一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，由构建含rrsB-trnI-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体、构建含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体、构建条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体组成。本发明采用质体遗传转化的思路，为质体遗传转化提供载体基础，以期实现质体遗传转化外源基因表达效率高、来自原核的基因无需修饰改造、安全性好、易保持纯系、后代不分离的优势。
【专利说明】一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法。
【背景技术】
[0002]紫菜是目前经济价值最高的一种栽培海藻，我国是紫菜栽培大国，紫菜干品的年产量达到1.6万吨,长江以北以条斑紫菜(pyropia yezoensis)为主,长江以南,特别是福建、浙江主要栽培坛紫菜(Pyropia haitanensis)。近年来,随着栽培面积的扩大,紫菜养殖面临品种退化和病害频发的严峻局面。因此，利用现代分子生物学手段开展紫菜基因工程研究，培育紫菜抗逆新品种，是解决上述问题的重要途径之一。
[0003](I)质体遗传转化的研究
[0004]高等植物细胞中，细胞核、质体和线粒体都含有DNA，它们构成了既相对独立又相互联系的三个遗传系统。自70年代初基因工程技术诞生以来，向细胞核导入外源基因的核基因转化技术已经广泛应用于重要农作物改良及分子生物学研究中。几十年来，核基因转化一直是植物基因工程的主要研究方向。然而，随着研究的深入进展，人们逐渐认识到核基因转化有其难以克服的弊 端，例如:细胞核基因组大，背景复杂；导入的外源基因难以控制；外源基因表达效率低，后代不稳定；对于来自原核的基因必须加以修饰改造等等，这些问题严重影响着核基因转化技术的实际应用。为了克服核基因转化存在的某些不足，1988年Boynton等人独辟蹊径，以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardii)为材料用基因枪向叶绿体中转化外源基因，使突变体成功转化为能进行光合作用的正常莱茵衣藻，首次证实了叶绿体转化技术的可行性。后来，Svab等人将此技术应用于烟草，获得了稳定的质体转化体，由此带来了高等植物质体遗传转化的研究高潮。质体遗传转化在一定程度上克服了核基因转化的不足，具有独特的优越性，例如:将未经改造的苏云金杀虫蛋白基因(Bt基因)转化烟草叶绿体，其表达量比核基因转化提高了 50倍以上。近几年来，质体基因转化技术发展迅速，已开始成为植物基因工程中新的热点。目前实现质体遗传转化的物种有:衣藻、烟草、马铃薯、拟南芥、番茄、油菜、胡萝卜、棉花、大豆、矮牵牛、西兰花、莴苣、杨树、水稻、甘蓝、地钱、甜菜、茄子、小麦等。质体遗传转化过程一般分以下4步进行:(1)构建质体定点整合表达载体；(2)将含外源DNA的质体定点整合表达载体通过适当的转化方法导入质体中，使外源DNA整合到基因组中；(3)筛选成功转化的质体的细胞；(4)稳定质体转化株的繁殖和鉴定。其中，成功构建高效表达的遗传转化载体是质体遗传转化的前提。
[0005]在载体构建中，利用与质体基因组完全同源的两翼片段实现外源基因与质体基因组的同源重组。
[0006]表达载体具有宿主叶绿体基因组l_2kb大小的左侧和右侧的侧翼序列，用于通过同源重组将外源基因插入到叶绿体DNA中。在叶绿体基因组中的插入位点是由所选择的位于标记基因和目的基因两侧的叶绿体DNA片段决定的。高等植物中，叶绿体基因组成功实现定点整合的位点包括:trnV-3' rpsl2, trnl-trnA 和 trnfM-trnG。trnV-3' rpsl2 和trnl-trnA位点都位于叶绿体DNA中25kb的反向重复序列区域,而插入这些位点的基因能够在反向重复序列区域被快速复制成两个拷贝。
[0007]构建的载体需要有自身调控转录和表达的能力，此功能的实现有赖于外源基因两侧的调控序列。
[0008]调控序列:叶绿体的基因表达水平主要是由启动子和5'端非翻译区元件决定的，因此，一个包含有核糖体结合位点(RBS)的合适的5'非翻译区是叶绿体表达载体的重要组成元件。为了通过转基因表达使蛋白大量积累，首先需要一个强启动子来保证高水平的mRNA。转基因mRNA的稳定性也是由转基因两侧的5' -UTR和3' -UTR序列保证的，转基因蛋白的积累依赖于插入到编码目的基因的开放阅读框上游的5' -UTR序列。最常用的5' -UTR 是 Prrn、psbA，常用的 3' -UTR 是 atpA3' -UTR、rbcL3' -UTR、psbA3' -UTR 即TpsbA0
[0009]质体遗传转化的筛选标记:质体基因组含有较多的拷贝，一般高等植物的一个细胞中有100或更多个质体，每个质体中又有多个拷贝的质体基因组，因而同时转化这么多基因组是不可能的，极易出现转化的与未转化的质体组成的异质体，无法保证获得的性状稳定遗传下去。因此，质体基因转化所面临的第三个关键问题就是去除未转化的基因组和未转化质体。这个问题的解决是通过向质体中转入筛选标记基因、进行抗菌素抗性筛选、淘汰掉不含转化质体的个体来实现的。第一个用于叶绿体转化的选择标记基因是质体16S rRNA基因(rrnl6)转化株由壮观霉素抗性筛选而且效率很低。随后，编码氨基葡糖苷3'-腺苷酰转移酶的aadA基因被用作选择标记基因，用aadA基因作为筛选标记显著提高了叶绿体转化子的阳性比例，使被轰击的每个叶片样品中平均存在一个转化子。编码草丁勝乙酸转移酶(phosphinothricin acetyl transferase, PAT)的bar基因也曾经被用作标记基因，但其没有得到广泛的应用。此外，绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LuxAB)等既可作为标记基因又能作为报告基因，尤其是LuxAB基因的应用更加广泛。Franklin和Mayfield等在莱茵衣藻叶绿体中成功表达了 GFP和LuxCt,其中LuxCt是以荧光素酶基因LuxAB为基础进行适当改造而成，它在莱茵衣藻叶绿体中的表达使得转化阳性克隆能够被直接观察，便于筛选。针对紫菜这个物种，有研究表明，氯霉素对紫菜原生质体有明显的致死效应，有望作为紫菜原生质体转化的有效选择压力。氯霉素干扰细胞内核糖体的蛋白质合成，抑制细胞生长并最终导致死亡，而cat基因编码的氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase)则使氯霉素乙酰化而失活。植物细胞内非特异性CAT本底活性很低，不会对转基因产物的分析造成干扰。在高等植物中，已有很多以cat基因作选择标记基因成功的实例。
