赋予酵母对乙醇和高温的耐受性的基因的利记博彩app
【专利摘要】描述与了鉴定赋予酵母乙醇耐受性的基因的方法、赋予乙醇耐受性的基因、以及用于鉴定这些基因的突变株。此处特指为HpETT1的基因是从多形汉逊酵母中分离的。在特指为7E的乙醇敏感突变体多形汉逊酵母菌株中HpETT1的表达互补了该突变体的乙醇敏感性。当该HpETT1的多个拷贝被整合到该基因组中并过量表达时，被转化的菌株表现了大约10倍更大的对乙醇的耐受性和对蛋白错误折叠剂AZC的耐受性。HpETT1的表达还增加了酿酒酵母中的乙醇耐受性。HpEtt1与来自酿酒酵母表示为MPE1的一种先前鉴定的蛋白具有39％序列一致性，然而，该MPE1基因不会赋予对该7E突变体的乙醇耐受性。鉴定了另一种来自树干毕赤酵母的基因，该基因此处被指定为PsETT1，它编码一种与HpETT1具有37％一致性的直系同源蛋白，并且还赋予对该7E突变体的乙醇耐受性。
【专利说明】赋予酵母对乙醇和高温的耐受性的基因 相关申请的交叉引用
[0001] 本发明要求于2012年1月12日提交的美国临时申请号61/585, 873和61/585, 917 的优先权。
【技术领域】
[0002] 本披露涉及赋予用以通过发酵生产乙醇的酵母乙醇耐受性的基因，具体涉及多形 汉逊酵母的木糖发酵菌株的增加的乙醇耐受性，涉及有用于鉴定乙醇耐受基因的多形汉逊 酵母的乙醇敏感突变体，涉及多形汉逊酵母的乙醇耐受重组体，并且更具体地涉及此处分 别指定为HpETTl和PsETTl的来自多形汉逊酵母和树干毕赤酵母的基因序列，HpETTl和 PsETTl与酿酒酵母的MPEl基因在序列上相似但赋予酵母（包括多形汉逊酵母和酿酒酵 母）增加的乙醇耐受性。 背景
[0003] 在该背景部分和后面的说明中引用的参考文献是为了提供对下文所述的发明的 更好的理解，作为材料和方法的来源（它们会进一步使人员能够实践这些方法和/或获得 下文所述的组合物），以及作为这类方法的缩略。因此，通过引用来结合此处引用的每个参 考文献以达到这样的程度，这些参考文献为帮助制备和使用后面所要求保护的发明提供教 导。如果在此处提供的披露和参考文献中有任何冲突，本披露将引用的参考文献的教导控 制在它们冲突的程度内。此处任何参考文献的引用并非承认这样的文献与下文所要求保护 的发明有关或是其现有技术。
[0004] 多形汉逊酵母是具有工业和科学重要性的一种酵母种类。这种非常规的耐热亲甲 烷性酵母是用于生产异源蛋白的最好的酵母系统之一（盖利森（GelliSSen)，2000 ;盖利森 (Gellissen)编辑.2002 ;苏科（Suckow)和盖利森（Gellissen)，2002)，它充当研究过氧化 物酶体功能（范德克莱恩（VanderKlei)和维恩威斯（Veenhuis)，2002)、甲醇代谢、硝酸 盐同化（西维里奥（Siverio) ,2002)以及应激反应（乌比沃夫克（Ubiyvovk)等人，2006) 的一个模型。多形汉逊酵母还具有在通过木质纤维素碳源发酵生产生物燃料中有用的潜 力，因为它能够发酵木糖（瑞奥博弗（Ryabova)等人，2003)并且是最耐热的酵母种类中的 一种（格拉（Guerra)等人，2005)。然而，多形汉逊酵母作为通过发酵生产乙醇的一种有机 体是受限的，因为与其他酵母（例如酿酒酵母）相比它的生长对乙醇相当敏感。 概述
