链霉菌几丁质酶的分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，包括如下步骤：（1）粗酶液的制备；（2）离子交换层析；（3）凝胶过滤。本发明方法特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。
【专利说明】链霉菌几丁质酶的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种链霉菌几丁质酶的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]链霉菌，其基内菌丝多分枝，一般横隔稀疏，很少断裂，常产生各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝部分分化成直形、柔曲、钩环状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝，时常含50个左右的孢子，短者含5~10个孢子；孢子为节孢子，由菌丝断裂而成，有的脱去外鞘，有的携带外鞘或残余，外鞘决定孢子的表面结构；DNA中的G+C克分子含量为69~76%，因许多种是抗生素的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名(如链霉素)。
[0003]几丁质酶作为一种抗菌蛋白是生防菌抑制病原真菌的重要机制之一。合适的培养方法与微生物产几丁质酶密切相关。因此人们在提高微生物的产几丁质酶量时，必须对发酵条件进行适当调控，以确定该菌最适的产酶条件，为更强抑制真菌的孢子萌发和菌丝生长，激发植物启动防御反应，使植物产生更多的防御蛋白，增强植物的抗性提供基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，，特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，包括如下步骤:
(1)粗酶液的制备；
(2)离子交换层析；
(3)凝胶过滤。
[0006]进一步的:所述粗酶液的制备:用优化试验筛选出的培养基培养链霉菌，在几丁质酶活性达最高时取发酵液离心，上清液用真空抽滤，除去杂质收集滤液，向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4°C静置过夜，再次离心收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀，离心溶解液除去不溶物体，上清液装于透析袋，经pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液透析后，再用聚乙二醇浓缩得到粗酶液；
进一步的:所述培养基为:2% (w/V)的胶体几丁质100ml/L，黄豆饼粉0.4wt%,K2HPO4L 0 (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
[0007]进一步的:所述离心条件为4°C,转速8500~12000 rpm,时间10~15 min。
[0008]进一步的:所述离子交换层析:粗酶液经过聚乙二醇PEG20000浓缩后，用0.01-0.03mol/L的磷酸盐缓冲液平衡过夜，上样于充分平衡后的DEAE A-52阴离子交换层析柱，用0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含0~lmol/L NaCl的
0.01~0.03mol/L磷酸盐缓冲液进行连续洗脱，收集洗脱液。[0009]进一步的:所所述洗脱条件为:流速35mL/h ；5mL/管。
[0010]进一步的:所述凝胶过滤:用pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液充分平衡的S^hadex G-75凝胶过滤层析柱，上样后，再用相同的缓冲液进行洗脱，收集有酶活性的部份。
[0011]进一步的:所述洗脱条件为:流速15-25 mL/h，5mL/管。
[0012]本发明的有益技术效果是:本发明方法特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。
【具体实施方式】
[0013]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0014]实施实例一
(I)用优化试验筛选出的培养基(2% (w/V)的胶体几丁质100ml/L、黄豆饼粉0.4wt%、K2HPO4L 0 (g/L)和KH2PO40.6 (g/L))培养菌株，在几丁质酶活性达最高时取发酵液，8500rpm离心lOmin，上清液用真空抽滤，收集滤液。向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4°C静置过夜。12000 rpm、4°C离心15 min收集沉淀，用适量0.01mol/L的缓冲液溶解沉淀。12000 rpm、4°C离心15 min除去不溶物体，上清液装于透析袋，经0.01 mo I/L的磷酸盐缓冲液(PH6.5)透析后，再用聚乙二醇浓缩得到粗酶液。
[0015](2)将上述粗酶液经过0.01 mo I/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)充分透析，并用PEG20000适当浓缩后,上样到充分平衡好的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析柱。以平衡胶柱用的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱，再以含0.1 mol/LNaCl的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行盐离子梯度连续洗脱，共洗脱出2个蛋白质峰。测定收集液的几丁质酶活性发现，上述收集液中后一个峰的酶活最高，酶活达到4.36U/ml，主要集中在400min时间收集的管中。
[0016](3)用PEG20000适当浓缩400min获得的收集液，上样到充分平衡好的S印hadexG-75凝胶过滤柱。以平衡胶柱用的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱，共洗脱出三个蛋白峰，对每个峰分别测酶活得出第一个峰的酶活最高为5.64 U/ml，其他峰的酶活很小接近于零，所以这个峰的取出液就是我们要的几丁质酶。
[0017](4)上述活性峰用SDS-PAGE电泳，表现为单带，表明纯化后的几丁质酶为单一组分，已达到电泳纯。
[0018]实施实例二
