厌氧型固碳微生物筛选方法
【专利摘要】本发明提供一种厌氧型固碳微生物筛选方法，包括如下步骤：分别配制基础培养基和微量元素溶液，将二者混合后得到适宜于海洋中的厌氧型固碳微生物生长的培养液：把一部分培养液和海水样品混合，并在无氧气体下培养4～8天，得到含有多种厌氧型固碳微生物的混合菌液；分别配制至少一种电子供体原液；把一部分培养液和一种或几种电子供体原液混合，得到混合生长液；把混合菌液接种到混合生长液中，在无氢气体下培养4～8天，得到含有多种具有稳定固碳效率的厌氧型固碳微生物的目标菌液；本方法工艺简单，可操作性强，可在短时间内获得具有较高固碳效率的厌氧型固碳微生物，可有效利用于微生物固碳的过程中，从而实现对大气中CO2的资源化。
【专利说明】厌氧型固碳微生物筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于固碳微生物的筛选领域，涉及一种厌氧型固碳微生物筛选方法。
【背景技术】
[0002]由CO2引发的“温室效应”所造成的全球气候变暖是当前全球面临的重大环境问题。根据IPCC第4次评估报告指出:在最近的一个十年期(1995~2004年)，CO2当量增加的排放速率(每年9.2亿吨CO2当量)比前一个十年期(1970~1994年)增加的排放速率海年4.3亿吨CO2当量)高得多。中国的“十二五规划建议草案”显示我国将CO2减排放在了相当重要的位置上。而在2010年末举行的坎昆会议上，中国承诺到2020年，单位国内生产总值(⑶P)C02排放将比2005年下降40%~45%。同时CO2又是地球上最丰富的碳资源，具有转变为资源和能源的巨大潜力。因此，CO2的固定在环境、能源、资源方面都具有重要的意义。当前，在考虑如何减排CO2的前提下，研究CO2的回收与固定，既能有效减少环境中游离的CO2，又能将其再生为资源，因此已引起世界各国的广泛兴趣。
[0003]CO2的固定主要有物理法、化学法和生物法，而大多数物理法和化学法都必须结合生物法来最终固定co2。生物法固定CO2主要依靠植物和自养微生物，传统上植物的光合作用较为重要也更为人所重视。但地球上存在各种各样的植物不能生长的特殊环境(如干旱贫瘠的沙漠土壤和工业废气的捕集场合)，在这些特殊环境中，微生物所具有的环境适应性的优势便显现出来了，因此从整个生物圈的物质流和能量流来看，微生物固定CO2意义重大。
[0004]目前公认具有较高固碳效率的微生物主要是光合微生物和化能自养细菌中的氢-氧化细菌。藻类等光合微生物由于在培养过程中需要持续光照，以及还具有不耐热和耐受高浓度CO2的特性，于是其实际应用受到了一定的限制。而氢-氧化细菌虽然不用光照且生长范围较为宽泛，但其在生长过程中必须提供以高浓度氢气作为电子供体，因此普通环境条件难以符合其生长要求，同时在实际应用中，供氢气也存在严重的安全隐患。鉴于此，发掘生长时不用光照与供氢的高效固碳微生物，对于实现普通环境条件下的微生物固碳(如土壤环境与吸收工业排放CO2的大型生物反应器中)具有重要意义。
[0005]海洋在全球碳循环过程中有着重要地位，其每年要吸收2.0Gt (lGt=109t)人为排放的CO2，海洋中固碳微生物的研究也一直是全球相关领域专家关注的焦点。目前，科学家们已从全球多个海域(包括全球四大洋，数十个国家和地区)采集水土样品，通过分离筛选获得了多个系列的生长时不用光照与供氢的固碳微生物菌群。
[0006]但是，一般而言，从这些来自不同海域的海水样品中筛选得到的非光合微生物的固碳效率通常较低，只有在经过长时间的驯化(如:数个月甚至一年以上)，这些菌种的固碳效率才会达到一个较高并且可以利用的水平。另外，由于来自不同海域的海水样品有差异，因此筛选非光合微生物的方法也有差异。目前缺少一种简捷高效且能适用于绝大部分海区水土样品的非光合固碳微生物筛选方法，这一点限制了非光合固碳微生物的工业应用。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种厌氧型固碳微生物筛选方法，对海洋中存在的具有高固碳效率的厌氧型固碳微生物在厌氧条件下进行筛选。
[0008]为达到上述目的，本发明的解决方案是:
[0009]本发明提供一种对海洋中的厌氧型固碳微生物进行筛选的厌氧型固碳微生物筛选方法，包括如下步骤:
[0010](I)、分别配制基础培养基和微量元素溶液，将二者混合后得到适宜于海洋中的厌氧型固碳微生物生长的培养液；
[0011](2)、把一部分培养液作为筛选用培养液和海水样品混合,并在无氧气体下培养4~8天，得到含有多种厌氧型固碳微生物的混合菌液；
[0012](3)、分别配制至少一种电子供体原液；
[0013](4)、把一部分培养液作为生长用培养液和一种或几种电子供体原液混合,得到混合生长液；
[0014](5)、把混合菌液加入到混合生长液中，在无氢气体下培养4~8天，得到含有多种具有稳定固碳效率的厌氧型固碳微生物的目标菌液。