[0005] 诸位发明人已经认识到，为了在通过发酵生产生物燃料的商业应用中有用，如果 多形汉逊酵母对乙醇的耐受性被提高的话将是令人希望的。此处所述的这些发现在集中于 识别用于构建多形汉逊酵母的乙醇耐受菌株的研究中产生。诸位发明人创建了多形汉逊酵 母的插入性突变体的文库集。从插入性突变体的文库集中选择一个显示对乙醇高度敏感的 转化体（此处指定为7E)。在对该突变体中的插入盒进行测序中发现，该插入破坏了此处 指定为HpETTl(SEQ.IDNO: 1)的一个基因的开放阅读框，该基因编码一种未知的蛋白（SEQ IDN0:2)，该蛋白相应地被指定为Ettl。通过将Ettl的氨基酸序列与酵母数据库进行对 t匕，发现Ettl与由MPEl基因（SEQ.IDN0:6)编码的酿酒酵母的蛋白（SEQ.IDN0:5)享有 约39%的序列一致性。这一基因被报道是编码对于体外RNA3'端加工来说必要的一种蛋 白的必需酵母基因，并且是所谓的CPF复合体的一个亚单元（沃（Vo)等人，2001)。该MPEl 基因对于酿酒酵母显然是必需的，因为酿酒酵母MPEl缺失突变体不能成活。
[0006] 相比之下，由诸位发明人识别的多形汉逊酵母突变体7E尽管在一个基因中具有 破坏仍保持成活，该基因与酿酒酵母MPEl基因具有接近的ORF相似性。尽管如上所述，在 普通生长介质上该7E突变体具有生存能力，但它对乙醇是高度敏感的。如此处进一步阐述 的，未被破坏的HpETTl基因在7E突变体中的表达成功地互补该突变体对乙醇的高度敏感。
[0007] 搜索酵母数据库显示了另一种同源基因，此处指定为PsETTl，存在于另一种木糖 发酵酵母--树干毕赤酵母中。PsETTl的产物，PsEttl与HpEttl具有大约37%氨基酸一 致性。诸位发明人分离该PsETTl基因并在多形汉逊酵母7E突变体中表达它，并且显示像 一样HpETTl，该树干毕赤酵母基因的表达至少部分地互补了该多形汉逊酵母ettl突变体 对乙醇的高度敏感。
[0008] 仍进一步，显示使用如此处所述地构建的多拷贝整合体在多形汉逊酵母中过量表 达天然HpETTl基因，得到多形汉逊酵母的一种转化菌株，该转化菌株在对乙醇的耐受性上 相对于亲代菌株具有大约10倍的增加。仍然更令人惊讶地，显示在酿酒酵母中表达该多形 汉逊酵母HpETTl基因也赋予了该酵母乙醇耐受性方面可检测的增加。
[0009] 因此，本教导呈现了一些有用的新方面。一方面是多形汉逊酵母的一种突变株，其 特征为对乙醇敏感，并且具有突变，该突变破坏了HpETTl基因的功能性表达。另一个方面 是鉴定一种基因的方法，该基因赋予一种酵母菌株以乙醇耐受性，所述方法包括用表达候 选核酸的载体转化该多形汉逊酵母ettl突变株，选择补互补该ettl突变体对乙醇的敏感 性的转化体，并鉴定该候选核酸的序列以鉴定赋予乙醇耐受性的基因。另一个方面是编码 一种Ettl蛋白的一种分离的核酸，其特征为当在该ettl突变体中表达时，该核酸互补该突 变体的乙醇敏感性。编码Ettl蛋白的核酸的代表性实例是SEQ.IDNO: 1的HpETTl基因，其 编码SEQ.IDN0:2的HpEttl蛋白，以及SEQ.IDN0:3的PsETTl基因，其编码SEQ.ID.N0:4 的PsEttl蛋白。一个相关方面是指定为Ettl的新型蛋白类别及其分离的版本的鉴定。仍 另一个相关方面是一种重组核酸，该重组核酸包括编码Ettl蛋白的序列和启动子，该启动 子在选择的酵母菌株中是可操作的，该酵母菌株被可操作地配置为表达在该选择的酵母菌 株中的ETTl基因。这类载体的实例示于图1中并包括ρ21+ΕΤΤ1Ηρ和pGLG61+ETTlHp，其 每种都被配置为表达该多形汉逊酵母Ettl蛋白，以及p70+ETTlPst，其被配置为表达一种 树干毕赤酵母Ettl蛋白。这些载体具有选择为在多形汉逊酵母中特别地可操作的启动子。 另一个实例是prPGKISc+ETTIHp，其被配置为在酿酒酵母中表达HpETTl基因。