[0010](2)紫菜现有遗传转化技术
[0011]目前，紫菜现有的遗传转化技术较成熟的是瞬时表达技术。构建载体将外源基因用基因枪法转化进紫菜叶状体、单孢子、原生质体等细胞中，由于载体上有完整的启动子与终止子，所以外源基因可以利用紫菜本身的表达系统短时间内表达。但表达时间短，不能得到稳定的转化个体。
·[0012]目前，在藻类中仅在衣藻中成功实现了质体的遗传转化。关于紫菜质体遗传转化的研究还未见报道。
【发明内容】
[0013]为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于条斑紫菜质体遗传转化的载体构建方法。此技术的成功可以有效地解决:1、可用于条斑紫菜质体遗传转化的筛选基因表达盒；2、可用于条斑紫菜质体遗传转化的定点整合位点；3、可用于条斑紫菜质体遗传转化的内源调控序列，包括5'端质体内源启动子和3'非转录区。成功构建条斑紫菜的遗传转化体系，也将为后期的条斑紫菜功能基因的研究提供技术平台。其技术方案如下:
[0014]一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，包括以下步骤:
[0015](I)构建含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体。①质体同源重组片段的克隆。以条斑紫菜质体基因组为模板，用下述正向和反向引物Xho1-PyT-Fl 5/ -CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA-3' Sac1-PyT-Rl 5' -CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA-3'进行PCR扩增，所述正反向引物5'端分别添加了 XhoI和SacI酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物是3'末端为序列I 5'端第1-18寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端为序列I 3'端第1-20碱基反向互补的寡核苷酸序列。将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测，得到重组质粒；②用XhoI / SacI双酶切pBluescriptSK载体(购自北京艾德莱生物科技有限公司)和步骤①中所得重组质粒，切胶回收2890bp和2500bp片段。用T4 DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测，得到重组质粒，即含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体；
[0016](2)构建含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体。①以条斑紫菜质体基因组为模板,用下述正向和反向引物Cla1-PypsbA-Fl 5' -CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT-3' HindII1-PypsbA-Rl 5' -CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT-3'对 psbA 序列进行 PCR扩增，所述正反向引物5'端分别添加了 ClaI和HindIII酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物是3'末端为序列4 3/端第1-18碱基反向互补的寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端为序列3 5/端第1-18寡核苷酸序列。将扩增产物与PMD18-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测，得到重组质粒；②抗生素筛选基因(氯霉素抗性基因 cat)的克隆。以 pCAT?3-Control Vector 为模板,用下述引物 Afe 1-cat-Fl 5' -TCTGAGCGCTATGGAGAMAAAATCACTGG-3' Pac 1-cat Rl 5' -GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG-3' PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因cat基因。所述正反向引物5'端分别添加了 Afe I和PacI酶切位点和多个保护碱基，且所述正向引物是3'末端为序列2 5'端第1-20寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端为序列2 3/端第1-15碱基反向互补的寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测，得到重组质粒；③将上述步骤①和步骤②所得重组质粒用Afe I / Pae I双酶切，切胶回收3600bp和660bp片段，用T4 DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测，得到重组质粒，即含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体；
