu Glv Gly lie Trp Thr Trp Leu Thr 195 200 ' ' 205 Arg Ser 八sn Gin Phe Asn Glu Gin Lys Phe Ala Gin Asp Met Glu Lys
[0020] 210 215 220 Val Thr Asp Phe Tyr Gin Asn Asn Glv Tvr Phe Asp Phe Arg lie Leu 225 230 ' 235 240 Asp Thr Asp lie Gin Thr Asn Glu Asp Lvs Thr Lys Gin Thr lie Lvs 245 250 255 lie Thr Val His Glu G1y Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lvs Val Set lie 260 265 270 Glu Glv Asp Thr Asn Glu Val Pro Lvs Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu 275 280 285 Thr Met Lvs Pro Gly Lys Trp Tyr Glu Arg Gin Gin Met Thr ALa Val 290 295 300 Leu Glv Glu lie Gin Asn Arg Met G1y Ser Ala Glv Tvr Ala Tvr Ser 305 310 315 32Q Glu lie Ser Val Gin Pro Leu Pro Asn Ala Ghi Thr Lys Thr Val Asp 325 330 335 Phe Val Leu His lie Glu Pro Glv Arg Lys lie Tvr Val Asn Glu lie 340 345 350 His lie Thr Glv Asn Asn Lvs Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu 355 360 " 365 Leu Arg Gin Met Glu Ser Ala Pro Tvr Asp Thr Ser Lvs Leu Gin Arg 370 375 380 Ser Lvs Glu ArR Val Glu Leu Leu G1y Tvr Phe Asp Asn Val Gin Phe 385 390 395 400 Asp Ala Val Pro Leu Ala Glv Thr Pro Asp Lvs Val Asp Leu Asn Met 405 410 415 Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala G1y Trp 420 425 430 * Val Γτ?η Asp Thr Glv Leu Val Met Ser Ala Glv Val Ser Gin Asp Asn 435 440 445 Leu Phe Glv Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys 450 455 460 Thr Thr Leu Asn (ilv Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tvr Phe Thr Ala 465 470 475 480 Asp Glv Val Ser Leu Gly Tyr Asp Val Tvr Glv Lvs Ala Phe Asp Pro 485 ' 490 495 Arg Lvs Ala Ser Thr Ser lie Lvs Gin Tvr Lys Thr Thr Thr Ala Glv 500 505 510 Ala Glv lie Arg Met Ser Val Pro Vai Thr Glu Tvr Asp Arg Val Asa 515 520 525 Phe Glv Leu Val Ala Glu His Leu Thr Val Asn Thr Tvr Asn Lys Ala 530 535 540 Pro Lvs His Tyr Ala Asp Phe lie Lvs Lvs Tvr Glv Lvs Thr Asp Glv 545 550 555 ' 56D Thr Asp Glv Ser Phe Lys Glv Trp Leu Tvr Lvs Glv Thr Val Gly Trp 565 570 575 Gly Arg Asn Lvs Thr Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Glv Tyr Leu 580 585 590 Thr Glv Val Asn Ala Glu lie Ala Leu Pro Olv Ser Lvs Leu Girt Tvr 595 600 605 Tvr Ser Ala Thr His Asn filn Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lvs Thr 610 615 620
[0021] Phc Thr l.eu Met Leu Giv Gly Glu Yal Glv lie Ala Gly Gly Tvr Glv 625 630 635 640 Arg Thr Lvs Glu lie Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Glv Glv Glv Leu _ 645 650 655 Glv Ser Val Ar^ Glv Tvr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lvs Val Tyr ' 660 ' ' 665 670 Asp (ilu Tvr Glv (ilu Lvs 丄丄e Ser Tvr i;丄v G_Lv Asn Lvs Lys A丄a Asn 675 ' 680 ' 685 Val Ser Ala Glu Leu Leu Phe Pro Met Pro Glv Ala L^s Asp Ala Arg 690 695 700 Thr Val Arg Leu Ser Leu Phe Ala Asp Ala Glv Ser Val Trp Asp Glv 705 710 715 720 Lvs Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gin ' 725 730 735 Asn lie Tvr Gly Ala Glv Asn Thr His Lvs Ser Thr Phe Thr Asn Glu "740 ^ 745 750 Leu Arg Tvi Ser Aia G_Lv A_La Va丄 Thr 1'rp Leu Ser Pro Leu G_Lv " 760 76h " Pro Met Lvs Phe Ser Tvr Ala Tyr Pro Leu Lvs Lys Lys Pro Glu Asp 770 775 780 Gin Tie Gin Arg Phe Gin Phe Gin I,en Glv Thr Thr Phe 785 790 795 <210.. 15 <211 6 <212 PRT <213. 人工序列 <220 <223 接头 <400. 15 Glv Ser Gly GIy Glv Glv 1 - 5 <210 - 16 <211 8 <212 PRT <213 人工序列 <220 <223 接头 <400 16 Glv Ser Glv Ser Glv Glv Gly Glv 1 5 <210 17 <211 IS <212^ DNA <213^ 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 17 tttgcggggg gggggggg 18 <210> 18 <211> 35 <212^ DNA <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria niemngitidis) <400> 18 ttgacaggcg gaaggaatac tttataattc gcaac 35 CIO 19 <211 791