[0010] 另一个重要的方面是具有增强的乙醇耐受性的酵母菌株，该耐受性可通过在酵母 菌株中过量表达Ettl蛋白产生。具有增加的乙醇耐受性的酵母菌株可以是包括一种重组 核酸的多形汉逊酵母菌株、酿酒酵母菌株或树干毕赤酵母菌株，该重组核酸过量表达来自 多形汉逊酵母或树干毕赤酵母的Ettl蛋白中的至少一种。这类菌株的示例性实施例包括 多形汉逊酵母菌株7E-GAPDHETTlPst、7E-GAPDHETTlHp、和3Leu+pETTl-10,以及酿酒酵母 菌株BY4742+prPGKlSc+ETTlHp。 toon] 应注意，最初针对在材料和方法部分中使用的这些载体、基因、蛋白和菌株的命名 具有根术语"MPE1"，随后是针对该基因获得自何种有机体的一个后缀，即Hp针对多形汉逊 酵母，Pst针对树干毕赤酵母，并且Sc针对酿酒酵母。最初使用这种命名是因为在针对与多 形汉逊酵母7E突变体中破坏的基因相似的序列搜索酵母数据库之后，发现最接近的已知 序列是酿酒酵母MPEl基因，所以最初给予来自树干毕赤酵母和多形汉逊酵母的最接近的 相似序列相同的名字。然而，现在发现该酿酒酵母MPEl基因不互补该多形汉逊酵母7E突变 体的乙醇敏感性，而来自多形汉逊酵母和树干毕赤酵母的相似序列互补该突变，更适当地 是将该多形汉逊酵母和树干毕赤酵母基因作为新型的乙醇耐受性基因，此处以后缀"ETT1" 命名。因此，最初命名为ρ21+ΜΡΕ1Ηρ和pGLG61+MPElHp或p70+MPElPst的载体被重命名为 ρ21+ΗρΕΤΤ1和pGLG61+HpETTl以及p70+PsETTl。仅酿酒酵母基因严格地被称为MPE1。 附图简要说明 图I. 1和1. 2显示此处描述的载体的示意性图示。图a和b显示多形汉逊酵母表达 载体，c、d和e显示用于在多形汉逊酵母中表达该多形汉逊酵母HpETTl基因、该酿酒酵母 MPEl基因、以及该树干毕赤酵母PsETTl基因的构建体。图1.2f显示用于在多形汉逊酵母 中多拷贝整合该HpETTl基因的一种载体。 图2描述了固体培养基密度测定，显示与非突变株3Leu+⑵和亲代菌株NCYC4951eul-l(3)相比，该HpETTl突变体多形汉逊酵母菌株7E(1)的乙醇敏感性。A组显 示细胞在37°C下过夜生长之后的密度，这些细胞最初以指定的光密度铺板于具有指定百分 比的乙醇的YNB培养基上（加2%蔗糖）。B组显示在存在1 %乙醇的YNB培养基上生长过 夜之后的密度。 图3A显示用于鉴定质粒染色体整合体的基因组整合体和探针，并且图3B显示用于分 析整合体7E、Nl和N2的拷贝数的DNA印迹。 图4显示多形汉逊酵母HpEttl蛋白（Hp)、酿酒酵母Mpel蛋白（Sc)、树干毕赤酵母PsEttl蛋白（Ps)之间的序列比较，以及它们之间的一致序列。 图5描述了固体培养基密度测定，显示通过表达HpETTl和PsETTl基因而不是酿酒酵 母MPEl基因对多形汉逊酵母7E突变的互补。上面的组显示在单独的YH)介质上生长，并且 下面的组显示在Yro介质加7 %乙醇上生长。