[0017](3)构建条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体。利用同源重组片段与质体基因组之间的同源重组将外源基因定点整合到受体细胞的质体基因组中，利用条斑紫菜psbA基因的启动子psbA5'和终止子psbA3'调控外源基因转录，构建含有筛选标记基因cat的条斑紫菜质体基因组定点整合表达载体。用ClaI / HindIII双酶切步骤(2)中所得的含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体，回收cat基因表达盒，再用T4DNA Polymerase补平,插入到经过AvrII单酶切、末端平化、去磷酸化的步骤(1)所得的含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体中，最终构建成含筛选标记基因cat表达盒、用于条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体PYVC ；
[0018]进一步优选,所述同源重组片段为rrsB-trnl-trnA-rrsL序列如SEQ ID N0:1所示。
[0019]进一步优选，所述抗生素筛选基因为氯霉素乙酰转移酶基因cat基因如SEQ IDNO:2所示。
[0020]进一步优选,所述调控cat基因转录和表达的启动子为条斑紫菜psbA启动子如SEQ ID NO:3 所示。
[0021]进一步优选，所述调控cat基因转录和表达的3'非转录区为条斑紫菜psbA基因3'非转录区如SEQ ID N0:4所示。
[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果:本发明采用质体遗传转化的思路，有效克服了核遗传转化和瞬时表达的缺陷和弊端，可以成功解决外源基因表达效率低的缺陷。由于质体是母系遗传，只能通过母本代代传播，安全性好，且后代纯系稳定。来自原核的基因无需修饰改造，就直接可以在质体中表达。本发明为质体遗传转化提供载体基础，以期实现质体遗传转化外源基因表达效率高、来自原核的基因无需修饰改造、安全性好、易保持纯系、后代不分离的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是构建载体 结构示意图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0025]一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，包括以下步骤::
[0026](I)构建含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体。①质体同源重组片段的克隆。分析条斑紫菜质体基因组全序列(GenBank Accession N0.KC517072.1)选定rrsB和trnl-trnA-rrsL基因间隔区作为外源基因的插入位点。由上海英潍捷基生物公司合成如下引物，每个引物的5'端分别添加了特定的酶切位点和保护碱基。
[0027]Xho1-PyT-Fl 5' -CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA-3'
[0028]Sac1-PyT-Rl 5' -CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA-3'
[0029]以条斑紫菜质体DNA为模板,用Taq DNA polymerase扩增。PCR体系(20ul体系):mixl0ul ;正向引物 0.6ul ;反向引物 0.6ul ;模板 Iul ；Taq DNA聚合酶0.2ul ；BSAlul ；ddH206.6ul。PCR 程序:94°C预变性 IOmin ;94°C变性 Imin ；55.5°C退火 Imin ;72°C延伸 2:30min，循环35次，72°C延伸lOmin。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与PMD19-T载体连接。连接条件为:PMD19-T载体0.5 iil，聚合酶链式反应回收产物4.5 iil，solusion I5ul (所用为TaKaRapMD?19 -T Vector试剂盒)16°C反应14个小时后转化感受态的DH5 a细胞，并涂布于含有IOOii g / ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有IOOiig / ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14~16小时后，菌落PCR鉴定获得阳性克隆。将所获得的阳性克隆命名为PYA ;②将同源重组片段插入pBluescript SK载体，即:将同源重组片段从pYA载体上经XhoI / SacI双酶切回收后连入同样经XhoI / SacI双酶切的pBluescript SK载体中。用XhoI / SacI双酶切pBluescript SK载体和含同源重组片段的载体pYA，，经2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收2890bp和2500bp片段。用T4DNA Ligase连接，连接条件是:12 yl酶切纯化片段，2 u I 10XT4DNA连接酶缓冲液，5 U I酶切载体，I U I T4DNA连接酶，16°C反应14个小时。连接产物采用同样的方法转化、菌落PCR鉴定获得阳性克隆，命名为pYD，SP含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体。[0030](2)构建含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体。①质体psbA基因(包含5'启动子，编码区，3'终止子)的克隆。分析条斑紫菜质体基因组全序列(GenBankAccession N0.KC517072.1)选定长度为1.9kb的psbA序列。设计并由上海英潍捷基生物公司合成如下引物，每个引物的5'端分别添加了特定的酶切位点和保护碱基。
