一株屎肠球菌的培养方法及应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一株屎肠球菌的培养方法及其应用。屎肠球菌WEI-9以1％接种量接于专用液体发酵培养基，在50L发酵罐条件下，37℃，50rpm，不通气条件下发酵10-12h，活菌数产量可达2×109-3×109CFU／mL。将发酵液通过高速管式离心机收集菌体后，与专用保护剂按照质量体积比1∶5混合均匀，于-70℃预冻2-3h，然后置于真空冷冻干燥机中真空冻干44h后结束，获得的干燥菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮按照一定比例混合，获得微生态制剂产品。该产品用作微生物饲料添加剂添加于畜禽饲料中，可以调节畜禽肠道微生态平衡，提高畜禽的生产性能和抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代产品。
【专利说明】一株屎肠球菌的培养方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株屎肠球菌的培养方法及其应用，属于微生物【技术领域】。
[0002]背景介绍
[0003]目前饲料和畜禽养殖中滥用抗生素、化学合成药物、激素、β_兴奋剂、重金属、镇静剂等促生长保健剂，导致一系列问题和后果，包括:畜禽产品中药物残留严重；细菌耐药性增强、耐药菌株增多；各种耐药性病菌可以通过食品传给人，产生很难治愈的疾病。这些问题及其严重的后果极大地威胁着食品安全，影响着动物和人类的健康。
[0004]鉴 于上述饲料和畜禽养殖中存在的诸多问题，中国已启动“饲料安全工程”，并禁用了一批毒性和残留较大的药物。国家《饲料工业“十二五”发展规划》明确指出要加快新型饲料添加剂的开发与生产，尤其是替代抗生素的饲料添加剂的生产。因此，微生态制剂作为一种绿色、安全的饲料添加剂成为产业化开发的热点，是替代抗生素的潜在产品之一。
[0005]作为消化道内固有菌群，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制有害菌生长、增强免疫力等作用。目前市售微生态制剂产品在实际使用中具有提高畜禽生产性能，防治畜禽消化道疾病的功效，但是很多产品也存在一些缺陷:活菌数达不到产品标注的量，致使产品的功效大打折扣；后处理条件太过激烈导致干燥后的菌粉产品含有大量死亡菌体，微生物活性大量损失。
[0006]因此，研制出一种低成本、高产量并能长期保持活性的乳酸菌微生态制剂，对于发展绿色饲料，保证饲料安全具有重要的意义。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术的不足提供了一株屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745的大规模发酵培养方法及其在生产微生态制剂中的应用。屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9,并于2013年6月19日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.7745，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所邮编:100101。
[0008]本发明所提供的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的大规模发酵培养方法,是将屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745接种到该菌的专用液体培养基中，30-40°C下静置或不通气培养。所述专用液体培养基的配方为:每1000mL水中含有:乳清粉10-30g，蛋白胨10_30g，柠檬酸铵l_3g，三水合乙酸钠2_8g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，一水合硫酸锰0.02-0.08g,三水合磷酸氢二钾l_3g，吐温80
0.5-1.5g, pH 值为 6.5-7.5。
[0009]在上述培养方法中，接种比例为1% ;培养温度为37_40°C ;静置或不通气培养，培养时间为10-12h。
[0010]优选的专用液体培养基的配方为:每1000mL水中含有:乳清粉21.34g，蛋白胨21.94g，柠檬酸铵2g，三水合乙酸钠5g，七水合硫酸镁0.2g，一水合硫酸锰0.05g,三水合磷酸氢二钾2g，吐温80 lg，pH值为7。[0011]在50L发酵罐条件下，利用上述培养基在37°C，50rpm，不通气条件下发酵获得的屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745发酵液活菌数达到2X 109-3X 109CFU/mL,而在同样条件下，屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCCN0.7745在MRS培养基中的活菌数为6.5 X 108CFU/mL,优化后的培养基使得活菌数提高3_4倍。
[0012]本发明所提供的屎肠球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 在微生态制剂制备中的应用，是将屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745按照上述培养基和培养条件发酵获得的发酵液通过高速管式离心机收集菌体后，与保护剂混合均匀，先于-70°C预冻，然后置于真空冷冻干燥机中干燥后获得活性菌粉，将菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮混合，获得微生态制剂产品。
[0013]所述高速管式离心机收集菌体的转速为15000-20000rpm。
[0014]所述用于真空冷冻干燥处理的菌体保护剂配方为--每1000mL水中含有:脱脂奶粉100g,麦芽糊精10g，海藻糖15g，甘油5g，山梨醇20g。保护剂与离心后的菌泥按照体积质量比5: I混合均匀，于_70°C预冻2-3h，然后置于真空冷冻干燥机中真空冻干44h后结束，冻干参数如下:真空度小于30Pa，冷阱温度为-40°C至_50°C，获得的干燥菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮按照一定比例混合，获得微生态制剂产品。冻干后的原菌粉活菌数为2X 10n-3X 10nCFU/g，以同样粒度的麸皮为载体可以稀释为含有不同活菌数的微生态制剂菌粉产品。
