一种人肺腺癌多药耐药细胞株、其制备方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种人肺腺癌多药耐药细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年11月26日，保藏编号为CGMCC?No.8510。本发明的人肺腺癌多药耐药细胞株对白蛋白结合型紫杉醇和其它多种化疗药物如紫杉醇、多烯紫杉醇及阿霉素均具有明显耐药性，对白蛋白结合型紫杉醇的耐药指数达100以上；可用于构建体内、外肿瘤耐药模型，从而深入研究多药耐药机制，甚至发现其他新的耐药机制，并进一步筛选新的抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更加有效的肿瘤治疗方法，具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
【专利说明】一种人肺腺癌多药耐药细胞株、其制备方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种人肺腺癌多药耐药细胞株、其制备方法及用途。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一，其死亡率仅次于心脑血管疾病。其中肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，己成为人类因癌症死亡的主要原因。肺癌按组织病理学分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌最常见的一种病理类型,约占原发性肺癌的70%-80%，其总的5年生存率为8%-11%。大多数肺癌患者就诊时属中晚期，已错过了手术治疗的机会；即使成功进行了肺癌根治术，术后患者仍面临着复发的可能，此时化疗成为治疗的主要手段。然而，原发或继发耐药性的发生，常常导致肺癌化疗的失败，给临床治疗带来极大的困扰。据美国癌症协会调查:90%以上的肿瘤患者的死亡在不同程度上与肿瘤耐药性的产生有关。因此，进一步研究肿瘤细胞的耐药机制，提高肿瘤对化疗药物的敏感性，已成为肿瘤治疗亟待解决的问题，亦是目前肿瘤研究的难点及热点领域。
[0003]近年来，肿瘤耐药细胞株已经成为研究耐药机制的重要工具，已有大量的研究利用它来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等。因此，建立肿瘤耐药细胞株具有重要应用价值。
[0004]肿瘤耐药细胞株的建立主要有基因转染法和药物筛选法，前者所建立的耐药细胞株耐药机制较为单一，适用于药物靶点的筛选研究；药物筛选法是进行体外药物筛选肿瘤细胞多药耐药模型的常用方法，具体分为两种，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击间断给药法。国内外均有研究对这两种方法进行了比较，认为不同诱导方式可能获得不同耐药机理的耐药细胞`株，同时也可能影响肿瘤细胞耐药程度，持续诱导比冲击诱导更易产生耐药性。持续诱导法以肿瘤细胞最终能在特定浓度化疗药物中稳定生长作为诱导成功的判定标准，细胞耐药性稳定、直观。
[0005]白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)是美国FDA批准用于转移性乳腺癌治疗的注射用紫杉醇，是全球首个获批的无溶剂型紫杉类化疗药物，通过利用肿瘤摄取营养的生物机制和纳米微粒白蛋白结合技术平台，使药物高浓度地聚集在肿瘤组织内并发挥高效抗肿瘤作用。在2012年，美国FDA又批准Abraxane用于治疗非小细胞肺癌，因此有必要建立肺癌对Abraxane的耐药细胞株。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提出一种人肺腺癌多药耐药细胞株、其制备方法及用途；本发明的人肺腺癌多药耐药细胞株除对白蛋白结合型紫杉醇(Abr axane )耐药外,对其它化疗药物如紫杉醇(PTX)、多烯紫杉醇(DTX)、阿霉素(DOX)等有明显的交叉耐药；其对Abraxane的耐药指数为100以上，可用于构建体内、外肿瘤耐药模型，以及用于筛选新的抗肿瘤药物。
[0007]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]第一方面，本发明提供了一种人肺腺癌多药耐药细胞株(简称A549/Abr)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年11月26日，保藏编号为CGMCC N0.8510。
[0009]对本发明所述人肺腺癌多药耐药细胞株进行形态学观察及生物特性鉴定发现，与普通人肺腺癌细胞株A549相比，本发明所述人肺腺癌多药耐药细胞株具有以下不同:细胞较小，形态不规则，多核细胞更常见；生长速度明显减慢。
[0010]本发明所述人肺腺癌多药耐药细胞株对白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、紫杉醇、多烯紫杉醇以及阿霉素均具有明显的耐药性。检测发现，所述人肺腺癌多药耐药细胞株除对Abraxane耐药外，对其他化疗药物如紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素有明显的交叉耐药。
[0011]本发明所述人肺腺癌多药耐药细胞株对Abraxane的耐药指数(RI)为100以上。在本发明的【具体实施方式】中，所述人肺腺癌多药耐药细胞株对Abraxane的耐药指数为118.76。
[0012]第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述人肺腺癌多药耐药细胞株的制备方法，该制备方法包括如下步骤:
