一种克隆梅花中lfy同源基因编码区全序列的方法
【专利摘要】本发明公开了一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：基因组水平克隆：提取梅花叶片中的DNA；引物的设计及PCR反应：设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；PCR产物的回收和纯化；克隆；基因编码区全序列克隆：提取梅花叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；引物的设计及PCR反应：在基因组测序结果的基础上设计一对特异性引物，上下游引物分别包括起始密码子和终止密码子；PCR产物的回收和纯化；克隆。本发明具有节约成本、简便易行的特点，适合推广应用。
【专利说明】—种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法。
【背景技术】
[0002]一些研究表明LFY基因是决定花分生组织形成的必需基因(Weigel and N, 1995)，在植物成花过程中发挥核心作用。在所有的陆生植物中都能找到LFY基因，其已有近4000万年的进化历史。1990年Coen等利用转座子标签法从金鱼草中分离得到LFY的同源基因FL0,并发现其在花分生组织形成时起着重要的作用。1992年，Weigel等通过研究Ifyl突变体，利用RFLP技术从拟南芥中成功克隆了 LFY基因的全长，通过其表达方式及转基因的研究认为LFY基因不仅控制着花序分生组织向花分生组织的转变，且控制着开花时间。此后，科学家们相继从花椰菜、烟草、杨树等多种植物中分离克隆到了 LFY的同源基因，其中LFY同源基因的全序列被克隆的有:拟南芥(7308bp)、杨树(5656bp)、葡萄(2333bp)、桉树(1500bp)、花椰菜(2701bp)、豌豆(2224bp)、辐射松(3306bp)、银杏(3450bp)和台湾苣苔(2469bp)等植物。
[0003]根据已知LFY同源基因的序列比较发现，不同植物种间氨基酸序列的长度相差不大，最长的是红粉雪轮花的编码序列，长为1449bp，编码483个氨基酸，最短的是狭叶仙鹤藓的编码区，长为1014bp，编码338个氨基酸。用DNAMAN等软件比较分析已知的LFY同源基因，发现不同种间氨基酸序列的同源性都较较高，不同种间核苷酸同源性最高为98%，最低为47%，同科不同属之间LFY基因同源性远远高于不同科之间的同源性。亲缘关系较远的物种间LFY基因所编码的氨基酸具有较高的同源性说明在植物进化过程中LFY基因具有较高的保守性。
[0004]梅花为中国十大名花之首，之前研究多集中在形态观察、生理学等相关研究，分子生物学研究也较多集中在分子标记领域，鉴于此，克隆梅花中的LFY同源基因，填补梅LFY同源基因克隆空白具有重要意义。
[0005]RT-PCR克隆:是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用菌液PCR产物测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，可利用这一技术很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难于得到的PCR产物；克隆载体PCR测序能克服PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE(cNDA末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本低，工作量小。该技术成功的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在终止密码子的下游设计下游引物，使得PCR产物包含完整的基因编码区全序列。
[0006]现有技术中采用RACE (cNDA末端快速扩增)技术:是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。存在以缺陷:I)目的PCR产物的基因片段长度不明确；2)试验成本高；3)工作量大，实验技术要求高。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种节约成本、简便易行的克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法。其技术方案如下:
[0008]一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，包括以下步骤:
[0009]A、基因组水平克隆