[0022] <212> PRT <213/ 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 19 Met Lys Pro Leu Gin Met Leu Pro lie Ala Ala Leu Val G3v Ser lie 1 5 10 15 Phe G]y Asn Pro Val Leu Ala Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr 20 25 30 Pro Val Lvs Ala Glu lie Lvs Ala Val Arg Val Lys Glv Gin Arg Asn 35 40 45' Ala Pro Ala Ala Val Glu Arg Val Asn Leu Asn Arg He Lvs Gin Glu 50 55 60 ' Met 11c Arg Asp Asn Lvs Asp Leu Val Arg Tvr Scr Thr Asp Val (rly G5 70 7?3 80' Leu Ser Asp Ser Glv Arg His Gin Lvs Glv Phe Ala Val Arg Glv Val 85 90 95 Glu Glv Ayn Arg Val Gly Val Ser lie Aap Glv Veil Asn Leu Pro Ayp 100 105 110 Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser 115 120 ' 125 Arg Leu Ser lie Asp Pro Glu Leu Val Arg Asn lie Glu lie Val Lys 130 135 140 GIy Ala Asp Ser Phe Asn Thr Glv Ser Glv Ala Leu Glv Gly Glv Val 145 150 ' 155 160 Asn Tvr Gin Thr Leu Gin Glv Arg Asp Leu Leu Leu Asp Asp Arg Gin .165 170 175 Phe Glv Val Mel MeL Lvs Ayn Glv Tvr Ser Tl:ir Arg Asn Arg Glu Trp ' 180 ' i85 190 Thr Asn Thr Leu Glv Phe Glv Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala 195 ' 200 205 Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Glv His Glu Thr Glu Ser Ala Glv Asn 210 215 > 220 > Arg G]v Tvr Ala Val Glu Glv Glu Gly Ser Glv /Ua Asn He Arg G]y 225 230 235 240 Ser Ala Arg Glv lie Pro Asp Ser Ser Lvs His Lvs Tvr His Ser Phe 245 250 255 Leu Glv Lvs lie Ala Tvr Gin lie Asn Asp Asn His Arg lie Glv Ala 260 265 270 Ser Leu Asn Glv Gin Gin Glv His Asn Tvr Thr Val Glu Glu Ser Tvr 275 ' 280 285 ' Asn Leu Thr A丄a Ser Ser Trp Arg Giu Aia Asp Asp Val Asn Arg Arg 290 295 300 Arg Asn Ala Asn Leu Phe 丁vr (Uu Trp Met Pro Asp Ser Asn Trp Lou 305 310 315 320 Ser Ser T.eii l.vs Ala. Asp Phe Asp Tvr Gin Lvs Thr Lvs Val Ala Ala ' 325 330 ' 335 Val Asn Asn Lvs Glv Ser Phe Pro Met Asp Tvr Ser Thr Trp Thr Arg 340 " 345 ' 350 Asn Tvr Asn Gin Lvs Asp Leu Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser Met Asp ' 355 ' 360 ' 365 Thr Arg Phe Lvs Arg Phe Thr Leu Arg Leu Asp Ser His Pro Leu Gin 370 375 380
[0023] Leu Gly Gly Gly Arg His Arg Leu Ser Phe Lys Thr Phe Vai Ser Arg 385 ' 390 395 400 Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp Tyr Tvr Phe Ser G1y Arg 405 410 ' 415 Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His Pro Val Lvs Thr Thr Asn 420 425 430 Tyr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin lie Gin Trp Asn Asp Val Phe Ser ' 435 440 445 Ser Arg Ala Gly lie Arg Tvr Asp His Thr Lys Met Thr Pro Gin Glu 450 455 ' 460 Leu Asn Ala Glu Cys His Ala Cvs Asp Lvs Thi" Pro Pro Ala Ala Asn 465 470 475 480 Thr Tyr Lvs G]v Ti'p Ser Glv Phe Val Glv Leu Ala Ala Gin Leu Asn 485 490 495 Gin Ala Trp His Val Gly Tvr Asp lie Thr Ser Glv Tvr Arg Val Pro 500 ' 505 ' 510 Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe Thr Tvr Asn His G丄v &r Glv Asn Trp 515 " 520 525 Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs Ala Glu Arg Ser Thr Thr His Thr Leu 530 535 540 Ser Leu Gin Gly Arg Ser Glu Lys Gly Met Leu Asp Ala Asn Leu Ττγ 545 550 - 555 560 Gin Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu Glu Gin Lvs Leu Thr Thr ' 565 570 ' 575 Ser Glv Thr Pro Gly Cvs Thr Glu Glu Asn Ala Tyr Tyr Glv lie Cvs ' 580 ' - 5H5 ' - 590 ' Scr Asp Pro Tvr Lvs Glu Lvs Leu Asp Trp Γ.3η Met Lvs Asn lie Asp 595 600 605 Lys Ala Arg lie ArK Glv lie Glu Leu Thr Glv Arg Leu Asn Val Asp 610 615 620 Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu G1y Trp Lys Leu Phe Glv Ser Leu 625 630 ' 635 ' 640 Glv Tvr Ala Lvs Ser Lvs Leu Ser Gly Asp Asn Ser Leu Leu Ser Thr ' > ' 645 650 655 Gin Pro Leu Lts Val lie Ala Glv lie Asp Tyr Glu Ser Pro Ser Glu 660 665 ' 670 Lys Trp Glv Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr Leu Glv Ala Lvs Lys Ala 675 680 685 Lvs Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tyr Glu Asn Lvs Glv Trp Glv Thr Pro ' 690 ' 695 ' 700 ' Leu Gin Lvs Lys Val Lvs Asp Tvr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser Ala Tvr 705 " 710 ' Π 5 ' 720 Val Phe Asp Met Tvr G1y Phe Tvr Lvs Pro Ala Lys Asn Leu Thr Leu 725 730 735 Arg Ala Glv Val Tvr Asn Val Phe Asn Arg L\'s Tvr Thr Thr Trp Asp 740 745 750 Ser Leu Arg Gly Leu Tvr Ser Tvr Ser Thr Thr Asn Ser Val Asp Arg 755 ' ' 760 765 Asp Glv Lvs Glv Leu Asp Arg Tvr Arg Ala Pro Ser Arg Asn Tvr Ala 770 775 780 ' Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe
[0024] 785 790 <210 20 <211 147 <212 PRT <213/ 脑膜炎奈瑟球菌（iNeisseria meningitidis ) <400 20 Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr Pro Val Lys Ala Glu lie Lys 15 10 15 /^la Val Arg Val Lys G1y Gin Arg Asn Ala Pro Ala Ala Yal Glu Arg 20 25 30 Val Asn Leu Asn Arg lie Lys Gin Glu Met lie Arg Asp Asn Lys Asp 35 40 45 Leu Val Arg Tvr Ser Thr Asp Val GIy Leu Ser Asp Ser Glv Arg His 50 _ ' 55 60 Gin Lvs Gly Phe Ala Val Arg Gly Val Glu Glv Asn Arg Val Glv Val 65 70 75 80 Ser lie Asp Glv Val Asn Leu Pro Asp Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr 85 90 95 Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser Arg Leu Ser He Asp Pro Glu 100 106 110 Leu Val Arg Asn lie Glu lie Val Lvs Glv Ala Asp Ser Phe Asn Thr 115 120 125 Glv Ser Glv Ala Leu Gly Glv Glv Val Asn Tvr Gin Thr Leu Gin Glv 130 135 140 Arg Asp Leu 145 <210 21 <211 621 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meninKitidis ) <400 21 Leu Leu Asp Asp Arg Gin Phe Gly Val Met Met Lys Asn Glv Tvr Ser 1 5 10 15 Thr Arg Asn Arg Glu Trp Thr Asn Thr Leu Glv Phe Glv Val Ser Asn 20 25 30 Asp Arg Val Asp Ala Ala Leu Leu Tvr Ser Gin Arg Arg Glv His Glu 35 40 45 Thr Glu Ser Ala Glv Asn Arg Glv Tvr Ala Val Glu Glv Glu Gly Ser 50 55 60 Glv Ala Asn lie Arg Glv Ser Ala Arg Glv lie Pro Asp Ser Ser Lvs 65 70 75 80 His Lvs Tvr His Ser Phe Leu GIy Lvs lie Ala Tvr Gin lie Asn Asp B5 90 95 Asn His Arg Tic Glv Ala Ser Leu Asn Glv G]n Gin Glv His Asn Tvr 100 105 110 Thr Val Glu Glu Ser Tvr Asn Leu Thr Ala Ser Ser Trp Arg Glu Ala 115 " 120 125 Asp Asp Val Asn Arg Arg Arg Asn Ala Asn Leu Phe Tvr Glu Trp Met 130 135 140 Pro Asp Ser Asn Trp Leu Ser Ser Leu Lvs Ala Asp Phe Asp Tvr Gin 145 150 155 ' 160 Lvs Thr Lys Val Ala Ala Val Asn Asn Lys Glv Ser Phe Pro Met Asp ' " 165 170 ' 175
[0025] Tyr Ser Thr Trp Thr Arg Asn Tvr Asn Gin Lys Asp Leu Asp Glu He 180 185 190 Tvr Asn Arg Ser Met Asp Thr Arg Phe Lvs Arg Phe Thr Leu Arg Leu ' 195 200 ' 205 Asp Ser His Pro Leu Gin Leu Gly G1 y G1 v Arg His Arg I.eu Ser Phe 210 215 ' 220 Lys Thr Phe Val Ser Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp 225 230 235 240 Tyr Tvr Phe Ser Glv Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser lie Gin His ' 245 250 255 Pro Val Lvs Thr Thr Asn Tvr Glv Phe Ser Leu Ser Asp Gin lie Gin 260 265 270 Trp Asn Asp Val Phe Ser Ser Arg Ala Glv lie Arg Tvr Asp His Thr 275 280 285 Lvs Met Thr Pro Gin Glu Leu Asn Ala Glu Cvs His Ala Os Asp Lys ' 290 295 300 ' ' Thr Pro Pro Ala Ala Asn Thr Tyr Lvs Glv Trp Ser (ilv Phe Val Glv 305 310 315 320 Leu Ala Ala Gin Leu Asn Gin Ala Trp His Val Gly Tyr Asp lie Thr 325 330 335 Ser Glv Tyr Arg Val Pro Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe Thr Tyr Asn ' ^ 340 345 > 350 His Glv Ser Glv Asn Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs Ala Glu Arg 355 ' 360 365 Ser Thr Thr His Thr Leu Ser Leu Gin Glv Arg Ser G]u Lvs Glv Met 370 375 380 Leu Asp Ala Asn Leu Tvr (iln Ser Asn Tvr Arg Asn Phe Leu Ser Glu 385 390 ' 395 400 Glu Gin Lvs Leu Thr Thr Ser Glv Thr Pro Gly Cvs Thr Glu Glu Asn 405 410 415 Ala Tvr Tvr Glv lie Cvs Ser Asp Pro Tvr Lvs Glu Lvs Leu Asp Trp ' ' 420 ' 425 ' 430 Gin Met Lvs Asn lie Asp Lvs Ala Arg lie Arg Glv lie Glu Leu Thr 435 ' 440 445 Glv Arg Leu Asn Yal Asp Lvs Val Ala Ser Phe Val Pro Glu Glv Trp 450 455 460 Lvs Leu Phe Glv Ser Leu Glv Tvr Ala Lys Sei' Lvs Leu Scr Gly Asp 465 470 475 480 Asn Ser l.eu Leu Ser Thr Gin Pro i.eu l.vs Val Π e Ala. Glv T1 e Asp 485 490 495 Tvr Glu Ser Pro Ser Glu Lvs Trp Gly Val Phe Ser Arg Leu Thr Tvr 500 505 510 ' Leu Glv Ala Lvs Lys Ala Lvs Asp Ala Gin Tvr Thr Val Tvr Glu Asn 515 ' 520 ' 525 Lvs Glv Trp Glv Thr Pro Leu Gin Lvs Lvs Val Lvs Asp Tvr Pro Trp ' 530 > 535 ' 540 ' Leu Asn Lvs Ser Ala Tvr Val Phe Asp Met Tvr Gly Phe Tvr Lvs Pro 545 ^ 550 555 ' - ' 560 Ain Lys Asn Leu Thr Leu Arg Ala Glv Val Tyr Asn Val Phe Asn Arg B65 570 575