[0015]总之，按照上述培养方法和发酵液后处理方法可以制备出低成本、高活性的微生态制剂菌粉产品，用作畜禽微生物饲料添加剂，可以提高畜禽生产能力、抗病能力，最终减少饲用抗生素的使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1 为尿肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 最适发酵初始 pH值的优化。
[0017]图2 为尿肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 最适发酵温度的优化。
[0018]图3 为尿肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 最适工业级复合碳源的优化。
[0019]图4 为尿肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 最适氣源的优化。
[0020]图5 为尿肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 在 50L 发酵耀条件下的生长曲线。
【具体实施方式】
[0021]实施例一:尿肠球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 的最适发酵培养条件的优化
[0022]一、尿肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 的最适生长环境条件的优化
[0023]1、最适初始pH值的优化[0024]考察不同初始pH值对屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 生长的影响。从屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745的保藏斜面(MRS培养基)挑一环菌苔接于装有IOOmL液体MRS培养基的250mL三角瓶中，于37°C，180rpm振荡培养llh，以I %的接种量分别接于装有300mL pH为5.5,6.0,6.5,7.0,7.5的液体MRS培养基的500mL三角瓶中，于37°C，静置培养16h，开始培养后分别于2h、4h、6h、10h、12h、14h、16h取样测定0D_，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。优化结果表明，屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 最适生长初始 pH 值范围为 6.5-7.5。
[0025]2、最适发酵温度的优化
[0026]考察不同温度对尿肠球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 生长的影响。从屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的保藏斜面(MRS 培养基)挑一环菌苔接于装有IOOmL液体MRS培养基的250mL三角瓶中，于37°C，180rpm振荡培养llh，以1%的接种量接于装有300mL pH为7.0的液体MRS培养基的500mL三角瓶中，分别于25°C、30°C、37°C、40°C、42°C、45°C、48°C，静置培养IOh,开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定0D_，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。优化结果表明，屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 最适生长温度范围为 37_40°C。
[0027]3、最适转速的优化
[0028]考察不同转速对尿肠球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 生长的影响。从屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的保藏斜面(MRS 培养基)挑一环菌苔接于装有IOOmL液体MRS培养基的250mL三角瓶中，于37°C，180rpm振荡培养llh，以1%的接种量接于装有300mL pH为7.0的液体MRS培养基的500mL三角瓶中，于37°C，转速分别调至50rpm、100rpm、200rpm，并以静置培养为对照，培养10h，开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定0D_，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。优化结果表明，不同转速对屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745生长的影响没有显著差异，表明屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745的生长对氧气的需求不显著，实际发酵过程中为了节省能源，可以在无需通气的条件下发酵。
[0029]二、尿肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 的最适发酵培养基组分的优化
[0030]1、最适碳源的优化