这些菌株是：（1)多形汉逊酵母7E突变体亲代 菌株；（2) 3Leu+对照；（3)用酿酒酵母MPEl基因转化的7E转化体，指定为7EGAPDHMPEISc; (4)用树干毕赤酵母ETTl基因转化的7E转化体，指定为7E-GAPDHETTlPst;以及（5)用多 形汉逊酵母ETTl基因转化的7E转化体，指定为7E-PETT1HP-1。 图6描述了固体培养基密度测定，显示在过量表达HpETTl基因的菌株3Leu+pETTl-10 中乙醇耐受性增强。该3Leu+pETTl-10菌株是通过用多拷贝整合载体pGLG61+ETTlHP转 化3Leu+菌株获得的。上面的组显示在单独的YPS培养基上生长，并且下面的组显示在 YPD介质加7(%乙醇上生长。这些菌株是：（l)7E突变体；（2)3Leu+对照亲代菌株；以及 (3) 3Leu+pETTl-10菌株，它是用多拷贝的多形汉逊酵母pETTl基因转化的对照亲代菌株。 图7是显示当生长于缺少乙醇的YH)介质㈧以及含6 %乙醇的YH)介质⑶中 时，与对照菌株3Leu+(实线）相比，在多形汉逊酵母中过量表达HpETTl基因的菌株 31eU+pETTl-10(点虚线）的生长特征中增强的乙醇耐受性的图。 图8是显示在单独的YPS介质（A)或含7%乙醇的YPS介质（B)上，与对照亲代菌株 3Leu+(实线）相比，该7E突变体（点虚线）的乙醇敏感性和在多形汉逊酵母中过量表达 HpETTl基因的菌株31eu+pETTl-10 (短划线）的生长特征中增强的乙醇耐受性的图。 图9显示通过在具有或不具有乙醇或应激诱导剂AZC的固体培养基上生长，与亲代对 照菌株31eu+(2)和突变株7E菌株（1)相比，过量表达HpETTl基因的3Leu+pETTl-10(3)菌 株中应激耐受性增加。 图10是描述该多形汉逊酵母7E突变体（短划线）与其亲代菌株31eu+(实线）相比 的温度敏感性的图。 图11是显示当在50°C下生长于使用2 %木糖作为碳源的YNB培养基中，与该7E突变体（点虚线）和该亲代菌株31eu+(实线）相比，过量表达HpETTl基因的菌株 3Leu+pETTl-10(短划线）生长特征改善。 图12描述了固体培养基密度测定，显示在表达来自多形汉逊酵母的HpETTl基因的 至少两种酿酒酵母菌株（4和5)中，乙醇耐受性增加。菌株1是仅承载酿酒酵母质粒载体 Yep352的对照菌株，并且菌株2-6是具有那种载体但在酿酒酵母启动子的控制下携带多形 汉逊酵母HpETTl基因的转化体的单独的分离株。上面的组是对照生长培养基（YNB加蔗糖、 leu、Iys和his)，下面的组与其相同进一步包含6%乙醇。 图13描述了固体培养基密度测定，显示当在铺板之前在37°C下培养或在56°C下热击 15min时，与亲代对照31eu+(2)和菌株MPEISc(用一个载体转化以过量表达酿酒酵母MPEl 蛋白的3Leu+)相比，过量表达HpETTl基因（3)的多形汉逊酵母的3Leu+pETTl-10菌株的 热击耐受性增加。 图14显示了 12%SDSPAGE结果，该结果显示使用his标记的表达载体在大肠杆菌中 过量表达之后，该HpEttl蛋白（箭头）的分离。泳道分配：1.蛋白梯；2.在到柱上之前总 的可溶性蛋白；3.可溶性蛋白流动通过；4-9.从柱上相继洗脱的各组分。 详细说明 定义
[0012] 此处使用的某些常用的或新引入的术语被认为是本领域普通技术人员通常理解 的，或是鉴于本披露通常被理解的。此处包括这样通常理解的意思，然而为了解决澄清使用 某些术语所指称的对象的问题，提供了以下非限制性定义以帮助更好地理解本发明。
[0013] 同胞菌株是一种微生物菌株，其与尽管不必然具有相同的基因型的另一个菌株是 相同种类。
