检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～6所示的引物组和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法如下：配制RT-LAMP反应体系，进行恒温反应；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。
【专利说明】检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应
用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002]流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一种重要的蚊媒性人畜共患传染病。JEV是引起母猪出现繁殖障碍的主要病原体之一，对猪的致死率不高，但可引起怀孕母猪流产、产死胎或木乃伊胎，也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育，给养猪业的持续发展造成较大的经济损失。因此，防制猪JE不仅可以减少养猪业的损失，而且对人类的健康发展有重要意义。
[0003]流行性乙脑病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),所致疾病在日本称日本乙型脑炎(JBE)。1950年以来，中国对该病进行了大量病原学和流行病学研究，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑，是中国夏秋季流行的主要传染病之一，除新疆、西藏、青海外，全国各地均有病例发生，年发病人数2.5万，病死率10%，大约15%的患者留有不同程度的后遗症。
[0004]日本脑炎病毒( Japanese Encephalitis virus)属于黄病毒科甲病毒属。该病毒呈球形，直径约40nm，二十面体立体对称的核衣壳，内有衣壳蛋白(C)与核酸构成的核心，外披以含脂质的囊膜，表面有囊膜糖蛋白(E)刺突，即病毒血凝素，囊膜内尚有内膜蛋白(M)，参与病毒的装配。病毒基因组为单股正链RNA，全长llkb，自5'至3'端依次编码结构蛋白C、M、E以及非结构蛋白NSl—NS5，病毒RNA在细胞浆内直接起mRNA作用，翻译出结构蛋白和非结构蛋白，在胞浆粗面内质网装配成熟，出芽释放。
[0005]目前，有许多技术可用于JEV的检测，如免疫荧光法、免疫组织化学技术、直接电镜、免疫电镜、酶联免疫吸附试验、阻断ELISA、链霉亲和素-生物素技术、原位杂交法、竞争阻断ELISA。然而这些检测方法不但需要昂贵的设备仪器花费较长的时间，而且特异性和敏感性较低。因此，在实验室建立一种快速，敏感，特异的检测JEV的诊断方法是十分必要的。
[0006]环介导等温核酸扩增技术(LAMP):LAMP是由日本的Notomi (Notomi et al, 2000)在2000年发明的一种全新的核酸扩增方法。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的4条引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下(60°C -65°C )可高效、快速、特异的扩增靶序列。LAMP法不仅能扩增DNA，也能扩增RNA，只需在反应体系中加入一定量的反转录酶就能实现扩增，整个反应时间非常短，此技术设备要求低，一个恒温箱或水浴锅就能完全反应。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplificationmethod for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinMicrobiol, 2004May ；42(5):1956-61)于 2004 年根据 LAMP 原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；MasakiImai 等人(Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newlydeveloped influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method.Virol Methods.2007May, 141 (2): 173-80.)于 2007 年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。由于LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门对LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携带；有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。后来，有研究对LAMP方法作进一步改进，在原有LAMP反应试剂的基础上添加钙黄绿素和氯化锰后，可以衍生出另外一种更为简便的可视化LAMP，一步即可完成LAMP扩增及结果判定，LAMP产物无需开盖分析即可用肉眼观察结果。但这种方法因存在假阳性率过高、弱阳性结果的判别不够准确、且钙黄绿素与锰离子的浓度配比体系不稳定等缺点而使该方法的应用推广受到限制。
【发明内容】
[0007]本发明首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单等优点。
[0008]本发明的另一目的在于提供实现上述检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，包含如下引物组和核酸检测试纸条:
[0010]所述的引物组的核苷酸序列如下所示:
[0011]F3:5，-CGGCATGGAGAAACAGAGAA-3，；
[0012]B3:5’ -CCTTCAGAGCCAGTTTGTCC-3’ ；
[0013]FIP:5’ -Biotin-CCTGCCAACGCTTGATGGAGGGAAGAGGCACATGCCACAA-3’ ；
[0014]BIP:5’ -AGCCATCGTGGTGGAGTACTCGAGCCTGCATTTCAGGTGAC-3’ ；
[0015]LoopF:5，-FITC-GACCCAAGAGCTACGACAGACTGTT-3，；