[0026] Lys Tyr Thr Thr Trp Asp Ser Leu Arg Glv Leu Tyr Ser Tyr Ser Thr 580 585 ' ^ 590 Thr Asn Ser Val Asp Arg Asp Glv Lvs Glv Leu Asp Arg T\r Arg Ala 595 600 605 Pro Ser Arg Asn Tyr Ala Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe 610 615 620 <210 22 <211 768 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <4QQ\ 22 Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr Pro Val Lvs Ala Glu lie Lys 15 10 15 Ala Val Arg Val Lys Gly Gin Arg Asn Ala Pro Ala Ala Va] Glu Arg 20 25 30 Val Asn Leu Asn Arg lie Lvs Gin Glu Met lie Arg Asp Asn Lys Asp 35 40 45 Leu Val Arg Tyr Ser Thr Asp Va丄 G1y Leu Ser Asp Ser Glv Arg His 50 ' 55 ' 60 ' Gin Lys Gly Phe Ala Val Arg Glv Vai Glu Gly Asn Arg Val GIy Val 65 70 75 80 Ser lie Asp Gly Val Asn Leu Pro Asp Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tvr 85 90 95 Ala Arg Tvr Glv Asn Phe Asn Ser Ser Arg Leu Ser lie Asp Pro Glu ' 100 105 110 Leu Val Arg Asn lie Glu lie Val Lvs Glv Ala Asp Ser Phe Asn Thr 115 120 ' 125 Glv Ser Glv Ala Leu Gly Gly Glv Val Asn Tvr Gin Thr Leu 〇]n G]v 130 135 140 Arg Asp Leu Leu Leu Asp Asp Arg Gin Phe Glv Val Met Met Lvs Asn 145 150 155 160 Glv Tvr Ser Thr Arg Asn Arg Glu Trp Thr Asn Thr Lea Glv Phe Glv ' ' 165 170 175 ' Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala Leu Leu Tyr Ser Gin Arg Arg 180 185 190 Glv His Glu Thr Glu Ser Ala Glv Asn Arg G1y Tvr Ala Val Glu Glv ^ 195 200 205 ' Glu Glv Ser Glv Ala Asn He Arg Glv Ser Ala Arg Glv lie Pro Asp 21?) 215 . " 220 Ser Ser Lvs His Lvs Tvr His Ser Phe Leu Glv Lvs lie Ala Tvr Gin 225 - ' 230 235 ' 240 lie Asn Asp Asn His Arg lie Glv Ala Ser Leu Asn Gly Gin Gin Gly 245 ' 250 255 ' His Asn Tvr Thr Val Glu Glu Ser TVr Asn Leu Thr Ala Ser Ser Trp 260 265 270 Arg Glu A]a Asp Asp Val Asn Arg Arg Arg Asn Ala Asn Leu Phe Tyr 275 280 285 Glu Trp Met Pro Asp Ser Asn Trp Leu Ser Ser Leu Lvs Ala Asp Phe 290 295 300 Asp Tvr Gin Lys Thr Lys Val Ala Ala Val Asn Asn Lvs Glv Ser Phe 305 310 315 ' ' 320 Pro Met Asp Tyr Ser Thr Trp Thr Arg Asn T\r Asn Gin Lys Asp Leu
[0027] 325 330 335 Asp Glu lie Tvr Asn Arg Ser Met Asp Thr Arg Phe Lvs Arg Phe Thr 340 345 350 Leu Arg Leu Asp Ser His Pro Leu Gin Leu Glv Glv Glv Arg His Arg 355 360 365 Leu Ser Phe Lvs Thr Phe Val Ser Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn 370 375 380 Ar^ Asp Asp Tvr Tvr Phe Ser G1y Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser 385 390 395 400 lie Gin His Pro Val Lvs Thr Thr Asn Tvr G]v Phe Ser Leu Ser Asp 405 410 415 Gin lie Gin Trp Asn Asp Val Phe Ser Ser Arg Ala Glv He Arg Tvr 420 425 430 Asp His Thr Lvs Met Thr Pro Gin Glu Leu Asn Aia Glu Cys His Ala 435 440 445 Cvs Asp Lvs Thr Pro Pro Ala Ala Asn Thr Tvr Lvs Glv Trp Ser Glv 450 455 460 Phe Val G1y Leu Ala Ala Gin Leu Asn Gin Ala Trp His Val Gly Tvr 465 470 475 480 Asp lie Thr Ser Glv Tvr Arg Val Pro Asn Ala Ser Glu Val Tvr Phe 485 490 495 Thr Tvr Asn His Glv Ser Glv Asn Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lvs 500 505 510 Ala Glu Arg Ser Thr Thi' His Thr Leu Ser Leu Gin Glv Arg Ser Glu 515 520 525 Lvs Glv Met Leu Asp Ala Asn Leu Tvr Gin Ser Asn Tvr Arg Asn Phe 530 535 540 Leu Ser Glu Glu (iln Lvs Leu Thr Thr Ser Glv Thr Pro Gly Cvs Thr 545 550 555 560 Glu Glu Asn Ala Tvr Tyr Gly lie Cys Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Lvs 565 570 " 575 Leu Asp Trp Gin Met Lvs Asn lie Asp Lvs Ala Arg lie Arg Glv lie 580 585 590 Glu Leu Thr Gly Arg Leu Asn Val Asp Lys Val Ala Ser Phe Val Pro 595 600 605 Glu Glv Trp Lys Leu Phe Glv Ser Leu Glv Tvr Ala Lys Ser Lys Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Asn Ser Leu Leu Ser Thr Gin Pro Leu Lys Val lie Ala 625 630 635 640 Gly lie Asp Tvr Glu Ser Pro Ser Glu Lvs Trp Glv Val Phe Ser Arg 645 650 655 I,eu Thr Tvr Leu Glv Ala Lys Lys Ala Lvs Asp Ala Gin Tvr Thr Val 660 665 670 Tvr Glu Asn Lvs Glv Trp Glv Thr Pro Leu Gin Lys Lvs Val Lvs Asp - 675 680 ' 685 . Tvr Pro Trp Leu Asn Lvs Ser Ala Tvr Val Phe Asp Met Tvr G1y Phe 690 " 695 ' 700 Tvr Lvs Pro Ala Lvs Asn Leu Ttir Leu Arg Ala, Glv Val Tvr A.sn Val 705 ^ 710 715 " ^ 720 Phe Asn Arg Lvs Tvr Thr Thr Trp Asp Ser Leu Arg Glv Leu Tvr Ser 725 730 735