[0031]米用上述最适生长条件，考察了屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCCN0.7745对单一碳源，包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油和工业上常用的复合碳源，包括糖蜜、乳清粉、葡萄糖浆、低聚异麦芽糖和糊精的利用情况。采用与上述同样的接种方法，固定氮源为蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，酵母粉5g/L，含有不同碳源(含量均为20g/L)的培养基的pH值均为7.0，培养温度为37°C，静置培养10h，开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定0D_，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。综合考虑原料成本和菌体生长情况，最终确定屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745生长的最适碳源为乳清粉。
[0032]2、最适氮源的优 化
[0033]米用上 述最适生长条件，考察了屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCCN0.7745对蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、玉米浆粉、酵母膏、尿素、硝酸钠和硫酸铵等几种氮源的利用情况。采用与上述同样的接种方法，固定碳源为乳糖20g/L，含有不同氮源(含量按照每种氮源的含氮量与MRS培养基中的含氮量一致的原则进行换算)的培养基的pH值均为
7.0，培养温度为37°C，静置培养10h，开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定OD6tltl,并于培养结束时测定每个样品的活菌数。综合考虑原料成本和菌体生长情况，最终确定屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745生长的最适氣源为蛋白腺。
[0034]3、Plackett-Burman 试验
[0035]用于培养屎肠球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的发酵培养基中含有8种组分，利用Plackett-Burman设计从8种原料中筛选出对活菌产量有显著影响的因素。各因素及其水平见表1，Plackett-Burman试验设计及结果见表2,数据的回归分析及显著性分析见表3。表3的分析结果表明，蛋白胨是影响屎肠球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745发酵活菌产量的最显著因素，其余因素的影响作用依次为乳清粉、三水合乙酸钠、吐温80、七水合硫酸镁、三水合磷酸氢二钾、柠檬酸铵、一水合硫酸锰。其中蛋白胨、乳清粉、一水合硫酸锰和三水合磷酸氢二钾对活菌数的影响是正相关，柠檬酸铵、三水合乙酸钠、七水合硫酸镁、吐温80对活菌数的影响是负相关。选取乳清粉、蛋白胨和三水合乙酸钠做进一步优化试验。
[0036]表1Plackett-Burman试验设计因子水平
[0037]
【权利要求】
1.一株屎肠球菌的培养方法及应用，其特征在于,所述的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)为 WE1-9，保藏编号为 CGMCC N0.7745。
2.权利要求1所述的培养方法，其特征在于:将屎肠球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745接种到该菌的专用液体培养基中，30_40°C下静置或不通气培养。所述专用液体培养基的配方为:每1000mL水中含有:乳清粉10-30g，蛋白胨10_30g，柠檬酸铵l-3g，三水合乙酸钠2-8g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，一水合硫酸锰0.02-0.08g,三水合磷酸氢二钾 l_3g，吐温 800.5-1.5g，pH 值为 6.5-7.5。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于:所述专用液体培养基的优选配方为:每1000mL水中含有:乳清粉21.34g，蛋白胨21.94g，柠檬酸铵2g，三水合乙酸钠5g，七水合硫酸镁0.2g，一水合硫酸锰0.05g,三水合磷酸氢二钾2g，吐温801g，pH值为7。
4.根据权利要求2-3所述培养方法，其特征在于:接种比例为1%;培养温度为37-400C ;静置或不通气培养，培养时间为10-12h。
5.权利要求1所述的屎肠球菌的培养方法及应用，其特征在于:应用是以以屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745 为主要原料制备微生态制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述微生态制剂的制备方法为:屎肠球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745经一级种子摇瓶和50L发酵罐富集后的发酵液通过高速管式离心机收集，与保护剂混合均匀，先于_70°C预冻，然后置于真空冷冻干燥机中干燥后获得活性菌粉，将菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮混合，获得微生态制剂产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述高速管式离心机收集菌体的转速为15000-20000rpm ;保护剂配方为--每1000mL水中含有:脱脂奶粉100g，麦芽糊精10g，海藻糖15g,甘油5g,山梨醇20g。
8.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于:将保护剂与离心后的菌泥按照体积质量比5: I混合均匀，于_70°C预冻2-3h，然后置于真空冷冻干燥机中真空冻干44h后结束，冻干参数如下:真空度小于30Pa，冷阱温度为-40°C至_50°C。
【文档编号】C12N1/20GK103981116SQ201310719855
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】乔琳, 姚宏明, 高长斌, 刘蕊, 金忠辉 申请人:北京伟嘉人生物技术有限公司, 沈阳伟嘉牧业技术有限公司