[0016]LoopB:5，-GCTCGGTGAAGTTGACATCAG-3，；
[0017]所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；
[0018]所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒优选包含上述引物组和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；
[0019]所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品；该检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到；
[0020]所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，还包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)、甜菜碱(Betaine)溶液和AMV逆转录酶；[0021]所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒更优选为包含浓度为5υ/μ L的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液(10XThermoPol Reaction Buffer)、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为lOmol/L的甜菜碱溶液、浓度为lOOmmol/L的MgSO4溶液、浓度为10 μ mo I/L的引物FIP、浓度为10 μ mo I/L的引物BIP、浓度为10 μ mo I/L的引物F3、浓度为10 μ mo I/L的引物B3、浓度为10 μ mo I/L的引物LoopF和浓度为10 μ mo I/L的引物LoopB ；
[0022]所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤:
[0023](I)配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为105U/L、10倍反应缓冲液(10 X ThermoPol Reaction Buffer)为 I 倍(I X )、链置换 DNA 聚合酶为 0.32U/L、dNTP混合物为0.4~0.6mmol/L、甜菜喊为O~2mol/L、MgS04为O~3mmol/L、FIP引物为1.6ymol/L、BIP 引物为 1.6ymol/L、F3 引物为 0.2ymol/L、B3 引物为 0.2 μ mol/L、LoopF弓丨物为0.8 μ mol/L、LoopB弓丨物为0.8 μ mol/L，待测样品RNA为12ng/ μ L ;恒温反应；
[0024](2)反应:将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，IOmin观察结果；
[0025](3)结果判读:直接肉眼判读，
[0026]①阴性(一):仅在质控区(C)出现一条红色条带，在检测区(T)内无红色条带出现，证明所检测的样本没有日本乙型脑炎病毒感染；
[0027]②阳性(+):出现两条红色条带，一条位于检测区(T)内，另一条位于质控区(C)内，证明所检测的样本为日本乙型脑炎病毒感染；
[0028]③无效:质控区(C)和检测区(T)内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。
`[0029]步骤(1)中所述的dNTP混合物的终浓度优选为0.4mmol/L ；
[0030]步骤(1)中所述的甜菜碱的终浓度优选为1.5mol/L ；
[0031 ] 步骤(1)中所述的MgSO4的终浓度优选为2mmol/L ；
[0032]步骤(2)中所述的恒温反应的时间优选为50~70min ；
[0033]步骤(2)中所述的恒温反应的条件优选为61°C反应60min。
[0034]与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果:
[0035](I) RT-LAMP核酸试纸条检测方法成本低廉,利用Bst DNA polymerase在61 °C实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此，本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒使用成本低。
[0036](2)本发明所提供的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒反应迅速，利用AMV反转录酶实现一步法RT-LAMP，无需增加42°C Ih的反转录过程，可以在60min内完成反应，最快可以在40min内完成。
[0037](3)本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒得到的反应结果直观准确，无需进行复杂操作。虽然LAMP在DNA扩增过程中产生大量焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，在反应结束后无需琼脂糖凝胶电泳即可直接肉眼观察反应管中浑浊来判断阳性与否，但弱阳性结果仍给判别带来较大困难。如果在引物5’端进行特异性生物标记，然后再用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置对产物进行检测，既可以准确对结果进行直观、快速的判读，又可以防止污染。
[0038](4)本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒特异性好，对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等都呈阴性反应；灵敏度高，最低可以检测到30pg的RNA模板，与RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR方法检测一致，比钙黄绿素可视化RT-LAMP方法的灵敏度高10倍(即检测限低10倍)。即使是几个病毒粒子，也能被快速准确的检测出来。