[0010]Al、提取梅花叶片中的DNA ； [0011]A2、引物的设计及PCR反应:设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为:
[0012]上游引物P1: 5' -GGAAAATATGGATCCRGA-3'
[0013]下游引物P2:5' -TCARTAGGGYAGGTGMTC-3'
[0014]用DNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系:2 μ LlOXEX Taq buffer，1.6 μ LlOmmol.1ΜΝΤΡ，0.2 μ L 的 Ex Tap 酶，上下游引物各0.4μ L，ly L 的 DNA，14.4μ L 的 ddH20.，反应条件为 95°C 预变性 5min，30 个循环:94 °C，50s ；58°C, 50s ；72°C，lmin30s，最后 72°C，IOmin ；
[0015]A3、PCR产物的回收和纯化；
[0016]A4、克隆；
[0017]B、基因编码区全序列克隆
[0018]B1、提取梅花叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0019]B2、引物的设计及PCR反应:在基因组测序结果的基础上设计一对特异性引物，上下游引物分别包括起始密码子和终止密码子；设计的引物为:
[0020]上游引物Ql:5' -ATGGATCCAGACGCCTTCTC-3'
[0021 ]下游引物 Q2:5' -TCAGTAGGGTAGGTGATCACTGC-3'
[0022]用cDNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系:2 μ LlOXEX Taq buffer，1.6 μ LlOmmol.1ΜΝΤΡ，0.2 μ L 的 Ex Tap 酶，上下游引物各
0.4 μ L，I μ L 的 DNA, 14.4 μ L 的 ddH20.反应条件为 95°C预变性 5min, 30 个循环-MV，50s ；58°C，50s ；72°C, lmin30s，最后 72°C IOmin ；
[0023]B3、PCR产物的回收和纯化；
[0024]B4、克隆。
[0025]进一步优选，步骤Al中DNA的提取步骤为:
[0026]I)快速称取0.2g果梅幼叶于预冷灭过菌的研钵中，并加入少量PVP和2% β-巯基乙醇，加液氮研磨成粉状后立即加入600ul STE核分离缓冲液，迅速研磨成糊状匀浆，小心转入1.5mL离心管中，上下颠倒混匀，放置0°C冰浴IOmin ；
[0027]2)取出，4°C下5000rpm离心IOmin,弃上清液,若上清液仍粘稠,用STE核分离液反复清洗后离心；
[0028]3)往沉淀中加入600ul65°C预热的3XCTAB核裂解液和IOul β -巯基乙醇，同时洗净管盖及管壁上残留的植物组织，将材料轻轻混匀，65°C水浴保温60min，期间不时轻轻摇动离心管几次。[0029]4)取出，冷却几分钟后加入600ul氯仿/异戊醇体积比24:1和“PCN”溶液
0.0675gPVP,45ull0% CTAB+4% NaCl，摇匀，室温静置 5min 后 1000Orpm 离心 IOmin ；
[0030]5)转上清液于一新的离心管，重复抽提2~3次，每次抽提时都加入“PCN”溶液去
多糖；
[0031]6)取上清液，加入RNaseA至终浓度为10 μ g.mL—1，37°C水浴保温30min，取出后加入1/ 5体积5mol.T1NaCl和2倍体积预冷的乙醇，颠倒摇匀，_20°C静置30min沉淀DNA ；
[0032]7)挑出DNA集结成白色絮状用70%的乙醇清洗2次，室温风干后溶于50ulTE中，-20°C贮存备用。
[0033]进一步优选，步骤BI中所述RNA提取步骤为:
[0034]I)在IOml离心管中加入5ml CTAB和0.2ml的β -巯基乙醇，放入65°C水浴锅中
预热；
[0035]2)在液氮预冷好的研钵中将样品磨细，磨样时加入适量的PVP，分装于预热好的离心管中，每管3药匙,涡旋仪上涡旋混匀lmin,然后将离心管放入65°C水浴锅中加热,期间每隔IOmin不时上下颠倒混匀,水浴持续30min ；
[0036]3)再在混合物中加入3ml的酸性饱和酚:氯仿:异戊醇25:24:1，混合均匀后12000rpm,离心 IOmin, 4。。；
[0037]4)吸取离心后的上清液3.5ml转入新的IOml离心管中，然后再加入3.5ml的氯仿:异戊醇24:1，上下颠倒混匀后12000rpm，4°C，离心IOmin ；
[0038]5)重复第4)步，直至中间层消失；
[0039]6)第5)步完成后将上清分装入1.5ml离心管中，每管约0.7ml，然后加入等体积的预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后放入_20°C冰箱中冷冻30min ；