[0013](I)将人肺腺癌细胞株A549在生长培养基中培养至对数生长期，加入白蛋白结合型紫杉醇至紫杉醇有效浓度为IOnM ；
[0014](2)逐步增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度，维持药物浓度至细胞能在该浓度稳定生长、传代；
[0015](3)重复步骤(2)，直到获得能`在紫杉醇有效浓度为400nM的含白蛋白结合型紫杉醇的培养基中稳定生长、传代及复苏的人肺腺癌细胞株，即为所述人肺腺癌多药耐药细胞株。
[0016]上述制备方法中，优选地，步骤(1)中，所述生长培养基为含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基；
[0017]优选地，所述培养为在37°C、CO2浓度为5%的环境中培养。
[0018]优选地，步骤(2)中，所述逐步增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度的过程为:
[0019]早期，以每次增加IOnM紫杉醇有效浓度的方式，增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度；待紫杉醇有效浓度增加至IOOnM时，以每次增加20nM紫杉醇有效浓度的方式，增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度；待紫杉醇有效浓度增加至200nM时，以每次增加40nM紫杉醇有效浓度的方式，增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度。
[0020]具体地，本发明的人肺腺癌多药耐药细胞株是按以下步骤建立的:
[0021](I)人肺腺癌细胞株A549，复苏后用含10%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100 μ g/mL的DMEM培养基于37°C、CO2浓度为5%的环境中培养；
[0022](2)取对数生长期A549细胞，换新鲜培养液，加入Abraxane，使其作用浓度(即紫杉醇有效浓度，下同)为ΙΟηΜ，在37°C、5%C02条件下继续培养，适时换液，维持IOnM药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
[0023](3)适当增加Abraxane的作用浓度,在37°C、5%C02条件下继续培养,适时换液,维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；[0024](4)重复步骤(3)直到获得能在400nM Abraxane中稳定生长、传代及复苏的细胞株，即为所述人肺腺癌多药耐药细胞株。
[0025]在诱导过程中，掌握适当的Abraxane浓度增加幅度是非常重要的，理想状况是既能通过增加药物浓度筛选出少数耐药细胞又不至于使全部细胞死亡，从而不断获得耐药性增强的A549细胞。
[0026]发明人通过大量地探索发现，采用早期每阶段增加ΙΟηΜ，待药物作用浓度增加到IOOnM每阶段增加20nM，待药物作用浓度增加到200nM每阶段增加40nM的方案取得了较好的效果，并历时6个月建立了本发明的人肺腺癌多药耐药细胞株。
[0027]第三方面，本发明提供了如第一方面所述人肺腺癌多药耐药细胞株在构建体内、外肿瘤耐药模型中的用途。所构建的耐药肿瘤模型可用于以下相关研究:研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更加有效的肿瘤治疗方法等。
[0028]第四方面，本发明提供了如第一方面所述人肺腺癌多药耐药细胞株在筛选新的抗肿瘤药物中的用途。
[0029]第五方面，本发明提供了如第一方面所述人肺腺癌多药耐药细胞株在开发肿瘤耐药逆转药物中的用途。
[0030]本发明发明人以人肺腺癌细胞株A549为诱导对象，采用逐步增加化疗药物Abraxane浓度、间歇作用于细胞的体外诱导法建立了本发明的人肺腺癌多药耐药细胞株。
[0031]本发明的人肺腺癌多药耐药细胞株提高了肺癌细胞对化疗药物的耐药性，能在紫杉醇有效浓度为IOOnM的含Abraxane培养基中稳定生长、传代及复苏,对Abraxane的耐药指数(RI)为118.76，除对Abraxane耐药外，对其他化疗药物如紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素有明显的交叉耐药，与敏感细胞相比P〈0.01。
[0032]本发明的人肺腺癌多药耐药细胞株可用于构建体内、外肿瘤耐药模型，从而深入研究多药耐药机制，甚至发现其他新的耐药机制，并进一步筛选新的抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更加有效的肿瘤治疗方法，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
[0033]保藏信息
[0034]保藏日期:2013年11月26日；
[0035]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称:CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101 ；
[0036]保藏编号:CGMCCN0.8510。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是普通人肺腺癌细胞株A549的显微图。
[0038]图2是本发明人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr的显微图。