[0028] Tyr Ser Thr Thr Asn Ser Val Asp Arg Asp 01v Lys Glv Leu Asp Arg 740 745 750 Tvr Arg Ala Pro Ser Arg Asn Tvr Ala Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe ' 755 760 765 ' <210 23 <211 915 <212 PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis ) <400 23 Met Gin Gin Gin His Leu Phe Arg Phe Asn lie Leu Cys Leu Ser Leu 15 10 15 Met Thr Ala Leu Pro Ala Tvr Ala Glu Asn Val Gin Ala Glv Gin Ala 20 ' 25 30' Gin Glu Lvs Gin Leu Asp Thr lie Γτ?η Val Lys Ala Lys Lvs Gin Lvs 35 40 45 Thr Arg Arg Asp Asn Glu Va丄 Thr Giv Leu Glv Lvs Leu Val Lvs Ser 50 55 ' 6() ' Ser Asp Thr beu Ser tvs Glu G丄n Vai Leu Asn lie Arg Asp Leu Thr 65 70 75 80 krg Tvr Asp Pro Glv lie Ala Val Val Glu Gin Glv Arg Glv Ala Ser ^ 85 90 ' 95 Ser Glv Tvr Ser lie Arg Glv Met Asp Lys Asn Arg Val Ser Leu Thr 100 ' 105 110 Val Asp Gly Val Ser Gin lie Gin Ser Tvr Thr Ala Gin Ala Ala Leu 115 120 ' 125 Glv Glv Thr Arg Thr Ala Glv Ser Ser Giy Ala lie Asn Glu lie Glu 130 135 140 Tvr Glu Asn Vnl Lvs Ala Val Glu lie Scr Lvg Gly Scr Asn Scr Val 145 150 155 160 Glu Gin Glv Ser Glv Ala Leu Ala Glv Ser Val Ala Phe Gin Thr Lvs 165 170 175 Thr Ala Asp Asp Val lie Glv Glu Glv Ai'g Gin Trp Gly lie Gin Ser 180 185 190 Lys Thr Ala Tvr Ser Gly Lvs Asn Arg Glv Leu Thr Gin Ser lie Ala ^ 195 200 ' 205 Leu Ala Gly Arg lie Glv Glv Ala Glu Ala Leu Leu He His Thr Glv 210 ' 215 220 ' Arg Ai'g Ala Glv Glu lie Arg Ala His Glu Asp Ala Glv Arg Gly Vnl 225 230 235 ' 240 Oln Ser Phe Asn Arg Leu Val Pro Val Glu Asp Ser Ser Asn Tvr Ala 245 250 255 Tvr Phe He Val Lvs Glu Glu Cvs Lvs Asn Glv Ser Tvr Glu Thr Cvs 260 265 ' 270 Lvs Ala Asn Pro Lvs Lvs Asp Val Val (ilv Lys Asp G_Lu Arg Gin Thr ' 275 ' 280 ' 285 Val Ser Thr Arg Asp Tvr Thr Glv Pro Asn Arg Phe Leu Ala Asp Pro 290 295 300 Leu Ser Tyr Glu Ser Arg Ser Trp Leu Phe Arg Pro Glv Phe Arg Phe 305 - 310 315 ' 320 Glu Asn Lys Arg His Tyr lie Gly Gly lie Leu Glu His Thr Gin Gin
[0029] 325 330 335 Thr Phe Asp Thr Ar^ Asp Met Thr Val Pro Ala Phe Leu Thr Lys Ala 340 345 350 Val Phe Asp Ala Asn Lys Lvs Gin Ala Glv Ser Leu Pro Glv Asn Glv 355 360 365 Lvs Tvr Ala Gly Asn His Lvs Tvr Gly Gly Leu Phe Thr Asn Gly Glu 370 375 380 Asn Glv Ala Leu Val G1y Ala Glu Tvr Glv Thr Glv Val Phe Tvr Asp 385 390 395 400 Glu Thr His Thr Lvs Ser Ar^ Tyr G1y Lcu G]u Tyr Val Tvr Thr Asn 405 410 415 Ala Asp Lvs Asp Thr Trp Ala Asp Tvr Ala Arg Leu Ser Tvr Asp Arg 420 425 430 " Gin Glv lie Glv Leu Asp Asn His Phe Gin Gin Thr His Cvs Ser Ala 435 440 445 Asp Glv Ser Asp Lvs Tvr Cvs Arg Pro Ser Ala Asp Lvs Pro Phe Ser 450 455 460 Tvr Tvr Lvs Ser Asp Arg Val He Tvr Glv Glu Ser His Arg Leu Leu 465 470 475 480 Gin Ala Ala Phe Lvs Lys Ser Phe Asp Thr Ala Lvs lie Arg His Asa 485 490 495 Leu Ser Val Asn Leu Gly Phe Asp Arg Phe Glv Ser Asn Leu Arg His 500 ' 505 ' 510 Gin Asp Tvr Τλγγ Tyr Gin His Ala Asn Arg A]a Τγτ Ser Ser Asn Thr 515 520 525 Pro Pro Gin Asn Asn G1y Lvs Lys lie Ser Pro Asn Glv Ser Glu Thr 530 535 540 her Pro TVr Trp Val Thr lie Glv Arg G_Lv Asn Val Val Thr G1y Gin 545 550 555 560 lie Cys Arg Leu (}ly Asn Asn Thr T>r Thr Asp Cys Thr Pro Arg Ser 565 570 575 lie Asn Glv Lvs Ser Tvr Tvr Ala Ala Val Arg Asp Asn Val Arg Leu 580 585 590 Glv Arg Trp Ala Asp Val Glv Ala Gly Leu Arg Tvr Asp Tyr Arg Ser 595 600 605 Thr His Ser Asp Asp Gly Ser Val Ser Thr Gly Thr His Arg Thr Leu 610 615 620 Ser Trp Asn Ala Glv He Val Leu Lys Pro Thr Asp Trp Leu Asp Leu 625 630 635 640 Thr Τυγ Arg Thr Ser Thr Glv Phe Arg Leu Pro Ser Phe Ala Glu Met 645 650 655 Tyr Gly Trp Arg Ala Gly Val G]n Ser Lvs A]a Va] Lys He Asp Pro 660 665 670 Glu Lys Ser Phe Asn Lvs Glu Ala Glv lie Val Phe Lvs Glv Asp Phe ' 675 " 680 " 685 ' Glv Asn Leu Glu Ala Ser Trp Phe Asn Asn Ala Tvr Arg Asp Leu lie 690 695 700 Val Arg Glv Tyr Glu Ala Gin lie Lvs Asp Gly Lvs Glu Glu Ala Lvs 705 710 715 720 Glv Asp Pro Ala Tyr Leu Asn Ala Gin Ser Ala Arg He Thr Gly lie ' 725 730 735