[0014] 亲代菌株是一种微生物菌株，与同微生物体的衍生菌株具有相同遗传背景，除了 在该衍生菌株中进行了的改变。
[0015] ettl突变株，是多形汉逊酵母的菌株，此处示例为多形汉逊酵母7E，具有破坏此 处鉴定为HpETTl的基因的表达的突变，与缺少该突变的同胞或亲代多形汉逊酵母菌株相 t匕，该突变株显示出对在乙醇上生长的敏感性。
[0016] ETTl基因是一种来自编码一种蛋白（Ettl蛋白）的任何来源的基因，该蛋白质在 一种ettl突变株中表达时，至少部分地克服了该突变株的乙醇敏感生长特性。
[0017] HpETTl基因是从多形汉逊酵母的一个菌株中获得的编码一种Ettl蛋白的核酸， 在此针对该基因示例为SEQ.IDNOl并且针对该蛋白（HpEttl蛋白）示例为SEQ.IDN02。
[0018] PsETTl基因是从树干毕赤酵母的一个菌株中获得的编码一种Ettl蛋白的核酸， 在此针对该基因示例为SEQ.IDN03并且针对该蛋白（PsEttl蛋白）示例为SEQ.IDN04。
[0019] 过量表达是指在转化的宿主细胞中，通常将编码ORF的一种核酸表达至比在相似 生长条件下在该宿主细胞的未转化的亲代中表达的相同核酸更大的程度。
[0020] 乙醇敏感性或乙醇敏感生长增加是指当乙醇存在于生长培养基中时，与在相同培 养基上生长的相同有机体的同胞菌株相比，一个受试菌株以更低的速率、向更低的密度生 长或者以其他方式的活力降低。
[0021] 乙醇耐受性增强是指当乙醇存在于生长培养基中时，与在相同培养基上生长的相 同有机体的同胞菌株相比，一个受试菌株以更快的速率、向更大的密度生长或者以其他方 式的活力增加。 用以进行示例性实施例的材料和方法
[0022] 菌株和牛长备件。此处披露的酵母菌株列于表1中。将多形汉逊酵母NCYC495 Ieul-I菌株用作插入诱变的受体，并在37°C将其维持在包含0. 67%YNB(Difco,底特律， MI，USA)补充以2%蔗糖和40mgI/1亮氨酸的基本培养基中。多形汉逊酵母7E被选择为 多形汉逊酵母NCYC495Ieul-I菌株的一个插入性突变体，它不能在补充以7%乙醇的YPS 介质（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨和2%蔗糖）中生长。
[0023] 该多形汉逊酵母CBS4732S菌株（拉切瓦（Lahtchev)等人，2002)被用作该HpETTl 基因的一个来源。将该菌株在37°c下维持在Yro介质（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨和2% 葡萄糖）中。
[0024] 将树干毕赤酵母菌株CBS6054 (杨（Yang)等人，1994)用作该树干毕赤酵母 PsETTl基因的一个来源，它是HpETTl的一个直系同源物。将酿酒酵母菌株BY4742 (布拉赫 曼（Brachmann)等人，1998)用作酿酒酵母MPEl基因的来源。
[0025] 将该3Leu+菌株（伊什切克（Ishchuk)等人，2008)用作在多形汉逊酵母中过量表 达HpETTl的一个受体菌株。
[0026] 选择酵母转化体是在具有2%蔗糖的YNB介质上或在补充以IgΓ1遗传霉素或 140mgΓ1博来霉素的YPS介质（0. 5%酵母提取物，1 %蛋白胨和2%蔗糖）上。