[0039](5)本发明所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒可快速、灵敏地检测日本乙型脑炎病毒，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅即可完成反应。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为RT-LAMP反应检测体系优化结果图，其中:
[0041]A为dNTP不同终浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道I~6依次对应dNTP的终浓度分别为0.1mM.0.2mM,0.3mM,0.4mM,0.5mM和(λ 6mM时得到的反应
产物；
[0042]B为甜菜碱不同终浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道I~5依次对应甜菜碱的终浓度分别为0M、0.5M、1.0M、1.5M和2.0M时得到的反应产物；
[0043]C为MgSO4F同终浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道I~5依次对应MgSO4的终浓度分别为0mM、lmM、2mM、3mM和4mM时得到的反应产物；
[0044]D为内外引物不同浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道I~6次对应内引物(BIP+FIP)和外引物(B3+F3)按终浓度比为2:1,4:1,6:1,8:1,10:1和12:1时得到的反应产物，外引物终浓度为0.2μπι01/1 ；
[0045]E为环引物与外引物不同浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道I~6依次对应环引物(LoopF+LoopB)和外引物(B3+F3)按终浓度比为0:1、1:1、2:1、4:1、6:1和8:1的反应产物，外引物终浓度为0.2ymol/L。
[0046]图2为RT-LAMP反应检测条件优化结果图，其中:
[0047]A为不同温度下RT-LAMP反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000,泳道I~8依次对应反应温度为59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、64°C、65°C和66°C的产物；
[0048]B为不同反应时间下RT-LAMP反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道 I ~7 依次对应反应时间为 10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min的产物。
[0049]图3为检测本发明试剂盒特异性的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中:
[0050]泳道M为DNA Marker DL2000 ;泳道I是以JEV GZ0409-31株基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道2是以PRRSV⑶08_2株基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道3是以布鲁氏菌基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道4是以PCV-2基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道5是以PRV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道6是以CSFVGXW-07株基因组为模板的LAMP反应产物。
[0051]图4为RT-LAMP和RT-PCR的灵敏度检测结果图；其中，
[0052]A为紫外条件下钙黄绿素法对本发明提供的RT-LAMP产物检测的结果图；
[0053]B为利用本发明试剂盒得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的结果图；[0054]C为利用RT-PCR方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；
[0055]图中均为:I的模板为JEV RNA标准品(IOng/ μ L)进行10倍稀释；2的模板为JEVRNA标准品(IOng/ μ L)进行IO2倍稀释；3的模板为JEV RNA标准品(IOng/ μ L)进行IO3倍稀释；4的模板为JEV RNA标准品(IOng/ μ L)进行IO4倍稀释；5的模板为JEV RNA标准品(IOng/ μ L)进行IO5倍稀释；6的模板为JEV RNA标准品(IOng/ μ L)进行IO6倍稀释；7为阴性对照。
【具体实施方式】
[0056]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0057]以下实施例中所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Bst DNA聚合酶大片段购自New England公司；甜菜碱(Betaine)和MgSO4购自Sigma公司；Trizol、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、随机引物、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP (2.5mM)、琼脂糖购自Takara公司；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司(货号:20120420-32)。
[0058]实施例1
[0059]一、引物设计