[0030] Asn lie Leu GLy Lys lie Asp Trp Asn Glv Val Trp Asp Lvs Leu Pro 740 745 750 Glu Glv Trp Tvr Ser Thr Phe Ala Tvr Asn Arg Val Arg Va丄 Arg Asp 755 760 765 Tie Lvs I.ys Arg Ala. Asp Arg Thr Asp Tie Gin Ser Hi s I.eu Phe Asp 770 775 780 Ala lie Gin Pro Ser Arg Tvr Val Val Glv Leu Glv Tvr Asp Gin Pro 785 790 795 ' ' 800 Glu Glv Lvs Trp Glv Val Asn Glv Met Leu Thr Τυγ Ser Lvs Ala Lvs ' - 805 810 . 815 Glu lie Thr Glu Leu Leu Glv Ser Arg Ala Leu Leu Asn Gly Asn Ser 820 ' 825 830 Arg Asn Thr Lvs Ala Thr Ala Arg Arg Thr Arg Pro Trp Tyr lie Val 835 840 845 Asp Val Scr Glv Tvr Tvr Thr Val Lvs Lvs His Phe Thr Leu Arg Ala 850 ' 855 ' ' 860 Glv Val Tvr Asn Leu Leu Asn Tyr Arg Tvr Val Thr Trp Glu Asn Val 865 870 875 880 Arg Gin Thr Ala Glv Glv Ala Val Asn Gin His Lvs Asn Val Glv Val 885 ' 890 " 895 Tvr Asn Arg Tyr Ala Ala Pro Glv Arg Asn Tvr Thr Phe Ser Leu Glu . 900 905 ' 910 Met Lvs Phe 915 <210 24 <211 712 <212. PRT <213 脑膜炎奈瑟球菌〔Neisseria meningitidis) <400> 24 Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Gin Ala Ala Met Val Leu Pro Val Phe 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ala Cvs Leu Glv Glv Glv Glv Ser Phe Asp Leu Asp Ser 20 25' 30 Val Asp Thr Glu Ala Pro Arg Pro Ala Pro Lvs Tvr Gin Asp Val Phe 35 40 ' 45 Ser Glu Lvs Pro Gin Ala Gin Lvs Asp Gin Glv Gly Tyr Glv Phe Ala 50 55 60 Met Arg l.eu Lvs Ai'g Arg Asn Trp Tvr Pro Girt Ala Lvs G]u Asp Glu 65 70 75 80 Vr.1 Lys l.eu Asp Glu Ser Asp Trp Glu Ala Thr Glv Leu Pro Asp Gin ^ 85 90 ' 95 Pro Lvs Glu Leu Pro Lvs Arg Gin Lvs Ser Val lie Glu Lvs Val Glu ' 100 ' 105 1?0 Thr Asp Ser Asp Asn Asn lie Tvr Ser Ser Pro Tvr Leu Lvs Pro Ser 115 120 ' 125 Asn His Gin Asn Glv Asn Thr Glv Asn Glv lie Asn Gin Pro Lvs Asn 130 ' 135 140 ' Gin Ala Lvs Asp Tyr Glu Asn Phe Lvs Tvr Val Tvr Ser Glv Trp Phe 145 ^ " i5〇 ' ' 155 ' 160 Tyr Lvs His Ala Lvs Arg Glu Phe Asn Leu Lvs Val Glu Pro Lvs Ser 165 170 175
[0031] Ala Lys Asn Glv Asp Asp Gly Tvr lie Phe Tyr His Gly Lys Glu Pro 180 185 ' 190 Ser Arg Gin Leu Pro Ala Ser Glv Lvs lie Thr Tvr Lvs Glv Val Trp 195 200 205 Ilis Phe Ala Thr Asp Thr Lvs Lvs Gly Gin Lys Phe Arg Glu lie lie 210 215 ^ 220 Gin Pro Ser Lvs Ser Gin Glv Asp Arg Tvr Ser Glv Phe Ser Gl3? Asp 225 230 ' 235 ' 240 Asp Gly Glu Glu Tvr Ser Asn Lys Asn Lys Ser Thr Leu Thr Asp Gly 245 250 255 Gin Glu Glv Tvr Glv Phe Thr Ser Asn Leu Glu Val Asp Phe His Asn 260 265 270 Lys Lys Leu Thr Gly Lys Leu lie Arg Asn Asn Ala Asn Thr Asp Asn ' 275 280 *285 Asn Gin Ala Thr Thr Thr Gin Tvr Tvr Ser Leu Glu Ala Gin Val Thr 290 295 ' 300 (i丄v Asn Arg Phe Asn (Uv Lvs Ala Thr Ala Thr Asp Lvs Pro Gin Gin 305 310 315 ' 320 Asn Sex- Glu Thr Lys Glu His Pro Phe Val Ser Asp Ser Ser Ser Leu 325 330 335 Ser Glv Glv Phe Phe Glv Pro Gin Gly Glu Glu Leu Glv Phe Arg Phe ^ 340 " 345 350 Leu Ser Asp Asp Gin Lys Val Ala Val Val Glv Ser Ala Lys Thr Lvs 355 " 360 ' 365 ' Asp Lys Pro Ala Asn G1y Asn Thr Ala Ala Ala Ser Gly Glv Thr Asp 370 375 380 ' ' Ala Ala Ala Ser Asn Glv A] a Ala Γ.1 v Thr Scr Ser Glu Asn Glv Lvs 385 390 395 400 Leu Thr Thr Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Lvs Leu Gly Asp Lvs Glu 405 410 415 Val Gin Lvs Leu Asp Asn Phe Ser Asn Aia Aia Gin Leu Val Val Asp "420 425 430 Glv lie Met lie Pro Leu Leu Pro Glu Ala Ser Glu Ser Glv Asn Asn ' 435 440 445 ' Gin Ala Asn Gin Gly Thr Asn Glv Glv Thr Ala Phe Thr Arg Lvs Phe 450 ^ 455 ' 460 ' Asp His Thr Pro Glu Ser Asp Lvs Lvs Asp Ala Gin Ala Glv Thr Gin 465 470 475 480 Thr Asn Glv Ala Gin Thr Ala Ser Asn Thr Λ·1α Glv Asp Thr Asn Glv ' 485 490 ' ' Lvs Thr Lys Thr Tvr Glu Val Glu Val Cys Cvs Ser Asn Leu Asn Tyr ' "500 505 510 Leu Lvs Tvr Glv Met Leu Thr Arg Lvs Asn Ser Lvs Ser Ala Met Gin 515 520 525 Ala Glv Glu Ser Ser Ser Gin Ala Asp Ala Lvs Thi' Glu Gin Val Glu 530 535 540 Gin Ser Met Phe Leu Gin Glv Glu Arg Thr Asp Glu Lvs Glu lie Pro 545 550 > 555 > 560 Ser Glu Gin Asn lie Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tvr Gly Tvr lie Ala 565 570 ' ' 575 Asn Asp Lys Ser Thr Ser Trp Ser Gly Asn Ala Ser Asn Ala Thr Ser