[0039]图3是本发明人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr与普通人肺腺癌细胞株A549的细胞生长曲线图。
[0040]图4是普通人肺腺癌细胞株A549的细胞周期图。
[0041]图5是本发明人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr的细胞周期图。[0042]图6是本发明人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr与普通人肺腺癌细胞株A549的细胞周期分布比较图。
【具体实施方式】
[0043]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0044]本文的所有浓度数据均指紫杉醇的有效浓度。
[0045]实施例1本发明人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr的诱导建立 [0046]采用逐步增加Abraxane浓度、间歇作用的体外诱导法建立人肺腺癌多药耐药细胞株，具体步骤如下:
[0047](I)人肺腺癌细胞株A549，复苏后用DMEM培养液(含10%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100 μ g/mL)于37°C、5%C02条件下培养；
[0048](2)取对数生长期A549细胞，换新鲜培养液，加入Abraxane，使其作用浓度为ΙΟηΜ，在37°C、5%C02条件下继续培养，适时换液，维持IOnM药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
[0049](3)适当增加Abraxane的作用浓度,在37°C、5%C02条件下继续培养,适时换液,维持该药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
[0050](4)重复步骤(3)直到获得能在400nM Abraxane中稳定生长、传代及复苏的A549/Abr细胞株。
[0051]在筛选早期每阶段增加ΙΟηΜ，待药物作用浓度增加到IOOnM每阶段增加20nM，待药物作用浓度增加到200nM每阶段增加40nM，历时6个月建立了本发明人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr。
[0052]当细胞依次对10nM、50nM、100nM、160nM、240nM、280nM、320nM、360nM、400nM
Abraxane稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由20%胎牛血清、10%DMS0、70%DMEM培养液组成，冻存过程采用细胞冻存盒达到使细胞从室温梯度降温至-80°C的目的，最后放置液氮中长期保存。冻存细胞的复苏按以下程序进行:在直径为IOcm的培养皿中加入IOmL含10%胎牛血清的培养液，在15mL离心管中加入4mL含10%胎牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37°C水浴轻轻摇动使冻存细胞在Imin内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的细胞悬液移入已加了培养液的离心管中，立即混匀拧紧管口，1000r/min离心4min ;去上清，用2mL培养液混悬沉淀细胞，最后将细胞悬液加至已有培养液的培养皿中，吸管混匀后平放入培养箱中，在37°C、5%C02条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液继续培养。
[0053]实施例2对已建立的人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr进行形态学观察及生物学特性鉴定:
[0054]1.形态学观察
[0055]取对数生长期的人肺腺癌细胞株A549和本发明人肺腺癌多药耐药细胞株A549/Abr，于倒置显微镜下观察活细胞形态，结果分别如图1、图2所示。
[0056]图1显示:A549细胞呈长梭形，形态较一致，细胞内结构均匀；
[0057]图2显示:A549/Abr细胞变小，形态不规则，细胞易堆积成团。
[0058]2.细胞生长曲线和群体倍增时间(Td)的测定(MTT法)[0059]取对数生长期A549、A549/Abr细胞，用胰酶消化，制成单细胞悬液，并调整细胞密度。每种细胞均以2000个/孔种于96孔板，设置6个复孔。同时接种7块96孔板，置于37°C、5%C02培养箱中分别培养ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d ;将96孔板进行MTT染色，每孔加入10 μ L MTT (5mg/mL)，在培养箱继续培养4h ;弃去培养基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，摇床上低速震荡IOmin ； λ =570nm，酶标仪读出每孔的OD值，以时间为横坐标、OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。A549、A549/Abr的细胞生长曲线见图3。
[0060]经检测计算，A549细胞的 Td 为 49.56h, A549/Abr 细胞的 Td 为 54.65h ；A549/Abr细胞较A549细胞的群体倍增时间延长了 5.09h，增加了 1.10倍。
[0061]实施例3PI染色法检测细胞周期