[0031]Cla1-PypsbA-Fl 5' -CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT-3'
[0032]HindII1-PypsbA-Rl 5' -CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT3'
[0033]以条斑紫菜质体DNA为模板,用Taq DNA polymerase扩增。PCR体系(20ul体系):mix IOul ;正向引物Iul ;反向引物Iul ;模板Iul ;Taq DNA聚合酶0.2ul ;BSAlul ;ddH205.8ul。PCR 程序:94 °C 预变性 IOmin ;94°C 变性 Imin ;54.8°C 退火 Imin ;72°C 延伸2min，循环35次，72°C延伸lOmin。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与PMD19-T载体连接。连接条件为:PMD19-T载体0.5 iil，聚合酶链式反应回收产物4.5 iil，solusion I5ul (所用为TaKaRapMD?19 -TVector试剂盒)16°C反应14个小时后转化感受态的DH5 a细胞，并涂布于含有IOOu g / ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有IOOii g / ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14~16小时后，菌落PCR鉴定获得阳性克隆。将所获得的阳性克隆命名为pYB。②氯霉素抗性基因cat的克隆。根据cat基因序列设计并由上海英潍捷基生物公司合成如下引物，每个引物的5'端分别添加了特定的酶切位点和保护碱基。
[0034]Afe 1-cat-Fl 5' -TCTGAGCGCTATGGAGAAAAAAATCACTGG-3'
[0035]Pac 1-cat-Rl 5' -GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG-3'
[0036]以pCAT?3_Control Vector 为模板，用 Taq DNA polymerase扩增。PCR体系(20ul体系):mix IOul ;正向引物0.5ul ;反向引物0.5ul ;模板Iul ;Taq DNA聚合酶0.2ul;ddH207.8ul。PCR 程序:94°C预变性 5min ;94°C变性 45s ；64.2°C退火 45s ;72°C延伸 lmin,循环30次，72°C延伸lOmin。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与PMD19-T载体连接。连接条件为:pMD19-T载体0.5 iil，聚合酶链式反应回收产物4.5 iil，solusion I5ul (所用为TaKaRa pMD?19-TVector试剂盒)16°C反应14个小时后转化感受态的DH5 a细胞，并涂布于含有100 ii g /ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100 ii g / ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14~16小时后，菌落PCR鉴定获得阳性克隆。将所获得的阳性克隆命名为pYC。③将cat基因片段从pYC载体上经Afe I / Pac I双酶切回收后连入同样经Afe I / Pac I双酶切的含PsbA基因5'和3'非转录片段的pYB载体中。将含psbA基因的载体pYB与含氯霉素抗性基因cat的载体pYC用Afe I / Pac I双酶切，经I %琼脂糖凝胶电泳切胶回收3600bp和660bp片段。用T4 DNA Ligase连接，连接条件是:12 酶切纯化片段，2 yl10父140嫩连接酶缓冲液，5111酶切载体，1111 T4DNA连接酶，16°C反应14个小时。连接产物采用同样的方法转化、菌落PCR鉴定获得阳性克隆，命名为pYE，即含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体。
[0037](3)构建条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体。利用同源重组片段与质体基因组之间的同源重组将外源基因定点整合到受体细胞的质体基因组中，利用条斑紫菜psbA基因的启动子psbA5'和终止子psbA3'调控外源基因转录，构建含有筛选标记基因cat的条斑紫菜质体基因组定点整合表达载体。用ClaI / HindIII双酶切含cat基因表达盒的重组质粒pYE,回收cat基因表达盒,再用T4DNA Polymerase补平(补平反应用TaKaRa DNA Blunting Kit), D N A纯化后(用TIANGEN普通DNA产物纯化试剂盒)插入到经过AvrII单酶切、末端平化(方法同上)、去磷酸化的pYD中，去磷酸化的条件是:5ul10XNEB Buffer3，lul CIP，23ul DNA，21ul ddH20 ;连接反应条件为:4 ul 酶切纯化片段，2 ul IOX T4DNA 连 接酶缓冲液，6ul 酶切载体，1ul T4 DNA 连接酶，2 ul 50 % PEG 5u lddH20，16°C反应14个小时。连接产物采用同样的方法转化、菌落PCR鉴定获得阳性克隆，命名为pYVC，即最终构建的含筛选标记基因cat表达盒、用于条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体。