[0032] 580 585 590 Glv Asn Arg Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Ala Asp Lvs lie Thr 、 595 600 605 Glv Thr I.en Thr Ala. A.sp Asn Arg Gin Glu Ala. Thr Phe Thr Tie Asp 610 615 620 Glv Asn lie Lvs Asp Asn Glv Phe Glu Glv Thr Ala Lvs Thr Ala Glu 625 630 635 ' 640 Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gin Ser Asn Thr Thr Arg Thr Pro Lvs Ala - 645 650 655 Tyr lie Thr Asp Ala Lvs Val Gin Glv Gly Phe Tvr (ilv Pro Lvs Ala 660 ' 665 ' 670 Glu Glu Leu Glv G1y Trp Phe Ala Tvr Pro Olv Asp Lvs Gin Thr Lvs 675 ' 680 ' 685 > Asn A] a Thr Asn Ala Ser Glv Asn Ser Ser Ala Thr Val Val Phe Γτ?ν 690 695 700 Ala Lys Arg Gin Gin Pro Val Arg 705 710 <210 25 <211> 186 <212> PRT (213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 25 Met Asn Met Lys Thr Leu Leu Ala Leu Ala Val Ser Ala Val Cvs Ser 1 5 10 15 Val Glv Val Ala Gin Ala His Glu His Asn Thr lie Pro Lys Glv Ala " 20 25 30 ' Ser lie Glu Val Lys Val Gin Gin Leu Asp Pro Val Asn Gly Asn Lvs 35 40 45 " Asp Val Glv Thr Val Thr lie Thr Glu Ser Asn Tvr Glv Leu Val Phe 50 ' 55 60 ' Thr Pro Asp Leu Gin Glv Leu Ser Glu Glv Leu His Glv Phe His lie 65 70 75 80 His Glu Asn Pro Sei' Cvs Glu Pro Lys Glu Lvs Glu Glv Lys Leu Thr 85 90 95 Ala (ily Leu Glv Ala Glv Glv His Trp Asp Pro Lys Crlv Ala Lvs Gin - 100 105 110 His Glv Tvr Pro Trp Gin Asp Asp Ala His Leu Glv Asp Leu Pro Ala 115 120 125 Leu Thr Vai Leu His Asp Gly Thr Ala Thr Asn Pro Val Leu Ala Pro 130 135 140 Arg Leu Lvs His Leu Asp Asp Val Arg Glv His Ser Tie Met lie His 145 150 155 160 Thr Glv Glv Asp Asn His Ser Asp His Pro Ala Pro Leu Glv Glv Gly ' - 165 170 175 Gly Pro Arg Met Ala Cvs Olv Val lie Lys 180 ' ' 185 (210 26 (211 16 (212 DNA <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis ) (400 26 tttgrggggg gggggg 16
[0033] <210 21 <211 16 <212 DNA <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 27 tttgcgaggg aggtgg 16 <210 28 <211 17 <2V2 DNA <213/ 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 ttttgcgagg gaggtgg 17 <210 29 <211 16 <212 DNA <213. 脑膜炎奈瑟球齒(Neisseria meningitidis) <400 29 ggcggaagga atactt 16 <210 30 <2U 35 <212 DNA <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 30 ttgacatttg cgagggaggt ggtataattg aagac 35 <210 31 <211 40 <212 DNA <213，脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis) <400 31 aaaaat^gtt ttttgc^gg gggggggtat aattgaagac 40 <210 <211 40 <212 DNA d彳 、丄序列 <220 <23 经修饰的pnrA启动子 <400 32 Taaaatggtt ttTtgrgagg gaggtggtat aattgsagar. 40 <210 33 <*^11 4U <212 DNA <213 脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria mcrnngitidis) <400 33 aaaaattgac atttgegagg gaggtggtat aattgaagac 40 <210 34 <211 40 <212 DNA <213 脑膜炎奈瑟球菌丨丨itMiingiUdls) <40(]> 34 daaHltgaca ttltgcgdgg gagglggtal aaligaagcic 40 <2IO> 35 cm 4〇 <212 DNA d K丄序列 <21^0 杂交rRNA后动子 <100 35
[0034] atatcttgac aggcggangg aatactttat anttcgcaac 40 <210 36 <21L 39 <212 DNA <213. 人工序列 <220 <223 杂交rRNA启动子 <400 36 atatcttgac aggcggaagg aatactttat attcgcaac 39 <210 37 <211 38 <212 DNA <213 λ丄序列 <220、、 <223 - 杂交rRNA启动子 <400> 37 atatcttgac aggcggaagg aatactttta attcgcac 38 <210 3B <211 39 <212 DNA <213 人工序列 <220 <223 杂交rRNA启动子 <400 3S atatcttgac aggcggaagg aaactttata atIcgcaac 39 <210 39 <211 56 <212 DNA <213 人工宇列 <220'、 <223 杂交iRNA启动子 <400 39 glalcggglg 11 Lgcccgat gill L laggL L11 laLcatia l L tacariaag gaagcc 56 <21 0 - 40 <211 42 <212 - DNA <213 人丁序列 <220 <223 杂殳rRNA启动子 <400 10 aaaaatggtt ttttgcgggg ataattgaag ac 42 <210 41 <211 358 <212 DNA <213. 人工序列 <220'v <223,> 启动子区域 <400> 41 cgtctgagtc cccgagtttc agacagcata ttcacaaagg cgcaccagcc ggaggaggga 60 gaggaaagga ttgttggagg cggcgcagta tttagcngsa ataaaaaacc ttatccgaca 120 gcgacatgac gaatttcccc a?aaaaatcc cgctgaaagc attgaccgtt tttccctgtg 1B0 ggcgtatagt tcggttcttc gctgctgcag aagtggcgga cgaactgaaa agtatagcac 240 agaatgttgg ggatatcgag agatatcttg acaggcggaa ggaatacttt ataattcgca 300 acgtatcggg tgtt1:gcccg atgttt十tag gtttttatca aatttacaaa aggaagcc 358 <210 42 <211 35G <212 DNA