[0027] 当需要一个细菌宿主时，将大肠杆菌菌株DH5a[cD80dlacZAM15、recAl、endAl、 gyrA96、thi-l、hsdR17(rK'mK+)、supE44、relAl、deoR、Δ(lacZYA_argF)U169]用在实验中。 将该细菌菌株在37°C下在丰富（LB)培养基中培养，如在萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989 中所述的。将转化的大肠杆菌细胞维持在包含IOOmgΓ1氨比西林的培养基中。 表1. 这项研究中使用的酵母菌株
【权利要求】
1. 一种分离的核酸，该核酸编码一种与酿酒酵母Mpel蛋白（SEQ. ID N0:6)的ORF有 至少37% -致性的蛋白质，其中当所述的由该核酸编码的蛋白在该ettl突变株中表达时， 所述分离的核酸互补由多形汉逊酵母的ettl突变株赋予的乙醇敏感性。
2. 如权利要求1所述的分离的核酸，其中由所述核酸编码的蛋白是一种根据SEQ. ID N0:2的多形汉逊酵母ettl蛋白或是一种根据SEQ. ID N0:4的树干毕赤酵母ettl蛋白。
3. 如权利要求1所述的分离的核酸，其中该分离的核酸被可操作地配置有一种启动 子，以在由包含该分离的核酸的载体转化的酵母中表达所述蛋白。
4. 如权利要求3所述的分离的核酸，其中该酵母选自由多形汉逊酵母和酿酒酵母组成 的组。
5. -种酵母，该酵母被用权利要求3所述的分离的核酸转化。
6. 如权利要求5所述的酵母，其中该酵母选自由多形汉逊酵母和酿酒酵母组成的组。
7. 如权利要求5所述的酵母，其中该分离的核酸是以多拷贝整合入该酵母的基因组 中。
8. -种用于制备乙醇的方法，包括：在选择以生产乙醇的条件下，在一种介质中培养 权利要求5-7中任一项所述的酵母。
9. 多形汉逊酵母的一种菌株，该菌株在编码根据SEQ. ID N0:2的蛋白的ETT1基因中有 一种突变，其中与缺少这样一种突变的多形汉逊酵母的亲代菌株相比，该突变导致对生长 在包含乙醇的介质上敏感。
10. 如权利要求9所述的菌株，被指定为7E，保藏为NRRL_。
11. 一种鉴定赋予酵母增强的乙醇耐受性的基因的方法，包括：用一种可操作地连接 至一种启动子的候选核酸转化根据权利要求9的亲代多形汉逊酵母菌株，该启动子表达由 该候选核酸编码的一种蛋白；选择与该突变体亲代菌株相比，展现了在包含乙醇的介质中 增强生长的多形汉逊酵母的被转化的子代菌株；并确定在所选的被转化的子代菌株中表达 的该候选核酸的一个序列。
12. 权利要求11所述的方法，其中该候选核酸编码与根据SEQ ID N0:6的酿酒酵母 mpel蛋白具有至少39%序列一致性的一种蛋白质。
13. 权利要求11所述的方法，其中该候选核酸编码与根据SEQ ID N0:2的多形汉逊酵 母ettl蛋白具有至少37%序列一致性的一种蛋白质。
14. 权利要求11所述的方法，其中该候选核酸编码与根据SEQ ID N0:4的树干毕赤酵 母ettl蛋白具有至少37%序列一致性的一种蛋白质。
15. 如权利要求11所述的方法，其中该子代菌株是用一种载体转化的，该载体将该候 选基因中的多个拷贝引入该子代菌株的染色体中。
【文档编号】C12P7/06GK104428418SQ201380004910
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2012年1月12日
【发明者】查尔斯·阿巴斯, 安德烈·A·希博尼, 安德烈·Y·沃罗诺夫斯基, 奥莱纳·P·伊修克 申请人:阿彻丹尼尔斯米德兰德公司