[0038]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，本发明同样适用于坛紫菜等相关物种，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，包括以下步骤: (1)构建含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体，①质体同源重组片段的克隆，以条斑紫菜质体基因组为模板，用下述正向和反向引物Xho1-PyT-Fl 5' -CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA-3' Sac1-PyT-Rl 5' -CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA-3'进行 PGR扩增，所述正反向引物5'端分别添加了 XhoI和SacI酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物是3'末端为序列I 5'端第1-18寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端为序列I3'端第1-20碱基反向互补的寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测，得到重组质粒；②用XhoI / SacI双酶切pBluescript SK载体和步骤①中所得重组质粒，切胶回收2890bp和2500bp片段，用T4 DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测,得到重组质粒，即含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体； (2)构建含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体，①以条斑紫菜质体基因组为模板，用下述正向和反向引物 Cla1-PypsbA-Fl 5' -CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT3'HindII1-PypsbA-Rl 5' -CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT-3'对 psbA 序列进行 PCR 扩增，所述正反向引物5'端分别添加了 ClaI和HindIII酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物是3'末端为序列4 3/端第1-18碱基反向互补的寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端为序列3 5/端第1-18寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD18-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5ci，菌落PCR检测，得到重组质粒；②抗生素筛选基因的克隆，以pCAT?3-Control Vector为模板，用下述引物Afe 1-cat-Fl 5' -TCTGAGCGCTATGGAGAAAAAAATCACTGG-3' Pac 1-cat-Rl 5' -GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG-3' PCR 扩增氯霉素乙酰转移酶基因cat基因，所述正反向引物5'端分别添加了 Afe I和Pac I酶切位点和多个保护碱基，且所述正向引物是3'末端为序列2 5'端第1-20寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端为序列2 3/端第1-15碱基反向互补的寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5ci，菌落PCR检测，得到重组质粒；③将上述步骤①和步骤②所得重组质粒用Afe I / Pac I双酶切，切胶回收3600bp和660bp片段，用T4DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5 a，菌落PCR检测，得到重组质粒，即含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体；` (3)构建条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体，用ClaI/ HindIII双酶切步骤(2)中所得的含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体，回收cat基因表达盒，再用T4DNA Polymerase补平,插入到经过AvrII单酶切、末端平化、去磷酸化的步骤(1)所得的含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体中，最终构建成含筛选标记基因cat表达盒、用于条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体pYVC。
2.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述同源重组片段为rrsB-trnl-trnA-rrsL序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述抗生素筛选基因为氯霉素乙酰转移酶基因cat基因如SEQ ID N0:2所示。
4.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述调控cat基因转录和表达的启动子为条斑紫菜psbA启动子如SEQ ID N0:3所示。
5.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述.调控cat基因转录和表达的3'非转录区为条斑紫菜psbA基因3'非转录区如SEQ ID NO:4所示。
【文档编号】C12N15/82GK103667328SQ201310632575
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】孔凡娜, 刘伟勋, 茅云翔, 曹敏 申请人:中国海洋大学