[0035] <213 人工序列 <220^ <223> 启动子区域 <220> <221/ misc_feature <222> 318，-319，321 <223/ ' η' 是a, c, g或t <400> 42 cgtctgagtc cccgagtttc agacagcata ttcncanagg cgcaccagcc ggaggaggga 60 gaggaaagga ttgttggagg cggcgcagta tttagcagaa ataaaaaacc ttatccgaca 120 gcga_catgac gaatttcccc aaaaaaatcc cgctgaaagc attgaccgtt tttccctgtg 180 ggcgtatagt tcggttcttc gctgctgcag aagtggcgga cgaactgaaa agtatagcac 240 agaatgttgg ggatatcgag agatatcttg acaggcggaa ggaatacttt atattcgcaa 300 cgtatcgggt gtttgccnna ngtttttagg tttttatcaa atttcaaaag gaagcc 356 〈210. 43 <211 373 <212 DNA 〈213. λ工序列 <22〇\ <223 启动子区域 〈220 <221 misc-士'eature <222 361 ~ <223/ ' n' 是a, c, g或t <400> 43 cgtctgagtc cccgagtttc agacagcata ttcacaaagg cgcaccagcc ggaggaggga 60 gaggaaagga ttgttggagg cggcgcagta tttagcagaa ataaaaaacc ttatccgaca 120 gcgacatgac gaatttcccc aaaaaaaixc cgctgaaagc attgaccg+t i'ttccci'gtg 180 ggcgtatagt tcggttcttc gctgctgcag aagtggcgga cgaactgaaa agtatagcac 240 agaatgttgg ggatatcgag agatatcttg acaggcggaa ggaatacttt taattcgcac 300 gtatcgggtg tttgcccgai· ttttattaaa tttacaaaag gaagcccata 360 ngaatcgaac tgc 373
【权利要求】
1. 一种包含启动子的核酸，所述启动子包括 (i) 来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和 (ii) 来自脑膜炎球菌P〇rA基因启动子的-35区域， 其中所述-10区域和-35区域由12-20个核苷酸的间插序列隔开，并且其中所述间插 序列不含聚-G序列或者包括具有不超过8个连续G核苷酸的聚-G序列。
2. -种包含与下游的蛋白编码基因可操作连接的启动子的核酸，其特征在于，所述启 动子包括⑴来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域和/或（ii)来自脑膜炎球菌 rRNA基因启动子的-35区域。
3. -种包含与蛋白编码基因可操作连接的启动子区域的核酸，所述启动子区域来自脑 膜炎球菌rRNA基因启动子，所述蛋白编码基因具有5' UTR，所述5' UTR含有用于表达所 述蛋白的翻译调节元件。
4. 一种包含启动子的核酸，所述启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区 域和来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。
5. -种包含启动子的核酸，所述启动子包括SEQ ID N0:18,或SEQ ID N0:18的变体， 所述变体与SEQ ID NO :18之间存在最多4个单核甘酸插入、删除或取代的差异。
6. 如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于 所述-10区域是TATAAT ; 所述来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域是TGGTTT ;和/或 所述来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域是TTGACA。
7. 如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述在-35区域和-10区域之间 的间插序列具有12-20个核苷酸，例如，SEQ ID N0:27或SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29。
8. 如权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述间插序列不包括序列GGGGG。
9. 如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述-10序列的非转录下游但 是所述转录起始位点的上游具有5-10个核苷酸，例如，TGAAGAC或TCGCAAC。
10. 如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID NO :30。
11. 如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID NO :18 或其变体，例如，SEQ ID NO :36的核苷酸6-39、SEQ ID NO :37的核苷酸6-38或SEQ ID NO: 38的核苷酸6-39。
12. -种包含DNA序列的细菌表达载体，所述DNA序列包括前述权利要求中任一项中所 述的启动子。
13. -种包含DNA序列的脑膜炎球菌，所述DNA序列包括前述权利要求中任一项中所述 的启动子。
14. 如权利要求13所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述启动子驱动外膜蛋白的表达。
15. 如权利要求14所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述外膜蛋白是fHbp。
16. 如权利要求13-15中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述细菌不表达活性 MltA〇
17. 如权利要求13-16中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述细菌具有SynX和 /或LpxLl的敲除。
18. 如权利要求13-17中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是血 清组B。
19. 如权利要求13-17中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是血 清组W135。
20. 如权利要求13-19中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是免 疫型L3。
21. 从权利要求13-20中任一项所述的脑膜炎球菌制备的外膜囊泡。
22. -种免疫原性药物组合物，所述组合物包含权利要求21所述的囊泡。
23. 如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括一种或多种来自脑膜 炎球菌的偶联的荚膜糖。
24. -种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包含向所述哺乳动物给予权利 要求22或23所述的组合物。
【文档编号】C12N15/74GK104114706SQ201380007752
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年2月1日 优先权日:2012年2月2日
【发明者】I·德莱尼, S·瓜达诺罗 申请人:诺华股份有限公司