[0040]7)将冷冻的离心管按4°C，14000rpm，离心IOmin要求进行离心，离心完成后将上面液体倒掉，保留离心管底部白色透明状的沉淀；
[0041]8)再加入适量的65°C预热好的SSTE溶解沉淀；
[0042]9)在溶解好沉淀的溶液里加入Iml的Trizol试剂,再加入0.25ml的氯仿,混匀后放置 5-10min, 12000rpm, 4°C，离心 IOmin ；
[0043]10)转移上清液于新的离心管中，加入等体积遇冷的异丙醇，混匀后放置于冰上静置 15min:
[0044]11)完成后 4°C, 12000rpm,离心 15min 收集沉淀；
[0045]12)收集到的沉淀中加入DEPC水处理的75 %乙醇Iml，4 °C，12000rpm,离心lOmin，倒去上清液，重复一次；
[0046]13)将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，加入30 μ IDEPC水溶解沉淀。
[0047]与现有技术相比，本发明的有益效果:B1步骤中采用的RNA提取方法为改良的CTAB+Trizol法中所用的CTAB的主要成分是:10 % CTAB, 10 % PVP40,1.0MTris-HCl (pH8.0)、5mol.L^1NaCL, 0.6M EDTA (pH8.0)，浓度较高的 NaCL 更加有利于去除组织材料中的多糖(多糖与RNA结合较紧密，不易去除)，EDTA的存在，也可以有效的抑制RNAase活性，减少RNA的降解，β -巯基乙醇的可以用来防治褐化。本实验得到RNA后，再用SSTE:5mol.L^1NaCI,5 % SOSA.0mo1.L^1Tris-HCl (ρΗ8.0)、0.6mol.L^1EDTA(ρΗ8.0))溶解，用Trizol再抽提，这样就更加的保证了 RNA的纯度，大大的减少了 RNA中所含有的杂质，有效的去除了 RNA中的DNA，在后续的实验中，免除了基因组的污染，从而影响实验结果。同时，与RACE (cNDA末端快速扩增)技术相比较而言，该技术成本低，工作量小，该技术的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在终止密码子的下游设计下游引物，使得PCR产物包含完整的基因编码区全序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1是基因组水平PCR产物电泳图；
[0049]图2是梅花LFY同源基因PCR产物电泳图。
【具体实施方式】
[0050]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0051]本发明所得的梅花LFY同源基因全表达序列如SEQ ID:1所示。
[0052]将测序结果在NCBI上运用blast在线比对软件以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的梅花LFY同源基因完整编码区序列的核苷酸序列与其他已知的植物种类LFY基因具有极高的同源性，表明该方法能达到获得梅花LFY同源基因完整编码区序列的目的。
[0053]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。`
【权利要求】
1.一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤: A、基因组水平克隆 Al、提取梅花叶片中的DNA; A2、引物的设计及PCR反应:设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为:
上游引物 P1: 5' -GGAAAATATGGATCCRGA-3' 下游引物 P2:5' -TCARTAGGGYAGGTGMTC-3' 用DNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系:2 μ LlOXEXTaq buffer, 1.6μ L dNTP (lOmmol.L-1)，0.2 μ L 的 Ex Tap 酶，上下游引物各 0.4 μ L，I μ L的 DNA, 14.4 μ L 的 ddH20，反应条件为 95°C预变性 5min,30 个循环:94°C,50s ；58°C,50s ；72°C，lmin30s，最后 72°C，IOmin ； A3、PCR产物的回收和纯化； A4、克隆； B、基因编码区全序列克隆 B1、提取梅花叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ； B2、引物的设计及PCR反应:在基因组测序结果的基础上设计一对特异性引物，上下游引物分别包括起始密码子和终止密码子；设计的引物为: 上游引物 Ql:5' -ATGGATCCAGACGCCTTCTC-3' 下游引物 Q2:5' -TCAGTAGGGTAGGTGATCACTGC-3' 用cDNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系:2 μ LlO XEXTaq buffer, 1.6μ L dNTP:1Ommol.L-1，0.2 μ L 的 Ex Tap 酶，上下游引物各 0.4 μ L，I μ L的 DNA, 14.4 μ L 的 ddH20.)