[0015]在上述步骤(1)中，每升基础培养基中加入2毫升微量元素溶液，基础培养基包含以下组分:0.5g/L ~1.0g/L KH2PO4、1.0g/L ~2.0g/L K2HPO4、0.lg/L ~0.2g/L MgSO4.7H20、10g/L ~30g/L NaCl、0.0Olg/L ~0.01g/L CaCl2、0.0036mmol/L ~
0.036mmol/L亚铁离子和0.0075mol/L~0.075mol/L NH4+离子，微量兀素溶液为1.68mg/L Na2MoO4.2Η20、0.4mg/L H3BO3> 1.0mg/L ZnSO4.7Η20、1.0mg/L MnSO4.5Η20、7.0mg/LCuSO4.5Η20、1.0mg/L CoCl2.6H20 或 1.0mg/L NiSO4.7H20 中的一种或几种。
[0016]在上述步骤(1)中，进一步地，亚铁离子为FeSO4 WH2CKFeSOjP FeCl2中的其中一种，NH4+ 离子为(NH4) 2S04 或 NH4Cl。
[0017]在上述步骤(2)中，无氧气体含有体积百分比为5%~30%的二氧化碳和体积百分比为70%~95%的氢气，进一步地，无氧气体优选为含有体积百分比为20%的二氧化碳和体积百分比为80%的氢气。
[0018]在上述步骤(2)中，海水样品为海水或海洋沉积物稀释液，当海水样品为海水时，每升筛选用培养液加入25~75毫升海水，当海水样品为海洋沉积物稀释液时，每升筛选用培养液加入25~50毫升海洋沉积物稀释液，海洋沉积物稀释液通过每升无菌水中溶解0.1克海洋沉淀物而制成。
[0019]在上述步骤(3)中，每种电子供体原液中电子供体的浓度为80~200mg/mL。
[0020]在上述步骤(3)中，进一步地，电子供体为亚硝酸盐、硫代硫酸盐和硫化物中的任意一种，混合生长液中含有浓度为I~15g/L的亚硝酸盐、或者含有浓度为I~15g/L的硫代硫酸盐、或者含有浓度为I~15g/L的硫化物。
[0021]在上述步骤(3)中，更进一步地，亚硝酸盐为NaNO2或KNO2,硫代硫酸盐为Na2S2O3或K2S2O3,硫化物为Na2S或K2S。
[0022]在上述步骤(5)中，无氢气体含有体积百分比为5%~30%的二氧化碳和体积百分比为70%~95%的氮气，进一步地，无氢气体优选为含有体积百分比为20%的二氧化碳和体积百分比为80%的氮气。[0023]由于采用上述方案，本发明的有益效果是:
[0024]本方法首先使用氢气从海水或海洋沉积物样品中筛选得到厌氧型固碳微生物，再利用由亚硝酸盐、硫代硫酸盐及硫化物组成的混合电子供体培养出厌氧型固碳微生物，可在短时间内(8天左右)从海水或海洋沉积物样品中筛选获得高效的厌氧型固碳微生物菌群。本方法不仅工艺简单、可操作性强、对不同海域的海水样品具有普遍适用性，而且筛选时间短、固碳效率高，具有潜在的经济效益和社会效益。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0026]本发明的厌氧型固碳微生物筛选方法首先在氢气存在的缺氧条件下，从海水或海洋沉积物中筛选出多种厌氧型固碳微生物，再利用由亚硝酸盐、硫代硫酸盐及硫化物组成的混合电子供体系统继续培养和筛选所得的厌氧型固碳微生物，最后得到含有多种具有较高固碳效率的厌氧型固碳微生物的菌群。其详细过程如下所述:
[0027]实施例一
[0028]本实施例提供一种厌氧型固碳微生物筛选方法，用于对海洋中的具有较高固碳效率的厌氧型固碳微生物进行筛选，包括如下步骤:
[0029](I)、分别配制基础培养基和微量元素溶液，将二者混合后得到适宜于厌氧型固碳微生物生长的培养液:
[0030](2)、把一部分培养液作为筛选用培养液和海水样品混合,并在无氧气体下培养4天(称作第一培养周期)，得到含有多种厌氧型固碳微生物的混合菌液；
[0031](3)、分别配制三种电子供体原液；
[0032](4)、把一部分培养液作为生长用培养液和上述三种电子供体原液混合，得到混合生长液；
[0033](5)、把步骤(2)所得的混合菌液接种到步骤(4)所得的混合生长液中，在无氢气体下培养4天(称作第二培养周期)，得到含有多种具有稳定固碳效率的厌氧型固碳微生物的目标菌液。
[0034]在上述步骤(1)中，基础培养基包含以下组分:0.5g/L~1.0g/L KH2PO4、1.0g/L~2.0g/L Κ2ΗΡ04、0.lg/L ~0.2g/L MgSO4.7H20、lOg/L ~30g/L NaCl、0.0Olg/L ~0.01g/L CaCl2、0.0036mmol/L ~0.036mmol/L 亚铁离子和 0.0075mol/L ~0.075mol/L NH:离子，其优选的配方详见表1 ;微量元素溶液包含以下组分:1.68mg/L Na2MoO4.2H20、0.4mg/LH3BO3U.0mg/LZnS04.7Η20、1.0mg/L MnSO4.5Η20、7.0mg/L CuSO4.5Η20、1.0mg/L CoCl2.6Η20和1.0mg/LNiS04.7H20，其优选的配方详见表2。