[0062]用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2 X IO5个/mL，接种于6孔板，培养24h ；0.25%胰酶消化，收取细胞；用4°C预冷的PBS洗涤细胞3次，加入4°C预冷的70%乙醇，于-20°C固定30min以上；2000r/min室温离心5min，用预冷的PBS洗涤细胞1_2次，加入ImL PBS (含50 μ g/mL PI, 100 μ g/mLRNase Α)重悬细胞，4°C避光孵育30min ;用流式细胞仪检测，激发波长为488nm，接收波长为600nm。A549细胞和A549/Abr细胞的细胞周期图分别见图4和图5。
[0063]图4和图5的结果显示，A549细胞的G0/G1期、S期、G2/M期细胞百分数分别为83.58%,6.28%、9.62%，A549/Abr 细胞的 G0/G1 期、S 期、G2/M 期细胞百分数分别为 76.01%、
9.85%、12.22%。
[0064]因此，与A549细胞相比，A549/Abr细胞的G0/G1期细胞数减少，S期、G2/M期细胞数增多，两种细胞周期分布量化比较图如图6所示。
`[0065]实施例4药物敏感试验
[0066]将A549/Abr细胞消化、计数，配制成3X104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 μ L细胞悬液(每孔3 X IO3个细胞)；96孔细胞培养板置于37°C、5%C02培养箱中培养24h ;用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100 μ L相应的含药培养基；继续将96孔细胞培养板置于37°C、5%C02培养箱中培养48h ;将96孔板进行MTT染色，每孔加入10 μ L MTT (5mg/mL)，在培养箱继续培养4h ;弃去培养基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，摇床上低速震荡IOmin ； λ =570nm，酶标仪读出每孔的OD值；计算各组别抑制率及药物IC50。试验结果参见表1。
[0067]根据表1的结果可以看出，A549/Abr细胞对白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、紫杉醇(PTX)、多烯紫杉醇(DTX)、阿霉素(DOX)都有明显的耐药性，耐药指数分别是118.79、164.88,270.27,2.99，对顺钼(CDDP)和氟尿嘧啶(5-FU)没有耐药性。
[0068]表1细胞株对各种化疗药物的IC50和耐药指数
[0069]
化疗药物|IC50(A549) |IC50(A549/Abr)~[--
Abraxane(nM) 11.071314.66118.79
PTX(nM)8.571412.44164.88
【权利要求】
1.一种人肺腺癌多药耐药细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年11月26日，保藏编号为CGMCC N0.8510。
2.根据权利要求1所述的人肺腺癌多药耐药细胞株，其特征在于，所述人肺腺癌多药耐药细胞株对白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、多烯紫杉醇及阿霉素均具有耐药性。
3.根据权利要求1或2所述的人肺腺癌多药耐药细胞株，其特征在于，所述人肺腺癌多药耐药细胞株对白蛋白结合型紫杉醇的耐药指数为100以上。
4.一种如权利要求1-3任一项所述人肺腺癌多药耐药细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将人肺腺癌细胞株A549在生长培养基中培养至对数生长期，加入白蛋白结合型紫杉醇至紫杉醇有效浓度为IOnM ； (2)逐步增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度，维持药物浓度至细胞能在该浓度稳定生长、传代； (3)重复步骤(2)，直到获得能在紫杉醇有效浓度为400nM的含白蛋白结合型紫杉醇的培养基中稳定生长、传代及复苏的人肺腺癌细胞株，即为所述人肺腺癌多药耐药细胞株。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生长培养基为含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基； 优选地，所述培养为在37°C、CO2浓度为5%的环境中培养。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述逐步增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度的过程为: 早期，以每次增加IOnM紫杉醇有效浓度的方式，增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度；待紫杉醇有效浓度增加至IOOnM时，以每次增加20nM紫杉醇有效浓度的方式，增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度；待紫杉醇有效浓度增加至200nM时，以每次增加40nM紫杉醇有效浓度的方式，增加白蛋白结合型紫杉醇的浓度。
7.如权利要求1-3任一项所述人肺腺癌多药耐药细胞株在构建体内、外肿瘤耐药模型中的用途。
8.如权利要求1-3任一项所述人肺腺癌多药耐药细胞株在筛选新的抗肿瘤药物中的用途。
9.如权利要求1-3任一项所述人肺腺癌多药耐药细胞株在开发肿瘤耐药逆转药物中的用途。
【文档编号】C12Q1/02GK103627674SQ201310627925
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】胡志远, 雷春妮 申请人:国家纳米科学中心