(I)用优化试验筛选出的培养基(2% (w/V)的胶体几丁质100ml/L、黄豆饼粉0.4wt%、K2HPO4L 0 (g/L)和KH2PO40.6 (g/L))培养菌株，在几丁质酶活性达最高时取发酵液，8500rpm离心lOmin，上清液用真空抽滤，收集滤液。向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4°C静置过夜。12000 rpm、4°C离心15 min收集沉淀，用适量的缓冲液溶解沉淀。12000 rpm、4°C离心15 min除去不溶物体,上清液装于透析袋,经0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)透析后，再用聚乙二醇浓缩得 到粗酶液。[0019](2)将上述粗酶液经过0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)充分透析，并用PEG20000适当浓缩后，上样到充分平衡好的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析柱。以平衡胶柱用的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱，再以含0.5mol/L NaCl的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行盐离子梯度连续洗脱，共洗脱出2个蛋白质峰。测定收集液的几丁质酶活性发现，上述收集液中后一个峰的酶活最高，酶活达到4.36U/mL，主要集中在450 min时间收集的管中。
[0020](3)用PEG20000适当浓缩450 min获得的收集液，上样到充分平衡好的S印hadexG-75凝胶过滤柱。以平衡胶柱用的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱，共洗脱出三个蛋白峰，对每个峰分别测酶活得出第一个峰的酶活最高为5.64 U/mL，其他峰的酶活很小接近于零，所以这个峰的取出液就是我们要的几丁质酶。
[0021](4)上述活性峰用SDS-PAGE电泳，表现为单带，表明纯化后的几丁质酶为单一组分，已达到电泳纯。
[0022]实施实例三
(I)用优化试验筛选出的培养基(2% (w/V)的胶体几丁质100ml/L、黄豆饼粉0.4wt%、K2HPO4L 0 (g/L)和KH2PO40.6 (g/L))培养菌株，在几丁质酶活性达最高时取发酵液，8500rpm离心lOmin，上清液用真空抽滤，收集滤液。向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4°C静置过夜。12000 rpm、4°C离心15 min收集沉淀，用适量的缓冲液溶解沉淀。12000 rpm、4°C离心15 min除去不溶物体,上清液装于透析袋,经0.03 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)透析后，再用聚乙二醇浓缩得到粗酶液。
[0023](2)将上述粗酶液经过0.03 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)充分透析，并用PEG20000适当浓缩后，上样到充分平衡好的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析柱。以平衡胶柱用的0.03 mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.5)进行洗脱，再以含I mol/L NaCl的0.03mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行盐离子梯度连续洗脱，共洗脱出2个蛋白质峰。测定收集液的几丁质酶活性发现，上述收`集液中后一个峰的酶活最高，酶活达到4.36 U/mL，主要集中在500 min时间收集的管中。
[0024](3)用PEG20000适当浓缩500 min获得的收集液，上样到充分平衡好的S印hadexG-75凝胶过滤柱。以平衡胶柱用的0.03 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱，共洗脱出三个蛋白峰，对每个峰分别测酶活得出第一个峰的酶活最高为5.64 U/mL，其他峰的酶活很小接近于零，所以这个峰的取出液就是我们要的几丁质酶。
[0025](4)上述活性峰用SDS-PAGE电泳，表现为单带，表明纯化后的几丁质酶为单一组分，已达到电泳纯。
[0026]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)粗酶液的制备； (2)离子交换层析； (3)凝胶过滤。
2.根据权利要求1所述链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:所述粗酶液的制备:用优化试验筛选出的培养基培养链霉菌，在几丁质酶活性达最高时取发酵液离心，上清液用真空抽滤，除去杂质收集滤液，向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4°C静置过夜，再次离心收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀，离心溶解液除去不溶物体，上清液装于透析袋，经pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液透析后，再用聚乙二醇浓缩得到粗酶液。
3.根据权利要求2所述链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:所述培养基为:2% (w/V)的胶体几丁质 100ml/L,黄豆饼粉 0.4wt%，K2HPO4L 0 (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
4.根据权利要求1所述链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:所述离心条件为 4°C，转速 8500 ~12000 rpm,时间 10 ~15min。
5.根据权利要求1所述链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:所述离子交换层析:粗酶液经过聚乙二醇PEG20000浓缩后，用0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液平衡过夜，上样于充分平衡后的DEAE A-52阴离子交换层析柱，用0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含0-lmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液进行连续洗脱，收集洗脱液。
6.根据权利要求5所述链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:所所述洗脱条件为:流速35mL/h ；5mL/管。
7.根据权利要求1所述链霉菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:所述凝胶过滤:用pH6.5 0.01~0.03mol/L的磷酸盐缓冲液充分平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，上样后，再用相同的缓冲液进行洗脱，收集有酶活性的部份。
8.根据权利要求7所述的扁座壳孢菌几丁质酶的分离纯化方法，其特征在于:所述洗脱条件为:流速15-25 mL/h，5mL/管。
【文档编号】C12N9/42GK103667218SQ201310650637
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】段升华 申请人:中山奈德生物科技有限公司