，反应条件为 95°C预变性 5min, 30 个循环:94°C，50s ；58°C, 50s ；72°C，lmin30s，最后 72°C IOmin ； B3、PCR产物的回收和纯化； B4、克隆。
2.根据权利要求1所述的克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，其特征在于，步骤Al中DNA的提取步骤为: 1)快速称取0.2g果梅幼叶于预冷灭过菌的研钵中，并加入少量PVP和2% β -巯基乙醇，加液氮研磨成粉状后立即加入600ul STE核分离缓冲液，迅速研磨成糊状匀浆，小心转入1.5mL离心管中，上下颠倒混匀，放置0°C冰浴IOmin ； 2)取出，4°C下5000rpm离心IOmin,弃上清液,若上清液仍粘稠,用STE核分离液反复清洗后离心； 3)往沉淀中加入600ul65°C预热的3XCTAB核裂解液和IOulβ -巯基乙醇，同时洗净管盖及管壁上残留的植物组织，将材料轻轻混匀，65°C水浴保温60min，期间不时轻轻摇动离心管几次； 4)取出，冷却几分钟后加入600ul氯仿/异戊醇体积比24:1和“PCN”溶液0.0675gPVP,45ullO% CTAB+4% NaCl，摇匀，室温静置 5min 后 1000Orpm 离心 IOmin ； 5)转上清液于一新的离心管，重复抽提2~3次，每次抽提时都加入“PCN”溶液去多糖；6)取上清液，加入RNaseA至终浓度为10μ g.mL—1，37°C水浴保温30min，取出后加入I / 5体积5mol.L-1NaCl和2倍体积预冷的乙醇，颠倒摇匀，_20°C静置30min沉淀DNA ； 7)挑出DNA集结成白色絮状用70%的乙醇清洗2次，室温风干后溶于50ulTE中，-20°C贮存备用。
3.根据权利要求1所述的克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，其特征在于，步骤BI中所述RNA提取步骤为: 1)在IOml离心管中加入5mlCTAB和0.2ml的β -巯基乙醇，放入65°C水浴锅中预执.2)在液氮预冷好的研钵中将样品磨细，磨样时加入适量的PVP，分装于预热好的离心管中，每管3药匙，涡旋仪上涡旋混匀lmin，然后将离心管放入65°C水浴锅中加热，期间每个隔IOmin不时上下颠倒混匀,水浴持续30min ； 3)再在混合物中加入3ml的酸性饱和酚:氯仿:异戊醇25:24:1，混合均匀后12000rpm,离心 IOmin,常温； 4)吸取离心后的上清液3.5ml转入新的IOml离心管中，然后再加入3.5ml的氯仿:异戊醇24:1，上下颠倒混匀后12000rpm，4°C，离心IOmin ； 5)重复第4)步，直至中间层消失； 6)第5)步完成后将上清分装入1.5ml离心管中，每管约0.7ml，然后加入等体积的预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后放入_20°C冰箱中冷冻30min ； 7)将冷冻的离心管按4°C，14000rpm，离心IOmin要求进行离心，离心完成后将上面液体倒掉，保留离心管底部白色透明状的沉淀； 8)再加入适量的65°C预热好的SSTE溶解沉淀； 9)在溶解好沉淀的溶液里加入Iml的Trizol试剂，再加入0.25ml的氯仿，混匀后放置5-10min, 12000rpm, 4°C,离心 IOmin ； 10)转移上清液于新的离心管中，加入等体积遇冷的异丙醇，混匀后放置于冰上静置15min ； 11)完成后4°C,12000rpm,离心15min收集沉淀； 12)收集到的沉淀中加入DEPC水处理的75%乙醇lml，4°C，12000rpm，离心IOmin,倒去上清液，重复一次； 13)将液体倒掉，通风条件下晾干管中液体，加入30μ IDEPC水溶解沉淀。
【文档编号】C12N15/10GK103667313SQ201310642751
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】郑炳松, 江波, 任韡, 方仲相, 方佳, 何勇清 申请人:浙江农林大学