`[0035]表1基础培养基的优选配方表
[0036]
JI14 Ikh2Po4 Ik2Hpo4~IMgso4.7h2o~INaCi Icaci2 |(nh4)2so4 IFeso4.7h2o浓度 1.0g/L~ 2.0g/L 0.2g/L20g/L~ 0.01g/L 0.038mol/L 0.0036mmol/L
[0037]表2微量兀素溶液的优选配方表
【权利要求】
1.一种厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:包括如下步骤: (1 )、分别配制基础培养基和微量元素溶液，将二者混合后得到适宜于海洋中的厌氧型固碳微生物生长的培养液: (2)、把一部分所述培养液作为筛选用培养液和海水样品混合,并在无氧气体下培养4~8天，得到含有多种所述厌氧型固碳微生物的混合菌液； (3)、分别配制至少一种电子供体原液； (4)、把一部分所述培养液作为生长用培养液和一种或几种所述电子供体原液混合，得到混合生长液； (5)、把所述混合菌液加入到所述混合生长液中，在无氢气体下培养4~8天，得到含有多种具有稳定固碳效率的所述厌氧型固碳微生物的目标菌液。
2.根据权利要求1所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:每升所述基础培养基中加入2毫升所述微量元素溶液，所述基础培养基包含以下组分:0.5g/L~1.0g/L KH2PO4U.0g/L ~2.0g/L K2HP04、0.lg/L ~0.2g/L MgSO4.7H20、10g/L ~30g/L NaCl、0.0Olg/L ~0.01g/L CaCl2、0.0036mmol/L ~0.036mmol/L 亚铁离子和 0.0075mol/L ~0.075mol/L NH4+离子，所述微量元素溶液为 1.68mg/L Na2MoO4.2Η20、0.4mg/L H3BO3U.0mg/L ZnSO4.7H20、1.0mg/L MnSO4.5H20、7.0mg/L CuSO4.5H20、1.0mg/L CoCl2.6H20 或 1.0mg/L NiSO4.7H20中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:所述亚铁离子为FeSO4.7H20、FeSO4 和 FeCl2 中的其中一种，所述 NH4+ 离子为(NH4) 2S04 或 NH4Cl。
4.根据权利要求1所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:所述无氧气体含有体积百分比为5%~30%的二氧化碳和体积百分比为70%~95%的氢气,所述无氢气体含有体积百分比为5%~30%的二氧化碳和体积百分比为70%~95%的氮气。
5.根据权利要求4所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:所述无氧气体含有体积百分比为20%的二氧化碳和体积百分比为80%的氢气，所述无氢气体含有体积百分比为20%的二氧化碳和体积百分比为80%的氮气。
6.根据权利要求1所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:所述海水样品为海水或海洋沉积物稀释液，当所述海水样品为海水时，每升所述筛选用培养液加入25~75毫升海水；当所述海水样品为海洋沉积物稀释液时，每升所述筛选用培养液加入25~50毫升海洋沉积物稀释液，所述海洋沉积物稀释液通过每升无菌水中溶解0.1克海洋沉淀物而制成。
7.根据权利要求1所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:每种所述电子供体原液中电子供体的浓度为80~200mg/mL。
8.根据权利要求7所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:所述电子供体为亚硝酸盐、硫代硫酸盐和硫化物中的任意一种，并且所述混合生长液中含有浓度为I~15g/L的亚硝酸盐、含有浓度为I~15g/L的硫代硫酸盐或者含有浓度为I~15g/L的硫化物。
9.根据权利要求8所述的厌氧型固碳微生物筛选方法，其特征在于:所述亚硝酸盐为NaNO2或KNO2 ;或者所述硫代硫酸盐为Na2S2O3或K2S2O3 ;或者所述硫化物为Na2S或K2S。
【文档编号】C12N1/02GK103834586SQ201310746050
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】胡佳俊, 王磊, 胡煜 申请人:同济大学