[0060]根据LAMP引物设计原则，针对JEV E基因的保守区域序列，根据LAMP引物的设计原则，应用在线引物设计软件PrimerExporer4.0进行LAMP引物设计。同时应用Larsergene7.0生物软件的PrimerSelect工具对引物进行初步筛选,保证各引物对之间产生的二聚体较少。通过初步筛选得到理论值最优的三套引物，如表1所示(此时，未进行Biotin和FITC标记)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成IOpmol/μ L溶液，_20°C避光保存。对这三套引物分别进行反应温度优化后，在各自最优反应温度下进行反应时间的优化，并对三套引物的反应时间优化结果进行比较，反应体系如表2所示，引物使用各套引物中相对应的引物。第一套引物的最优反应温度为61°C，反应60min产物量即可达到最高。第二套引物的最优反应温度为61°C，反应时间为80min才有产物形成。第三套引物的最优反应温度为62°C，反应为80min才有产物形成。通过筛选，得到反应时间最短的第一套引物(如表1所示)，包括I对外部引物(F3和B3)、I对内部引物(FIP和BIP)和I对环引物(LoopF和LoopB)。FIP由Flc (Fl的互补序列)和F2序列组成；BIP由Blc和B2 (B2c的互补序列)组成。由上海生工生物工程技术服务有限公司分别对第一套引物中的FIP引物和LoopF引物的5’端进行Biotin (生物素)标记，再分别对BIP引物和LoopB引物的5’端进行FITC (异硫氰酸荧光素)标记。对FIP和BIP引物标记组以及LoopF和LoopB引物标记组分别进行RT-LAMP的空白样品试验，产物用核酸试纸条进行检测。结果发现LoopF和LoopB引物标记组的空白样品核酸试纸条检测呈阳性，FIP和BIP引物标的空白样品核酸试纸条检测呈阳性，所以再尝试选用FIP引物的5’端进行Biotin (生物素)标记，LoopF引物5’端进行FITC (异硫氰酸荧光素)标记，结果显示此标记组的空白样品核酸试纸条检测呈阴性，故选择此标记方式为最佳标记方式(如表1所示)。[0061]表1
【权利要求】
1.一种检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于包含如下引物组和核酸检测试纸条: 所述的引物组的核苷酸序列如下所示:
F3:5， -CGGCATGGAGAAACAGAGAA-3，；
B3:5 ’ -CCTTCAGAGCCAGTTTGTCC-3，；
FIP:5’ -Biotin-CCTGCCAACGCTTGATGGAGGGAAGAGGCACATGCCACAA-3’ ；
BIP:5’ -AGCCATCGTGGTGGAGTACTCGAGCCTGCATTTCAGGTGAC-3’ ；
LoopF:5’ -FITC-GACCCAAGAGCTACGACAGACTGTT-3’ ；
LoopB:5’ -GCTCGGTGAAGTTGACATCAG-3’。
2.根据权利要求1所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。
3.根据权利要求2所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置和权利要求1所述的引物组；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。
4.根据权利要求1所 述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:还包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱溶液和AMV逆转录酶。
5.根据权利要求4所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于:包含浓度为5υ/μ L的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为lOmol/L的甜菜碱溶液、浓度为IOOmmoI/L的MgSO4溶液、浓度为10ymol/L的引物FIP、浓度为10ymol/L的引物BIP、浓度为ΙΟμπιοΙ/L的引物F3、浓度为ΙΟμπιοΙ/L的引物B3、浓度为ΙΟμπιοΙ/L的引物LoopF和浓度为10 μ mol/L的引物LoopB。
6.权利要求1~5任一项所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于包含以下步骤: (1)配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为105U/L、10倍反应缓冲液为I倍、链置换DNA聚合酶为0.32U/L、dNTP混合物为0.4~0.6mmol/L、甜菜碱为O~2mol/L、MgS04 为 O ~3mmol/L、FIP 引物为 1.6 μ mol/L、BIP 引物为 1.6ymol/L、F3 引物为0.2 μ mol/L、B3 引物为 0.2 μ mol/L> LoopF 引物为 0.8 μ mol/L> LoopB 引物为 0.8 μ mol/L,待测样品RNA为12ng/ u L ;恒温反应； (2)反应:将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，IOmin观察结果； (3)结果判读:直接肉眼判读； ①阴性:仅在质控区出现一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有日本乙型脑炎病毒感染； ②阳性:出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为日本乙型脑炎病毒感染； ③无效:质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。
7.根据权利要求6所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于: 步骤(1)中所述的dNTP混合物的终浓度为0.4mmol/L ； 步骤(1)中所述的甜菜碱的终浓度为1.5mol/L ； 步骤(1)中所述的MgSO4的终浓度为2mmol/L ； 步骤(2)中所述的恒温反应的时间为50~70min。
8.根据权利要求6所述的检测日本乙型脑炎病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于: 步骤(2)中 所述的恒温反应的条件为61°C反应60min。
【文档编号】C12Q1/68GK103695561SQ201310628630
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】陈金顶, 毛晶丹, 邓洁汝, 勾红潮, 裴晶晶, 姚俊庸, 叶佐东 申请人:华南农业大学